NHÂN DÒNG, ĐỌC TRÌNH TỰ VÀ BIỂU HIỆN TRONG P.pastoris MỘT cDNA XYLANASE MỚI VỪA ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ

huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com NHÂN DỊNG, C TRÌNH T VÀ BI U HI N TRONG P.pastoris M T cDNA XYLANASE M I V A C PHÂN L P T A.awamori Yinan Yang , Kuixian Shan , Lifeng Ping3 Jingmei Lu3 i H c ông B c, Tr ng Xuân, Trung Qu c i H c Nông Nghi p Cát Lâm, Tr ng Xuân, Trung Qu c Vi n Tiêu Chu n Ch t L ng Nông S n, Vi n Khoa H c Nông Nghi p Chi t Giang , Hàng Châu, Trung Qu c Ch ng SH-2016 có th sinh xylanase đ c phân l p nh n Aspergillus awamoris D a vào đ c m sinh lý hóa sinh c a chúng c ng nh k t qu phân tích trình t gen ITS rDNA T ch ng A awamori m i phân l p nhân dòng gen xylanase có kích th c 591bp trình t ORF (open reading frame) đ c d đốn mã hóa cho m t protein có 196 axit amin v i tr ng l ng kho ng 21kDa M t plasmid bi u hi n mang gen d i s ki m soát c a methanol đ c u n b i m t promotor u n gen oxidase r u (AOX1) đ c đ a vào P.pastoris gen xylanase đ c bi u hi n thành công môi tr ng s d ng methanol nh ch t c m ng Xylanase đ c tinh s ch s d ng c t NI2+-NTA Các đ c m c a xylanase ting s ch đ c kh o sát T khóa: Aspergillus awamori, cDNA, nhân dịng, xylanase, bi u hi n sinh v t nhân chu n, purification and characterization (tinh s ch phân tích) M U Xylanase glycosidases, xúc tác cho ph n ng n i th y phân liên k t 1,4- -D-xylosidic xylan Xylanase có ngu n g c t n m, vi khu n thu hút đ c nhi u s ý nh ng n m g n ti m n ng công ngh sinh h c c a chúng nhi u q trình cơng nghi p khác Chúng đ c s n xu t qui mô công nghi p ng d ng đ t y tr ng gi y công nghi p t y tr ng b t gi y (Polizeli et al.,2005) Cùng v i glucanase, pectinase, protease, amylase, phytase, Lypase, Glucanase c ng đ c s d ng r ng rãi làm bi n tính anarabinoxylans thành ph n c a th c n, kh đ nh t c a nguyên li u thô c i bi n ch t dinh d ng (Silversides et al., 2006) Trong công nghi p th c ph m, chúng đ c s d ng nh nh ng ph gia b t bánh mì cho vi c c i bi n b t nhão t o u ki n thu n l i làm t ng ch t l ng s n ph m n ng nghi p lên men, s thêm xylanase t bên trình nghi n có nh h ng quan tr ng đ n gi i quy t v n đ v arabinoxylans nh đ nh t c a c , màng đ m làm gi m t l l c (Lu et al 2005) S n xu t xylanase quy mô công nghi p d a t ng h p sinh h c nh vi sinh v t N m s i ch ng t có m t kh n ng l n ti t m t huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com l ng ng u nhiên xylanase, v i ch ng Aspergillus (Shah and Madamwar, 2005), Penicillium (Li et al., 2007a, 2007b) Tricodema (Azin et al 2007) h u h t đ c nghiên c u r ng rãi đ c ki m tra l i kh n ng sinh t ng h p xylanase Có hai môi tr ng cho nuôi c y ch ng vi sinh v t sinh xylanase: ni c y chìm nuôi c y môi tr ng r n hi n nay, 80%-90% xylanase th ng ph m đ c s n xu t b ng ni c y chìm b i chúng có kh n ng t ng c ng bi u hi n cao h n m c đ t đ ng hóa cao h n (Polizeli et al., 2005) Nhi u gen xylanase đ c nhân dòng bi u hi n E.coli ho c P.pastoris: m t s xylanase tái t h p đ c kh o sát ng d ng r ng rãi đáp ng nh ng ng d ng r ng rãi nh ng nhu c u đ c bi t c a th ng tr ng nhi u ch ng m i có th s n xu t xylanase đ c tìm ki m ho c nhân dòng bi u hi n gen xylanase v i nh ng đ c m m i tr thành nh ng h ng nóng nh ng nghiên c u v xylanase (Hessing et al., 1994; Polizeli et al., 2005) Trong báo trình bày m t gen m i mã hóa cho xylanase m i đ c phân l p t A.awamoris đ c nhân dòng bi u hi n P.pastoris X33 Sau t i u nhi t đ pH n đ nh nhi t đ tinh s ch xylanase đ c xác đ nh đ nghiên c u kh n ng ng d ng công nghi p c a chúng NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP CH NG GI NG VÀ NUÔI C Y Aspergillus sp SH-2016 đ c ch n l c t nh ng ch ng thu th p t đ a ph ng Môi tr ng nuôi c y g m có: NH4Cl, gl -1;K2SO4,1 gl -1; Na2NO3,1 gl -1;MgSO4.7H2O; CaCl2.2H2O 0,3 gl -1;yeast extract,1 gl -1 pH ban đ u đ c u ch nh đ n cho 50 ml môi tr ng vào bình tam giác (lo i 250ml) đ c v i 1ml (1x106 bào t /ml) d ch huy n phù đ c chu n b t m t ng th ch nghiêng Aspergillus sp SH-2016 nuôi 30°C l c 150 vòng/phút E.coli JM109 đ c s d ng nh t bào ch đ bi n n p vector plasmid pMD18-T-xynA pPICZaA-xynA E.coli bi n n p đ c nuôi môi tr ng LB l ng (Luria-Bertani) P.pastoris đ c s d ng nh t bào ch cho s bi u hi n c a pPICZaA-xynA P.pastoris X33 đ c bi n n p đ c nuôi môi tr ng (YPDS) ch n l c r n: cao n m men (1% v/vv), pepton 2%(w/v) dextrose (D-glucose, 2% w/v), Sorbitol 1%(w/v) Zeocin (100 mg ml-1) Môi tr ng BMGGY [5g cao n m men, 10 g peptone, 50ml KPO4 1M đ m pH=6.0, 1,7g bazo nito n m men, 5g amoni sulsunfat (NH4)2SO4, 5ml glyxerol đ c kh trùng 121°C 30 phút làm l nh xu ng đ n nhi t đ phịng, thêm vào mơi tr ng Biotin (500x1ml) Histidine huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com (96x5,2ml)] đ c s d ng đ nuôi c y P.pastoris tái t h p ch a xylanase Môi tr ng BMMY [5g cao n m men, 10g peptone, 50ml KPO4 1M đ m pH6.0, 1,7g base nit n m men 5g amoni sunfat (NH3)2SO4 đ c h p kh trùng 121°C 30 phút, đ ngu i xu ng đ n nhi t đ phịng thêm vào mơi tr ng 2,4ml methanol, Biotin (500x1ml) Histidin (96x5,2ml) đ c s d ng cho c m ng bi u hi n xylanase P.pastoris PHÂN L P CH NG S N XU T XYLANASE Các ch ng khác bao g m Aspergillus sp SH-2016 đ c phân l p t m u đ t, ph ng th c phân l p chi ti t th c hi n theo ph ng pháp đ c Abrusci mô t (Abrusci et al 2005) XÁC NH CH NG Aspergillus sp, SH-2016 Xác đ nh ch ng d a vào phân tích đ c m hình thái chu n, phân tích trình t nucleotide ITS rDNA mã hóa cho enzyme đ c khuy ch đ i, vùng ITS (internal transcribed spacer) bao g m 5.8 S rDNA Phân tích đ c m hình thái c a ch ng ni c y b ng quan sát m t kính hi n vi quang h c m t kính hi n vi n t quét Phân tích trình t , DNA nhi m s c th đ c phân l p theo ph ng pháp Doyle(1987) S khuy ch đ i đ c th c hi n v i m i thi t k pITS1 (5’TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’) pITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) máy chu trình nhi t (máy PCR) (Bio-Rad, USA) d i u ki n cho phép: 95°C, phút; 35 chu k 95°C, 30 giây; 53°C, 30 giây; 72°C, phút cu i gi 10 phút 72°C M i ph n ng PCR l y 5µl s n ph m đem ki m tra b ng n di gel agarose 1% 70V gi m TAE [0,4 M tris; 50mM NaOAc (natrioxaloaxetac); 10mM EDTA; pH=7,8] đ c quan sát tia UV sau nhu m ethidiumbromide (0,5µg/ml) s n ph m PCR đ c n i v i vector pMD18-T (Takara-Nh t B n) theo ph ng pháp Liu Sun (2004) Vector thi t k đ c chuy n vào t bào E.coli kh bi n theo ph ng pháp Chung (Chung et al., 1989) Sau c y tr i mơi tr ng LB có ch a Xgal (5bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactosidase), IPTG (isopropyl-1-thio- -Dgalactoside) ampicillin (50µg/ml) ti p theo, ch ng mà chuy n thành công đ c g i E.coli JM109/pMD18-T-ITS DNA ITS đ c đ c trình t b ng c hai b kits [ Trình t nh n đ c kh o sát so sánh v i trình t c s d li u ngân hàng gen (Genbanks) s d ng ch ng trình BLAST Phân tích trình t đ c th c hi n nh s d ng ch ng trình SEQBOOT, huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com NEIGHBOR-JOIN DNASENSE c a Philips (phiên b n 3.572) sau đ c s d ng đ thành l p quan h di truy n Xác minh h th ng d li u Microseq so sánh v i trình t khác th ng đ c s d ng h th ng DDJB/EMBL/GenBank CHU N B RNA T NG S C A Aspergillus sp SH-2016 Các t bào thu nh n đ c thông qua l c, đ c r a hai l n v i đ m mu i phosphate (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4.7H2O, 1.4 mM KH2PO4 pH=7.3) Sau đó, làm l nh nit l ng, ground chuy n vào m t ng nghi m s ch ch a đ m ly gi i (6 M guanidinium hydrochloride, 37.7 M axit xitric, 0.75 M N-lauroyl sarcosine sodium, 0.15 M -sulfhydryl ethanol), acid guanidium phenol chlorofol theo ph ng pháp c a Chomozynsky Sachi (1987) đ c s d ng đ phân l p RNA t ng s t Aspergillus sp.SH-2016 poly (A+) RNA đ c ch n l c t RNA t ng s b ng cách s d ng oligo-dT30 (Promega, Madison, USA) T NG H P cDNA KHU CH I PCR M ch cDNA đ u tiên đ c t ng h p nh RT-PCR v i olio(dT)15 s d ng mRNA đ c phân l p t Aspergillus sp.SH-2016 theo manufacture’s procol (Clontech, mountain view, CA, USA) cDNA c a Aspergillus sp.SH2016 mã hóa cho xylanase đ c khu ch đ i nh đ u 3’ race(Rapid application of cDNA ends) v i m i 5’-GCTCCTGTGCCGGAACCTG-3’ oligo(dT)15 đ c thi t k d a trình t c a đ u t n –NH2 cDNA mã hóa cho xylanase đ c công b ngân hàng gen qu c t (NCBI) Và c u trúc c a mRNA m ch cDNA th nh t đ u l n l t đ c s d ng nh m ch khuân PCR đ c th c hi n 50µl s d ng máy chu trình nhi t (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) S n ph m PCR đ c quan sát gel sau nhu m ethidium bromide 1.5% k t qu đo n DNA đ c n i v i pMD18-T(takaru, Otsu, Shiga, Nh t B n) nh s d ng ph ng pháp nhân dòng T/A vector thi t k đ c chuy n vào t bào E.coli kh bi n theo ph ng pháp c a Chung (Chung et al.,1989) sau c y tr i mơi tr ng LB có ch a X-gal, IPTG ampicillin (50µgml -1) Tieepstheo, ch ng d ng tính, đ c nh n E.coli JM109/pMD18-TxynA đ c thu nh n DNA đ c đ c trình t Trình t đ c thu nh n đ c phân tích nh s d ng ph n m n DNAMEN (b n 4.0 Lynnon, Biosoft, CANADA) sau đ c kh o sát so sánh v i trình t c s d li u c a ngân hàng gen s d ng ch ng trình BLAST huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com THI T K XYLANASE VECTOR BI U HI N C A cDNA MÃ HÓA CHO guanidinium hydrochloride o n ORF c a xylanase đ c thu nh n nh s d ng DNA polymerase ch u nhi t (Takara, Otsu, Shiga, Nh t B n) v i s có m t c a m i 5’ATTGAATTCGCACCTGTTCCTGAGCCTG-3’ (có v trí nh n bi t c a E.coR I) 5’GGTCTCGAGTGATGAAATTGTAACGGAG-3’(có v trí nh n bi t c a Xhol) đ c thi t k theo trình t c a vector pMD18-T-xynA S n ph m PCR vector pPICZaA (Novogen, New Canaan, CT, USA) đ c s lý v i enzyme gi i h n E.coR I Xhol, thu h i l i nh n di gel agarose sau đ c n i l i nh T4-DNA ligase Plasmid pPICZaA n i đ c bi n n p vào E.coli JM109.ch n l c nh ng khu n l c đ n chuy n sang mơi tr ng LB l ng(3ml) v i 100µg ampicillin qua đêm 37°C l c m nh 200 vòng/phút Gi ng nuôi c y đ c s d ng đ tách plasmid môi tr ng ki m y u (Sambrock et al.,2001) Plasmid đ c s lý v i E.coR I Xhol v i m c đích nh n bi t plamid tái t h p đ c tái t h p thành công Sau m t plasmid mang đo n gen cDNA (pPICZaA-xynA) đ c thu đ c, plasmid tái t h p đ c t o dòng chuy n vào P.pastoris X33 nh t o l b ng n (electroporation), ch ng bi n n p đ c ch n l c môi tr ng YPDS THAO TÁC DNA BI N N P Thao tác DNA, phân l p plasmid, n di gel agarose đ th c hi n theo Sambrock (Sambrock et al.,2001) Bi n n p vào E.coli đ th c hi n theo Chung (Chung et al.,1989) c c TINH S CH BI U HI N PROTEIN T t c b c tinh s ch đ c th c hi n 4°C Môi khu n l c đ n đ c ch n l a chuy n vào 5ml BMGY tr c nuôi c y, đ c qua đêm 30°C Sau đó, ly tâm 6000 vòng 10 phút Các t bào đ c chuy n vào môi tr ng BMMY 25ml v a cho c m ng bi u hi n (for d) thêm vào mơi tr ng 250µl methanol, l n m t ngày Sau bi u hi n, d ch lên men l ng đ c ly tâm 8000 vòng/10 phút 4°C Ph n d ch n i có ch a protein xylanase thơ đ c chuy n vào c t NI2+-NTA Ph ng pháp r a c t đ c th c hi n theo h ng d n c a nhà s n xu t Protein tinh s ch đ c b o qu n -80°C tr c n di SDS-PAGE phân tích đ c m hóa sinh N ng đ protein đ c th c hi n theo ph ng pháp Bradford (Bradford, 1976) s d ng abumin huy t bò làm chu n huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com CÁC PHÂN TÍCH HO H XYLANASE Ho t đ xylanase đ c xác đ nh b ng cách đo l ng đ ng kh đ c gi i phóng t th y phân xylan lúa mì, y n m ch (1% w/v) s d ng ph ng pháp axit dinitrosalisilic (Miller,1959) H n h p ph n ng g m có 1ml dung d ch hịa tan xylan lúa mì y n m ch 1% đ m nitrate 50mM, pH=5 thêm vào 1ml enzyme tinh s ch d ng l ng; 50°C 30 phút M t đ n v xylanase đ c đ nh ngh a l ng enzyme c n thi t đ phân gi i 1µmol xylose t xylan vịng m t phút d i u ki n phòng thí nghi m NG KÝ TRÌNH T Trình t nucleotide đ EU846238 EU846238 c đ ng ký ngân hàng gen v i mã s K T QU NH N BI T CH NG Aspergillus sp.SH-2016 SINH XYLANASE Nh n bi t ch ng Aspergillus sp.SH-2016 c s phân tích chi ti t đ c m hình thái sinh lý trình t gen ITS rDNA (gen có mã s đ ng ký ngân hàng: EU846237) K t qu phân tích ch r ng ch ng gi ng v i ch ng A.awamori (t ng đ ng, 99%/582bps, d a ITS rDNA ///theo phân tích đ c m hình thái sinh lý c ng nh so sánh trình t gen ITS rDNA th y r ng ch ng Asperrgillus sp.SH-2016 r t gi ng v i ch ng Aspergillus awamori nên đ t tên Aspergillus awamori SH-2016 RT-PCR KHU CH I cDNA S n ph m đ c khu ch đ i v i m i 5’GCTCCTGTGCCGGAACCTG-3’ oligo(dT)15 đ c dùng n di gel agarose Các đo n đ c khôi ph c n i v i plasmid pMD18-TxynA đ c chuy n vào t bào E.coli JM109 kh bi n m t s dịng d ng tính (khu n l c không màu) đ c thu nh n ba dịng s đ c thu nh n đ chu n b m ch đ n cho đ c trình t K t qu thu đ c m t trình t kho n 1.6 kb Phân tích trình t s d ng ph n m n DNAMEN (phiên b n 4.0, Lynnon Biosoft, CANADA) ch r ng đo n đ c khu ch đ i ch a m t khung đ c m đ y đ g m 591bp mã hóa cho 196 axit amin So sánh trình t t ng đ ng th y r ng trình t gi ng v i m t s gen xylanase đ c công b (X78115,D14848) Aligment result also suggested that the part or cDNA not containing the upstream sequence has been obtained Tuy huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com nhiên v m t khách quan nhân dịng đ c gen cDNA c u trúc mã hóa cho xylanase Ph ng pháp d dàng h n r ti n h n thi t k th vi n cDNA Ti p theo, c p m i v i m nh n bi t c a E.coR I Xhol l n l t đ c thi t k khu ch đ i PCR đ c u n đ ch n l a vector tái t h p pMD18-T-xynA k t qu là, s n ph m PCR đ c dùng cho gel agarose đ c đ c trình t S BI U HI N TINH S CH XYLANASE R t nhi u protein c n ph i hình thành c u n i disulfide n đ nh đ n p g p t o thành d ng nguyên th N u s hình thành c u n i disulfide n đ nh, nh ng protein có b đào th i ho c tích l y nh nh ng th n nh p (th vùi) ó u không d dàng bi u hi n gen c a sinh v t nhân chu n t bào sinh v t nhân s Th m chí n u gen có th bi u hi n s n ph m th ng khơng hịa tan không thành d ng ho t đ ng môi tr ng n i bào t o u ki n thu n l i cho s bi u hi n c a xylanase t bào ch khơng đ ng nh t (t bào có ngu n g c khác nhau) bi u hi n xylanase P.pastoris ng th i, pPICZaA vector v i trình t tín hi u nhân t đ c s d ng cho s bi u hi n Các s n ph m đ c bi u hi n t bào ch có th đ c v n chuy n môi tr ng trình t tín hi u c t nh h th ng nh n bi t tín hi u c a t bào ch sau s n ph m đ c bi u hi n sau protein tái t o l i n p g p thành d ng ho t đ ng C u trúc c a gen xylanase (đ c đ ng ký ngân hàng gen v i mã s : EU846238) đ c x lý v i enzyme gi i h n đ c nhân dòng s d ng vector bi u hi n pPICZaA B n đ plasmid tái t h p đ c ch hình sau đó, plasmid đ c chuy n vào t bào E.coli JM109 kh bi n đ c nhân dòng Sau ly trích, plasmid tái t h p ch a đ ng c u trúc gen mã hóa xylanase đ c nhân dịng K t qu đ c trình t plasmid tái t h p ch r ng gen đích đ c thu nh n.cu i plasmid pPICZaA-T-xynA đ c t o dòng nh Sac I đ c chuy n vào P.pastoris X33 m t s ch ng bi n n p thành công đ c thu nh n môi tr ng ch n l c nh ng khu n l c đ n đ c chuy n sang môi tr ng BMMY sau kho ng 24 gi r i thu nh n t bào nh ly tâm 6000 vòng phút Các t bào đ c tái sinh l l ng môi tr ng BMGY đ c c m ng b i 250µl methanol thêm vào ba l n m t ngày Sau c m ng, ta thu d ch n i nh ly tâm 6000 vòng ho t đ c a enzyme đ c xác đ nh Kêt qu ch b ng K t qu ch r ng ho t tính c a xylanase đ c bi u hi n thành công nghiên c u Sau bi u hi n xylanase đ c tinh s ch s d ng c t NI2+NTA Enzyme đ c gi 4°C glycerol 20 % vài tu n n di huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com SDS-PAGE enzyme tinh s ch thu đ 21kDa NH H c m t b ng có kích th cx px NG C A pH T I HO T TÍNH C A XYLANASE Các ph n gi ng c a enzyme tinh s ch đ đ m khác c hịa tan Sau đo ho t đ t ng đ i l i đ đánh giá s nh h ng c a pH u ki n thí nghi m chu n Trong thí nghi m đ m g m có axit xitric NaHPO (pH 3.4-8.0) Tris-HCl (pH=7.2-9.1) v i n ng đ 100mM s d ng cho m i l n sau v i đ m pH khác khám phá r ng xylanase th hi n kho ng pH=3-8 nh ng th hi n ho t tính cao nh t pH=4 K t qu chi ti t hình huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com NH H NG C A NHI T T I HO T TÍNH C A XYLANASE ánh giá nh h ng c a nhi t đ lên ho t tính c a enzyme, enzyme đ c s lý tr c nhi t đ khác t 20-85°C Ho t tính d (cịn l i) t ng đ i đ c xác đ nh u ki n chu n phịng thí nghi m Ho t tính c a enzyme mà th nghi m d i u ki n ph n ng g n nh 100% Ho t tính c a enzyme gi m ch m t 20-60°C, gi m m nh 70°C, g n nh m t ho t tính 85°C nh v y enzyme nh y c m v i nhi t đ Chi ti t xem hình NH H NG C A ION KIM LO I VÀ CÁC TÁC NHÂN KHÁC HO T TÍNH C A XYLANASE N Nh ng nh h ng c a ion kim lo i khác tác nhân khác đ n ho t tính c a xylanase tinh s ch đ c ki m tra b ng cách nh ng enzyme v i s có m t c a tác nhân 40°C gi Ho t tính t ng đ i đ c kh o sát theo ph ng pháp chu n Ho t tính c a xylanase tinh s ch b c ch b i m t s ion kim lo i nh Hg2+, Cu2+, Ag+, Fe2+, Co2+, Mn2+, Zn2+ Tuy nhiên, Ca2+ Mg2+ có th tác đ ng t i xylanase Xylanase b nh h ng m nh nh t b i EDTA, kìm hãm 83.4% K t qu chi ti t ch b ng XÁC NH CÁC THÔNG S NG H C Giá tr km cân b ng Michaelis Vmax c a xylanase đ c xác đ nh b i th nghi m enzyme tinh s ch v i gia t ng ng u nhiên n ng đ xylan lúa mì t 0,5-0,8mg.nhi t đ , pH, l ng enzyme đ c gi u ki n nh ho t tính enzyme chu n đ c mô t Giá tr km Vmax cho xylanase đ c tính tốn d a đ th Lineweaver-Burk (t 1979) Các giá tr km Vmax đ c tính tốn 6.6mg/ml 982µmol kh đ ng xylose min-1, mg-1, protein theo th t s th y phân xylan lúa mì TH O LU N Xylanase polimer sinh h c giàu th hai ch sau cellulose Và m t lo i polysaccharide hemicellulose đ c tìm th y thành t bào th c v t (Timell, 1967).xylanase thu hút đ c nhi u nghiên c u b i ti m n ng ng d ng cơng nghi p c a chúng VD: xylanase đ c s d ng đ làm t ng ch t l ng t ng k t c u c a s n ph m bánh mì, kh đ c m t l ng Clo c n thi t đ làm tr ng b t gi y làm gia t ng ch t l ng dinh d ng kh u ph n n c a gia c m (Gilbert Hazewood, 1993) huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com Nghiên c u nh m m c tiêu phân l p ch ng vi sinh v t có th s n xu t xylanase cho nhu c u công nghi p Các ch ng vi sinh v t khác đ c phân l p t m u đ t nh nuôi c y làm giàu Ch ng Aspergillus awamori SH-2016 có kh n ng sinh m t l ng l n xylanase đ c phân l p l a ch n nh m t ch ng t t nh t cho nh ng nghiên c u ti p theo c a chúng tơi Nói chung, vi sinh v t đ c gi ng nh ng đ c m hình thái huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com Tuy nhiên, nh ng ph ng pháp nh n bi t th ng có v n đ có th có s khác hình thái/biotypes (morpho/biotypes) m t loài nh t ng i ta c ng m t nhi u th i gian k n ng c n thi t ph ng pháp phân tích trình t DNA m t ph ng pháp khách quan, reproducible, ph ng pháp nh n bi t nhanh chóng v y đ c ng i ta s d ng r ng rãi Trong cách ti p c n sinh h c phân t này, chi n l c c a nh n bi t đ c s i n m kh trùng nh k t qu so sánh trình t rDNA c ng nh phân tích phát sinh đ c th c hi n m t s pha c a gi i pháp phân lo i khác (Liu et al., 2008) Ph ng pháp PCR đ c s d ng r ng rãi cho vi c phân tích vùng riboxom đ c tr ng c a loài n m khác (Gardes Bruns, 1993) C u trúc riboxom c a c th c v t n m c m nh ng vùng gen l p l i (Erland et al., 1994) Tách vùng ITS t gen 17S 25S có th đ c khu ch đ i nh m i đ c hi u đ c neo hai đ n v a hình vùng ITS hay đ c s d ng đ phân lo i nh ng ngày th ng đ c s d ng đ nh n bi t loài n m gi ng nhau.trong nghiên c u k t h p ph ng pháp so sánh đ c m hình thái, sinh lý đ nh n v trí di truy n c a ch ng sinh xylanase đ c phân l p ngày nay, có nhi u gen xylanase đ c phân l p đ c phân tích đ c m (Ghost et al., 1993; Haltrich et al., 1996; Ito et al., 1993; Ziaie-Shikolaee et al., 2008) H n n a m t s sinh h c phân t c a nh ng enzyme đ c nghiên c u (Alam et al., 1994; Eliger et al., 1994; Patel Ray et al 1994; Tsujibo et al., 1990; Wang et al.,1993; Moreau et al., 1994; Kulkarni et al., 1999) Trong nghiên c u này, m t ch ng m i A.awamori SH-2016 m i đ c phân l p nh n có th sinh xylanase, gen mã hóa xylanase đ c nhân dịng bi u hi n thành cơng, gen mà sinh m t l ng l n xylanase M t s ion có th nh h ng đ n ho t tính c a xylanase, m t s ion kim lo i ch r ng có nh h ng b n v ng ph n ng có m t xylanase xúc tác M t đ c m thú v c a enzyme pH t t nh t cho xylanase tái t h p kho ng 5.0 có ho t đ ng th y phân hi u qu , lúa mì g n 4.5 pH na kho ng ho t đ ng t t nh t c a xylanase đ c phân l p t vi khu n.đi u g i ý m t l n n a r ng xylanase t Aspergillus awamori SH-2016 có th có l i đ tiêu hóa l ng xylan d có d dày đ ng v t d i u ki n acid ng th i enzyme nh y c m v i nhi t đ c i thi n tính ch u nhi t ho t tính c a xylanase ng d ng cơng nghi p xylanase có th đ c c i bi n nh thi t k h p lý protein ho c c i bi n tr c ti p s ti n hóa phân t c a protein (Miyazaki et al., 2006; Liu et al., 2006) đ c ti p t c nghiên c u ti p theo c a chúng huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com tơi Các thí nghi m xác đ nh đ c m thu đ c m t l ng l n thông tin liên quan đ n sinh hóa c a xylanase đ a m t kh n ng cho lo i xylanase có th ng d ng cơng nghi p Có nhi u lo i n m men cơng nghi p đ c s d ng nh nh ng h th ng tái t h p đ s n xu t xylanase (Damaso et al., 2003) Nh ng lo i sinh v t có th thao tác di truy n d dàng v i kh n ng th c hi n nhi u c i bi n sau d ch mã nhi u sinh v t nhân chu n (Cereghino et al., 2002) M t nh ng h th ng th ng đ c s d ng n m men Pichia pastoris Nh ng sinh v t chi m t l phân b t bào ch đ cho bi u hi n s n xu t xylanase(Berrin et al., 2000) Quan tr ng nh t có th phát tri n thu n l i môi tr ng đ n gi n r ti n không ti t b t k m t lo i xylanase n i bào (Berrin et al., 2000) Trong thí nghi m này, xylanase t A awamori SH-2016 đ c nhân dịng bi u hi n thành cơng Pichia pastoris S bi u hi n m c c a lo i xylanase s làm cho s hi u bi t v c u trúc c a enzyme đ c d dàng h n có th d n đ n s n xu t m t l ng l n xylanase xúc tác sinh h c hi u qu L IC M N Nghiên c u đ c s h tr c a ch ng trình nghiên c u c a s khoa h c công ngh t nh Cát Lâm (No[S ] 2000567-1) Qu Khoa h c t nhiên c a T nh Chi t Giang (s Y506136) L I NG I D CH: ây l n đ u tiên, d ch t p chí ch c h n có r t nhi u l i nhi u ch ch a đ t v l i ki n th c ti ng anh c a cịn r t h n ch v y r t mong đ c s góp ý nh n sét c a b n, anh ch , th y cô… Nh ng ch mà d ch ch a đ M i ý ki n đóng góp xin g i v : c ng ý có đánh d u b ng màu khác Email: huaducthai@gmail.com Ho c: Vietnam.biotechnology@gmail.com Cám n b n ! ... ng nghiên c u ti p theo c a chúng t? ?i N? ?i chung, vi sinh v t đ c gi ng nh ng đ c m hình th? ?i huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com huaducthai@gmail.com ho c Vietnam.biotechnology@gmail.com... i enzyme gi i h n E.coR I Xhol, thu h i l i nh n di gel agarose sau đ c n i l i nh T4-DNA ligase Plasmid pPICZaA n i đ c bi n n p vào E.coli JM109.ch n l c nh ng khu n l c đ n chuy n sang m? ?i. .. t d i u ki n acid ng th i enzyme nh y c m v i nhi t đ c i thi n tính ch u nhi t ho t tính c a xylanase ng d ng công nghi p xylanase có th đ c c i bi n nh thi t k h p lý protein ho c c i bi n