MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) là loại cây thân thảo được biết đến với giá trị dược liệu cao. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Thổ nhân sâm cho thấy, trong lá và rễ có rất nhiều các hợp chất có hoạt tính dược học khác nhau như: alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, phytosterol, phytol; trong đó các phytol chiếm tỷ lệ cao (69,32 %). Từ lâu, Thổ nhân sâm đã được sử dụng trong y học cổ truyền, đặc biệt là trong điều trị bệnh tiểu đường type 2, viêm da, rối loạn tiêu hóa, yếu sinh lý và rối loạn sinh sản. Galactogue trong lá có tác dụng chống viêm, kích thích tăng tiết sữa ở phụ nữ cho con bú và có khả năng chữa bệnh viêm loét. Rễ của cây Thổ nhân sâm được sử dụng để thúc đẩy khả năng sinh sản và chữa các bệnh phụ khoa như bất thường trong chu kỳ kinh nguyệt... Steroid saponin trong rễ cây Thổ nhân sâm có tác dụng phòng và chữa bệnh xơ vỡ động mạch, đồng thời còn là nguyên liệu để tổng hợp nên hormone sinh dục. Flavonoid là một hợp chất có vai trò quan trọng đối với con người như có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư… Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu về thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm vì hàm lượng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum, trong đó có cây Thổ nhân sâm rất thấp. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để nâng cao hàm lượng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum nói chung và cây Thổ nhân sâm (T. paniculatum) nói riêng để có thể sử dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Cho đến nay, đã có một số cách tiếp cận chủ yếu được áp dụng đối với cây dược liệu để làm tăng hàm lượng flavonoid. Đó là sử dụng phương pháp chọn lọc từ quần thể hoặc lai hữu tính hay đột biến thực nghiệm, từ đó chọn lọc các dòng cây có hàm lượng flavonoid cao. Tuy nhiên, đối với cây Thổ nhân sâm chưa thấy công bố nào về ứng dụng phương pháp này để nâng cao hàm lượng flavonoid; nhưng việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật như chuyển gen và nuôi cấy mô tế bào thực vật ở cây dược liệu đã được quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong thu nhận các dược chất, trong đó có flavonoid. Ở thực vật, flavonoid được tổng hợp qua đường phenylpropanoid, chuyển phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA và sau đó 4-coumaroyl-CoA sẽ đi vào quá trình tổng hợp flavonoid. Có rất nhiều các enzyme tham gia vào con đường tổng hợp flavonoid như phenylalanine ammonia-lyase, cinnamate 4-hydroxylase, 4-Coumarate CoA ligase, chalcone synthase, chalcone isomerase… Trong đó, chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid bằng việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở được đóng vòng để hình thành các naringenin. Sau đó, hợp chất này sẽ được chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid chính như flavanone, flavonol và anthocyanin. Do vậy, biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CHI sẽ làm tăng hoạt độ của enzyme chìa khóa CHI và hàm lượng các loại flavonoid trong cây chuyển gen sẽ được cải thiện. Ngoài ra, Thổ nhân sâm là loài cây có rễ củ, nhiều hợp chất thứ cấp được tập trung ở rễ, trong đó có flavonoid. Do vậy, để tăng thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm, cách tiếp cận ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật bằng phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ nhằm tăng sinh khối cũng được quan tâm nghiên cứu. Khi mô thực vật (lá, đoạn thân, lá mầm...) bị lây nhiễm Agrobacterium rhizogenes thì T-DNA trong cấu trúc Ri-plasmid mang các gen rol và các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin loại IAA sẽ được chuyển vào mô thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của các gen rol và các gen tổng hợp auxin sẽ tạo nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật được lây nhiễm A. rhizogenes. Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được dòng cây chuyển gen GmCHI có hàm lượng flavonoid cao hơn cây đối chứng không chuyển gen và xác định được điều kiện thích hợp trong cảm ứng tạo rễ tơ in vitro ở cây Thổ nhân sâm.
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM 1.1.1 Cây Thổ nhân sâm 1.1.2 Nghiên cứu định danh Thổ nhân sâm 1.1.3 Tái sinh in vitro Thổ nhân sâm .9 1.1.4 Nuôi cấy rễ tơ Thổ nhân sâm .15 1.2 FLAVONOID VÀ CON ĐƯỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở THỰC VẬT 22 1.2.1 Flavonoid .22 1.2.2 Con đường tổng hợp flavonoid thực vật .28 1.3 ENZYME CHI VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHI 33 1.3.1 Enzyme CHI 33 1.3.2 Gen CHI 37 1.3.3 Nghiên cứu biểu gen CHI 39 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .42 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 42 2.1.1 Vật liệu thực vật .42 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector 43 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .43 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 43 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 45 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.3.1 Phương pháp định danh mẫu Thổ nhân sâm 46 2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy in vitro 47 2.3.3 Phương pháp chuyển gen GmCHI Thổ nhân sâm 51 2.3.4 Phương pháp phân tích chuyển gen 53 2.3.5 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 57 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM .58 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phương 58 3.1.2 Đặc điểm trình tự nucleotide vùng ITS đoạn gen matK 60 3.1.3 Thảo luận kết định danh mẫu Thổ nhân sâm tự nhiên 66 3.2 TẠO DÒNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI .67 3.2.1 Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen Thổ nhân sâm 67 3.2.2 Kết chuyển gen GmCHI tạo Thổ nhân sâm chuyển gen .76 3.2.3 Kết phân tích Thổ nhân sâm chuyển gen 80 3.2.4 Thảo luận kết tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen GmCHI 86 3.3 TẠO DÒNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 89 3.3.1 Kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 89 3.3.2 Thảo luận kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 Kết luận .99 Đề nghị 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 PHỤ LỤC 118 DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt AS BAP bp CCM cDNA CHI C4H CHS 4CL cs CTAB Tiếng Anh Acetosyringone Benzylaminopurine base pairs Co-cultivation medium Complementary Chalcone isomerase Cinnamate 4-hydroxylase Chalcone synthase 4-Coumarate CoA ligase Nghĩa tiếng Việt Cặp bazơ nitơ Môi trường đồng nuôi cấy DNA bổ sung Cộng Cetyltrimethyl ammonium 2,4 D bromide 2,4-Dichlorophenoxyacetic DFR acid Dihydroxyflavonol 4- DNA dNTP reductase Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside FAP F3H ELISA triphosphate Fatty-acid-binding proteins Flavanone-3-hydroxylase Enzyme-linked FLS FNS II GA3 GM GmCHI immunosorbentassay Flavonol synthase Flavone synthase II Gibberellic acid Germination medium Glycine max chalcone IAA IBA IFS ITS Kb kDa LB isomerase Idole acetic acid Idolbutylic acid Isoflavone synthase Internal transcribed spacers Kilo base Kilo Dalton Luria Bertani Xét nghiệm ELISA Axit gibberellic Môi trường nảy mầm Axit idole acetic Axit idolbutylic Môi trường dinh dưỡng ni cấy vi khuẩn Kí hiệu, viết tắt LDOX Tiếng Anh Leucoanthocyanidin L-Tyr mRNA MS oxygenase L-tyrosine Messenger ribonucleic acid Murashige Skoog, 1962 NAA OD Ori PAL PCR Ri-plasmid RM RNA Rol rpm scFv Naphthaleneacetic acid Optical density Origin Phenylalanine ammonia- lyase Polymerase chain reaction Root inducing- plasmid Rooting medium Ribonucleic acid Root locus Revolutions per minute Single-chain variable SDS SEM SIM Taq DNA fragment Sodium dodecyl sulfate Shoot elongation medium Shoot induction medium Thermus aquaticus DNA polymerase T-DNA polymerase Transfer DNA Nghĩa tiếng Việt Axit amin L-tyrosine RNA thông tin Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật Axit naphthaleneacetic Mật độ quang Điểm khởi đầu chép Phản ứng chuỗi trùng hợp Môi trường tạo rễ Axit ribonucleic Gen rol Số vòng/ phút Mơi trường kéo dài chồi Mơi trường cảm ứng tạo chồi Đoạn DNA chuyển vào thực vật TDZ Ti-plasmid T0, T1 T0 Thidiazuron Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u Các hệ chuyển gen Cây chuyển gen tái sinh từ T1 chồi ống nghiệm Hạt chuyển gen T0 TL-DNA Transfer left -DNA nảy mầm thành T1 Vùng biên trái đoạn DNA TR-DNA Transfer right -DNA chuyển vào thực vật Vùng biên phải đoạn DNA UV Vir vvm Ultraviolet Virus interferon resistance Volume volume minute chuyển vào thực vật Tia cực tím Gen vir Thể tích khí/thể tích chất Kí hiệu, viết tắt WPM Tiếng Anh Woody plant medium WT X-gal Wild type 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ZT β-D-galacto-pyranoside Zeatin Nghĩa tiếng Việt lỏng/ phút Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy thân gỗ Cây không chuyển gen DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thống kê trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 444 Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số EU4103572 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số AY0152744 Bảng 3.3 Ảnh hưởng javel 60 % HgCl2 0,1 % đến tỷ lệ nảy mầm hạt8 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ mầm70 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên1 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tổ hợp mg/l BAP IBA đến phát sinh, sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên3 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ Thổ nhân sâm4 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Thổ nhân sâm5 Bảng 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau lây nhiễm A tumefaciens7 Bảng 3.10 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào Thổ nhân sâm9 Bảng 3.11 Hàm lượng flavonoid tổng số hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 đối chứng không chuyển gen6 Bảng 3.12 Kết khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm90 Bảng 3.13 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen tạo rễ tơ từ mô Thổ nhân sâm2 Bảng 3.14 Xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime sau tuần3 Bảng 3.15 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm5 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Khung flavonoid 26 Hình 1.2 Khung hợp chất chalcone .27 Hình 1.3 Các dạng dị vòng C major flavonoid, isoflavonoid, neoflavonoid 27 Hình 1.4 Cấu trúc chung nhóm major flavonoid 278 Hình 1.5 Cấu trúc chung nhóm aurone 28 Hình 1.6 Con đường phenylpropanoid 31 Hình 1.7 Cấu trúc vị trí amino acid hoạt động enzyme CHI 34 Hình 1.8 Sự gắn kết 2S - naringenin với vị trí hoạt động CHI 356 Hình 1.9 Mạng lưới liên kết hydro phức hợp CHI - naringenin 367 Hình 1.10 Hình ảnh phân tử nước nằm (2S)-naringenin Tyr 106 phức hợp CHI-naringenin 377 Hình 1.11 Vị trí gen GmCHI đồ gen .389 Hình 2.1 Mẫu Thổ nhân sâm thu thành phố Thái Nguyên2 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-GmCHI3 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tổng qt5 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen GmCHI vào Thổ nhân sâm qua nách mầm Y Hình 3.1 Cây Thổ nhân sâm .599 Hình 3.2 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân vùng ITS 60 Hình 3.3 Sơ đồ vùng ITS mẫu Thổ nhân sâm 61 Hình 3.4 Sơ đồ hình thiết lập dựa trình tự nucleotide vùng ITS 62 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản kiểm tra phẩm PCR nhân đoạn gen matK 633 Hình 3.6 Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu thiết lập dựa trình tự nucleotide đoạn gen matK 655 Hình 3.7 Hạt nảy mầm sau 10 ngày ni cấy 677 Hình 3.8 Ảnh hưởng BAP, kết hợp BAP IBA đến phát sinh, sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 722 Hình 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau lây nhiễm A tumefaciens .777 Hình 3.10 Hình ảnh biếp nạp tái sinh Thổ nhân sâm chuyển gen 788 Hình 3.11 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmCHI từ Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T0 cặp mồi CHI-NcoIF/CHI- NotI-R .81 Hình 3.12 Kết phân tích Thổ nhân sâm chuyển gen lai Southern chuyển gen dương tính với PCR với đoạn dò GmCHI đánh dấu biotin .822 Hình 3.13 Kết phân tích Western blot từ dòng Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T1 đối chứng không chuyển gen 833 Hình 3.14 Kết phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp GmCHI hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen đối chứng không chuyển gen .844 Hình 3.15 Hình ảnh dòng Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T đối chứng không chuyển gen trồng vườn thực nghiệm .855 Hình 3.16 Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ Thổ nhân sâm sau tuần biến nạp 90 Hình 3.17 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen rolC đoạn gen virD2 955 Hình 3.18 Hình ảnh cảm ứng nuôi cấy rễ tơ Thổ nhân sâm 966 117 125 Yosephine S W M., Kristanti A N., Utami E S W (2015), “Optimization of culture conditions of Talinum paniculatum Gaertn adventitious roots in balloon type bubble bioreactor using aeration rate and initial inoculum density”, Asian J Biol Sci, 8, pp 83 - 92 126 Yosephine S W M., Kristanti A N., Utami E S W., Yachya A (2015), “Effect of sucrose and potassium nitrate on biomass and saponin content of Talinum paniculatum Gaertn hairy root in balloon-type bubble bioreactor”, Asian J Biol Sci, 5, pp 1027 - 1032 127 Yulia W I., Razief N (2005), “Study of phytochemistry of Java ginseng compare to Korean ginseng in: Development of animal health and production for improving the sustainability of livestock farming in the integrated agriculture system”, German institute for tropical and subtropical agriculture, pp 45 - 49, Indonesia 128 Zenn Z C., Yi C C., Yi H C., Yen L (2006), “cDNA cloning and molecular characterization of 4-Coumarate: Coenzyme A ligase in Eucalyptus camaldulensis”, Taiwan J For Sci, 21, pp 87 - 100 129 Zhang X., Wang X., An L., Fan S., Xiang W (1995), “Plant regeneration from protoplasts of Talinum paniculatum”, Acta Botanica Sinica, 37(10), pp 754760 130 Zhao J., Ma L., Liu X., Wu H (2009), “Induction of calluses and establishment of plantlet rapid propagation in Talinum paniculatum”, Journal of Southwest University of Science and Technology, 1, pp 103 - 107 131 Zhu W., Jia Q., Wang Y., Zhang Y., Xia M (2012), “The anthocyanin cyanidin3-O-β-glucoside, a flavonoid, increases hepatic glutathione synthesis and protects hepatocytes against reactive oxygen species during hyperglycemia: involvement of a cAMP-PKA-dependent signaling pathway”, Free Radical Bio Med, 52, pp 314 - 327 PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh mẫu Thổ nhân sâm thu thập số địa phương phía Bắc Việt Nam 118 TN1 TN2 HT QN BG Hình P1.1 Năm mẫu Thổ nhân sâm thu thập địa phương phía Bắc Việt Nam TN1: thành phố Thái Nguyên; TN2: huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên; QN: huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh; HT: thị xã Sơn Tây, Hà Nội; BG: huyện Tân Yên tỉnh Bắc Giang Phụ lục Kết xác định vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 119 Hình P2.1 Kết xác định vùng ITS mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.2 Kết xác định đoạn gen matK mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 120 Hình P2.3 Kết xác định đoạn gen rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.4 Kết xác định đoạn gen rpoB mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 121 Phụ lục Kết so sánh vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm với trình tự GenBank 122 Hình P3.1 Trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide vùng ITS mang mã số EU410357 loài T paniculatum GenBank 123 124 125 Hình P3.2 Trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen matK mang mã số AY015274 loài T paniculatum GenBank 126 Hình P3.3 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 mang mã số GQ436061 loài T paniculatum GenBank 127 128 Hình P3.4 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoB phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoB mang mã số MG710385 loài T paniculatum GenBank 129 Phụ lục Thành phần môi trường tái sinh Thổ nhân sâm chuyển gen Hỗn hợp Stock I (N1) Stock II (N2) Thành phần cho lít dung dịch 16,6 g CaCl2.2 H2O 95 g KNO3 + 8,5 g KH2PO4 + 82,5 g (NH4)NO3 + 18,5 g MgSO4.7H2O 1,24 g H3BO3 + 4,46g MnSO4.4H2O + mg CuSO4.7H2O Stock III (N3) + 1,72g ZnSO4.7H2O + 50 mg Na2MoO4.2H2O + 166 mg Stock IV (N4) KI + mg CoCl2.6H2O 5,56 g FeSO4.7H2O + 7,46 g Na2EDTA 20 mg Thiamine HCl + 100 mg pyridoxine HCl + 100 mg Stock V (N5) MS0 GM CCM nicotic acid + 0,4 g glycine + 20 g Myoinositol 20 ml stock I/l + 20 ml stock II/l + 5ml stock (III, IV, V)/l + g agarose MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa MS0 + 30 g/l sucrose + 100 μmol/l acetosyringon + 50 ml/l nước dừa Môi trường SIM lần 1: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l SIM kanamycine Môi trường SIM lần 2: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l SEM RM kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l IAA + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine * Ghi chú: Các môi trường chuẩn pH = 5,8 khử trùng Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 sáng/ngày LỜI CAM ĐOAN 130 Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn GS.TS Chu Hồng Mậu Các kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn nội dung số liệu trình bày luận án Thái Nguyên, ngày 12 tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Như Trang 131 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu trực tiếp hướng dẫn thường xun chia sẻ, động viên khích lệ để tơi có tự tin lòng đam mê khoa học giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Được học tập sinh hoạt chuyên môn tập thể khoa học nghiêm túc, nhận nhiều góp ý quý báu, trang bị thêm phương pháp nghiên cứu có hiểu biết sâu sắc vấn đề Sinh học đại Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, thầy cô cán phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khố học Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng tri ân người thầy, đồng nghiệp, gia đình bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn ln đồng hành tơi q trình học tập Thái Nguyên, ngày 12 tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Như Trang ... A rhizogenes Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng... PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số:... tích hợp biểu gen chuyển GmCHI Thổ nhân sâm chuyển gen; Phân tích, so sánh hàm lượng flavonoid tổng số dòng Thổ nhân sâm chuyển gen không chuyển gen (iii) Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ từ Thổ nhân