TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PROTEASETRONG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRUNG TÂM HỖ TRỢ NGHIÊN CỨU CHÂU Á BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI Tên đề tài: TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PROTEASE TRONG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Hồng Lộc Đơn vị chủ trì: Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế HUẾ 3/2009 MỤC LỤC Giải thích chữ viết tắt Danh sách người tham gia thực đề tài .5 Danh mục bảng số liệu Danh mục hình Tóm tắt kết nghiên cứu đề tài Phần Đặt vấn đề .9 Phần Tổng quan vấn đề nghiên cứu 11 2.1 Tổng quan protease 11 2.1.1 Đặc điểm protease .11 2.1.1.1 Giới thiệu chung 11 2.1.1.2 Phân loại protease 11 2.1.2 Ứng dụng protease 13 2.1.2.1 Ứng dụng protease cơng nghiệ p sản xuất xà phịng 14 2.1.2.2 Ứng dụng công nghiệp thuộc da 14 2.1.2.3 Ứng dụng y học 15 2.1.2.4 Các ứng dụng công nghiệp thực phẩm 15 2.1.2.5 Trong chế biến thủy sản 17 2.2 Tổng quan vi khuẩn Bacillus subtilis .18 2.3 Công nghệ DNA tái tổ hợp 19 2.4 Tình hình nghiên cứu protease nước giới 21 2.4.1 Các nghiên cứu tách chiết, đặc điểm ứng dụng enzyme protease 21 2.4.1.1 Protease từ nguồn thực vật 21 2.4.1.2 Protease từ nguồn động vật 23 2.4.1.3 Protease từ nguồn vi sinh vật 24 2.4.2 Các nghiên cứu tạo dịng biểu gen mã hóa protease 27 Phần Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài .30 3.1 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 30 3.2 Nội dung nghiên cứu đề tài 30 Phần Địa điểm, thời gian phương pháp nghiên cứu 31 4.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 4.2 Phương pháp nghiên cứu 31 4.2.1 Phân lập DNA khuếch đại gen protease trung tính B subtilis C10 31 4.2.2 Tạo dòng phân tích trình tự gen protease trung tính 32 4.2.3 Biểu gen protease trung tính .33 4.2.4 Ảnh hưởng số nhân tố lên khả sản xuất enzyme protease trung tính ngoại bào 33 4.2.5 Xác định hoạt tính protease .34 4.2.6 Xử lý thống kê 35 Phần Kết nghiên cứu 36 5.1 Tạo dòng gen sản xuất protease 36 5.1.1 Tách chiết DNA tổng số 36 5.1.2 Khuếch đại PCR 36 5.1.3 Tạo dòng sản phẩm PCR 37 5.1.4 Xác định trình tự nucleotide sản phẩm PCR .38 5.2 Biểu gen protease vi khuẩn E coli 40 5.2.1 Phân tích biểu gen protease điện di SDS 40 5.2.2 Xác định nhanh hoạt tính protease 42 5.2.3 Phân tích hoạt độ protease 43 5.3 Khảo sát ảnh hưởng số nhân tố lên khả sản xuất protease trung tính ngoại bào 44 5.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 44 5.3.2 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng 45 5.3.3 Ảnh hưởng nồng độ IPTG .46 5.3.4 Ảnh hưởng mật độ tế bào lên sản xuất protease 47 5.3.5 Ảnh hưởng nồng độ Ca2+ lên sản xuất protease ngoại bào .48 Các công bố liên quan đến kết đề tài 50 Kết đào tạo đề tài 50 Kết ứng dụng đề tài .50 Thảo luận 51 Phần Kết luận kiến nghị 54 Tài liệu tham khảo .55 Phụ lục 63 Đề cương đề tài nghiên cứu phê duyệt Phiếu tóm tắt kết nghiên cứu tiếng Việt & tiếng Anh Phiếu đăng ký kết nghiên cứu CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pairs BSA bovine serum albumin CDS coding sequence cs cộng FLS full-length sequence DNA deoxyribonucleic acid ĐC đối chứng dNTP deoxyribonucleotide 5’-triphosphate EDTA ethylene diamine tetra acetic acid EtBr ethidium bromide His histidin Kb kilobase kDa kilodalton IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside MCU milk clotting units NPR- His protein dung hợp (tái tổ hợp) LB Luria-Bertani PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PCR polymerase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate TAE tris-acetate-EDTA TCA trichloroacetic acid DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI - Chủ trì: Nguyễn Hồng Lộc Học hàm, học vị: Phó giáo sư, Tiến sĩ Cơ quan công tác: Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế - Thư ký: - Những người thực + Nguyễn Văn Song, Thạc sĩ + Hoàng Tấn Quảng, Thạc sĩ + Lê Đức Dũng, Kỹ sư + Nguyễn Đức Huy, Kỹ sư + Nguyễn Hồng Bách, Cử nhân Cơ quan cơng tác: Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế + Trương Thị Bích Phượng, Tiến sĩ Cơ quan công tác: Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế + Đỗ Thị Bích Thủy, Tiến sĩ Cơ quan công tác: Trường đại học Nông-Lâm, Đại học Huế Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU TT Tên bảng Trang Bảng 4.1 Trình tự nucleotide hai cặp mồi đ ược thiết kế 31 cho đoạn mã hóa (CDS) đoạn hồn chỉnh (FLS) gen protease trung tính nprE Bảng 5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng lên biểu 45 protease trung tính ngoại bào Bảng 5.2 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng l ên biểu 46 protease trung tính ngoại b Bảng 5.3 Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên biểu 47 protease trung tính ngoại bào Bảng 5.4 Ảnh hưởng mật độ tế bào lên biểu 48 protease trung tính ngoại bào Bảng 5.5 Ảnh hưởng Ca 2+ lên ổn định hoạt độ trung tính protease ngoại bào 49 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang Hình 2.1 Sơ đồ phân loại protease 12 Hình 4.1 Sơ đồ cấu trúc đơn giản gen protease 32 trung tính nprE Hình 5.1 Điện di DNA tổng số agarose 0,8% 36 Hình 5.2 Sản phẩm PCR khuếch đại hai cặp mồi 37 đặc hiệu NPF NPC Hình 5.3 Plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đ ược cắt 38 SacI Hình 5.4 Trình tự nucleotide đoạn CDS gen nprC10 40 (1566 bp) Hình 5.5 Điện di SDS-PAGE protein tổng số từ dịch chiết tế 41 bào E coli Hình 5.6 Hoạt động protease trung tính thể tr ên đĩa 42 thạch chứa casein 0,1% Hình 5.7 Hoạt độ riêng protease thời điểm nuôi cấy 43 khác sau cảm ứng IPTG 10 Hình 5.8 Đường cong sinh trưởng vi khuẩn E coli BL21(DE3) tái tổ hợp 44 TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI - Kết khoa học: Đã tạo dòng biểu thành cơng gen sản xuất enzyme protease trung tính ngo ại bào Bacillus subtilis C10 tế bào E coli BL21 (DE3) Cơng trình khoa học cơng bố + Cloning and expression of neutral protease gene from Bacillus subtilis, Vietnamese Journal of Biotechnology 6(4B) (2008): 963-970 Cơng trình khoa học công bố + Effect of some factors on the production of recombinan t extracellular neutral protease from Escherichia coli - Kết phục vụ thực tế: chưa có - Kết đào tạo: Đã đào tạo sinh viên cao học sinh viên đại học - Kết nâng cao tiềm lực khoa học: có cán đơn vị tham gia trực tiếp vào đề tài để nâng cao trình độ lực nghiên cứu Phần ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng nhiều lĩnh vực Hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị 500 triệu USD [15]; protease (proteinase) ba nhóm lớn enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 60% tổng số enzyme thương mại giới [40], [54] Protease enzyme phân giải protein sử dụng nhiều số ngành sản xuất chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, dệt, thuộc da, y tế, nơng nghiệp…[7] Protease chìa khóa mở hướng phát triển cho ngành sản xuất Protease thu nhận từ nhiều nguồn khác nh động vật, thực vật vi sinh vật Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease đ ã cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease cịn cao, hạn chế việc sử dụng rộng r ãi sản xuất Các chế phẩm thu sau q trình ni cấy sản xuất enzyme ch ưa có độ tinh cao [15] Những kết đạt lĩnh vực nghiên cứu protease từ vi sinh vật đ ường truyền thống không đáp ứng việc mở rộng quy mô sản xuất v ứng dụng nhóm enzyme n ày đời sống Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) phận quan trọng công nghệ chìa khóa lĩnh vực cơng nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp đời sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trị cách mạng phát triển sinh học cải tạo sinh giới Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép nhà công nghệ sinh học phân lập khuếch đại gen đơn từ genome sinh vật để nghiên cứu, biến đổi chuyển vào thể sinh vật khác Cải thiện hoạt tính khả tổng hợp enzyme kỹ thuật tái tổ hợp DNA đ ược ứng dụng rộng rãi, có tạo dịng sản xuất enzyme protease Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu tạo dịng biểu gen protease tế bào Escherichia coli công bố biểu protease nội bào (PfpI) Pyrococcus furiosus (Halio cs 1996) [37], cysteine protease từ Streptococcus pyogenes (Gubba cs 1998) [35], endoprotease Aeromonas caviae T-64 (Nirasawa cs 1999) [50], cysteine protease t Porphyromonas gingivalis (Margetts cs 2000) [45], protease ki ềm chịu nhiệt từ Bacillus stearothermophilus F1 (Fu cs 2003) [34], protease trung tính (Bae16) t B nematocida (Niu cs 2006) [51], zinc-metalloprotease từ chủng Salinivibrio sp AF-2004 (Karbalaei-Heidari THẢO LUẬN Kết nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa protease trung tính t chủng B subtilis C10 tiến hành thành công, vùng mã hóa (CDS) sau g ắn vào vector pET200/DTOPO biến nạp thành công vào tế bào E coli BL21 (DE3) có chiều dài 1566 bp So sánh trình tự nucleotide đoạn DNA đ ược tạo dòng từ chủng B subtilis C10 với trình tự đoạn gen mã hố protease cơng bố Ngân hàng liệu gen (http://ncbi.nlm.nih.gov) mang m ã số K01985 [69] cho thấy có độ tương đồng 99%, chúng khác 12 nucleotide, l nucleotide vị trí thứ 28, 29, 133, 134, 135, 136, 157, 231, 232, 690, 1301 v 1302 Sự khác trình tự amino acid protease trung tính nprE [69] xảy amino acid thứ 44, 45 77, amino acid không n ằm trình tự hoạt động gen, điều n ày dự đốn chuỗi amino acid tổng hợp gen nprC10 có khả thể hoạt tính protease Kết phân tích biểu protein tái tổ hợp điện di SDS cho thấy protein dung hợp tổng hợp môi trường nội bào có khối lượng phân tử khoảng 61 kDa, bao gồm protease trung tính có khối l ượng khoảng 57,3 kDa phần phối tử vector pET200/D TOPO có khối lượng khoảng 3,7 kDa Phân tích hoạt tính protease phương pháp khuếch tán đĩa thạch Anson cải tiến cho thấy protease tái tổ hợp nội b hoạt tính, nhiên hoạt độ chưa cao Chúng thành công việc biểu protease tái tổ hợp môi trường ngoại bào cảm ứng xảy nhiệt độ thấp v thăm dò tác nhân ảnh hưởng đến q trình sản xuất protease ngoại bào Nhiệt độ ni cấy tác nhân có vai trị lớn trình biểu protein tái tổ hợp, đặc biệt protein hịa tan Ví dụ, protein dung hợp hBD4 (beta-defensin-4 người) sản xuất nhiều nuôi cấy tế bào E coli tái tổ hợp nhiệt độ 34oC (Xu cs 2006) [71], 25oC nhiệt độ thích hợp để biểu enzyme GDP-L-fucose E coli K12 (Byun et al 2007) [30] protein YLR301W c nấm men (Ahn et al 2007) [21] K ết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 20oC phù hợp cho việc biểu protease trung tính Trong thí nghiệm chúng tơi nồng độ IPTG thích hợp cho sản xuất protease ngoại bào 0,1 mM, tương tự với nghiên cứu biểu aconitase từ nấm men (Gupta cs 2009) [36] GDP-L-fucose (Byun cs 2007) [30] Trong khí n ồng độ IPTG thích hợp cho sản xuất hBD4 0,4 mM (Xu cs 2006) [71], ho ặc 0,04 mM cho sản xuất protease kiềm chịu nhiệt từ B stearothermophilus F1 (Fu cs 2003) [34] catalase t Helicobacter pylori (Bai cs 2003) [24], từ 0.02 - 0.2 mM cho sản xuất protein YLR301W (Ahn cs 2007) [21] Thời gian cảm ứng cần thiết cho việc tổng hợp protein tái tổ hợp tế bào E coli tiết môi trường ngoại bào Thời gian cảm ứng tối ưu cho loại protein tái tổ hợp khác nhau, chẳng hạn thời gian tối ưu cho biểu protease kiềm chịu nhiệt Bacillus stearothermophilus F1 72 (Fu cs 2003) [34], sản xuất Cecropin X từ côn trùng (Shen cs 2007) [59], hBD4 gi (Xu cs 2006) [71] Trong trình bi ểu protein tái tổ hợp E coli, cảm ứng IPTG điểm mấu chốt thời kỳ tăng trưởng thời kỳ tổng hợp protein tái tổ hợp tế bào Việc bổ sung IPTG giúp khởi đầu phiên mã gen ngoại lai plasmid tạo thay đổi lớn trình trao đổi chất tế bào vật chủ cách khỏa đầu dịch mã loại protein khác (Xu cs 2006) [71] Ví d ụ, mật độ tế bào phù hợp cho cảm ứng biểu catalase từ Helicobacter pylori E.coli tương ứng với OD600 = 0,6 (Bai cs 2003) [24] ho ặc OD600 = cho biểu protease trung tính chúng tơi Ca2+ ion quan trọng cho ổn định hoạt độ protease ion quan trọng cho protease trung tính từ Bacillus nematocida (Bae16), 0,1 M Ca 2+ có khả làm tăng hoạt tính enzyme lên 60% kim lo ại khác khơng có vai trị đáng kể ức chế hoạt động enzyme (Niu cs 2006) [51] Đ ối với biểu enzyme US105 pullulanase type I Geobacillus thermoleovorans E coli, Ca2+ nồng độ từ đến mM tăng khả hoạt động enzyme lên 140% nhiệt độ 70oC Ở nồng độ tử đến mM xử lý enzyme nhiệt độ 70oC 30 phút cho thấy khả chịu nhiệt enzyme đạt tốt nồng độ Ca2+ 0,1 mM, với nồng độ cao khơng có tác dụng (Ayadi cs 2008) [23] Nghiên cứu cho thấy 10 mM Ca 2+ làm tăng hoạt độ enzyme lên tới 80% so với đối chứng Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Gen nprC10 từ chủng B subtilis C10 biến nạp thành công vào tế bào E coli BL21 (DE3) có chiều dài đoạn hồn chỉnh khoảng 1916 bp đoạn mã hóa 1566 bp, tương đồng 99% với gen nprE trình tự nucleotide lẫn trình tự amino acid Kết điện di SDS, phân tích hoạt tính protease cho thấy protease tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 57,3 kDa, phù hợp với tính tốn protein dung hợp biểu nội bào ổn định, có hoạt tính thủy phân protein Protease tái tổ hợp tiết mơi trường ngoại bào có hoạt độ cao sau 19 cảm ứng 0,1 mM IPTG 20 oC mật độ tế bào đạt (OD600) nồng độ Ca 2+ 0,01 M với giá trị hoạt độ chung hoạt độ riêng 0,86 u/ml 1,83 u/mg KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tối ưu qui trình sản xuất protease tái tổ hợp NPRC10 hệ l ên men tinh sản phẩm protease ngoại bào thu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Quỳnh Anh, Nguyễn Đức Hồng, Trần Linh Thước, Tạo dịng mã hóa protein vỏ VP19 vi rút WSSV gây hội chứng tơm Sú (Penaeus monodon) Tạp chí Di truyền học Ứng dụng (2003), tr 49-55 Nguyễn Liêu Ba, Lê Văn Nhương, Thu nh ận tinh protease kiềm từ dịch nuôi cấy B brevis B1 phân lập Hà Nội Hội thảo quốc tế Sinh học Hà Nội (2001), tr 26-30 Nguyễn Trọng Cẩn (CB), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công nghệ enzyme Nxb Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh (1998) Phạm Thị Trân Châu, Cơng nghệ enzyme việc ứng dụng proteinase công ngh ệ chế biến Tạp chí ngành Thủy sản 1(2) (1993), tr 18-20 Phạm Thị Trân Châu (CB), Trần Thị Áng, Hóa sinh học Nxb Giáo dục, Hà Nội (1999) Dương Thị Hương Giang, Nguyễn Thị Xuân Dung Phạm Thị Bích Trâm, Nghiên cứu sử dụng enzyme papain thô từ nhựa đu đủ để thủy phân protein đậu nành Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, Trường đại học Cần Thơ (2006), tr 115-122 Đỗ Quí Hai (CB), Trần Thanh Phong, Giáo trình Enzyme Nxb Đại học Huế (2007) Trần Quốc Hiền, Lê Việt Mẫn, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti) Tạp chí phát triển KH & CN 9(11) (2006), tr 56 Bùi Thị Hương, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy Kháng, Tạo dòng xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen Cry 1AB từ số chủ Thuringiensiss kurstaki phân lập Việt Nam Tạp chí Di truyền học Ứng dụng (2003), tr 56-60 10 Kretovis VL, Iarovenko VL, Sử dụng chế phẩm enzyme công nghi ệp thực phẩm Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội (1982) 11 Nguyễn Hoàng Lộc, Giáo trình nhập mơn cơng nghệ sinh học Nxb Đại học Huế (2007) 12 Nguyễn Hoàng Lộc (CB), Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi, Giáo trình Sinh học phân tử Nxb Đại học Huế (2007) 13 Lê Thị Thanh Mai, Nguyễn Kiên Hùng, Khảo sát khả làm mềm thịt enzyme bromelain thu từ phế liệu dứa q trình sản xuất dứa đóng hộp - chồi ngọn, Tập san Khoa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh (2007), tr 53 14 Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi, Nghiên c ứu thiết kế biểu protein lai GNRH-TBK E.coli Tạp chí Di truyền học Ứng dụng 3(2003), tr 24-28 15 Lê Xuân Phương, Vi sinh vật công nghiệp Nxb Xây dựng, Hà Nội (2001) 16 Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Ảnh hưởng yếu tố mơi trường lên q trình sinh trưởng sinh tổng hợp protease chủng Serrraratia sp DT3 Tạp chí Cơng nghệ sinh học 2(2) (2004), tr 205-216 17 Đỗ Thị Bích Thủy, Nghiên cứu chế phẩm protease từ số nguồn khác ứng dụng công nghệ thực phẩm Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng (2006) 18 Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thanh Trà, Lương Đức Phẩm, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease thô từ Aspergillus oryzae phương pháp nuôi cấy bề mặt Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 36(6) (1998), tr 17-21 19 Phan Thị Bích Trâm, Trương Thúy Trang, Dương Th ị Hương Giang, Tinh khảo sát đặc điểm protease từ trùn quắn (Pheretima posthuma) Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ (8) (2007), tr.158-167 Tài liệu tiếng Anh 20 Adam Z., Chloroplast proteases: Possible regulators of gene expression? Biochimie 82 (2000), pp 647-654 21 Ahn W.S., Ahn J.Y., Jung C.H., Wang K.Y., Kim E.E., Kim J., Im H., Kim J.O., Yu M.H., and Lee C., Optimization of expression conditions for soluble pro tein by using a robotic system of multi-culture vessels J Microbiol Biotechnol 17(11) (2007), pp 1868-1874 22 Asorena D., Zapelena M.J., Astiasarans I., and Bello J., Simultaneous addition of palatase M and protease P to a dry fermented sausage (Chorizo de Pamplona) elaboration: Effect over peptidic and lipid fractions Meat Science, 50(1) (1998), pp 37-44 23 Ayadi D.Z., Ali M.B., Jemli S., Mabrouk S.B., Mezghani M., Messaoud E.B., and Bejar S., Heterologous expression, secretion and characterization of t he Geobacillus thermoleovorans US105 type I pullulanase Appl Microbiol Biotechnol 78 (2008), pp 473-481 24 Bai Y., Zhang Y.L., Jin J.F., Wang J.D., Zhang Z.S., and Zhou D.Y., Recombinant Helicobacter pylori catalase World J Gastroenterol 9(5) (2003), pp 119-1122 25 Balbás P., and Lorence A., Recombinant Gen Expression Previews and Protocols, th ed Humana Press (2004) 26 Bradford M.M., A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein -dye-binding Anal Biochem 72 (1976), pp 248-54 27 Brien S., Lewith G., and Walker A., Bromelain as a treatment for osteoarthritis: a review of clinical studies Evidence-based Compl and Alt Medicine 1(3) (2004), pp 251-257 28 Brindist J.A., Parker J.D., Turner L.G., and Larick D.K., Chemical prolile of hydrolyzed milk samples after treatment with commercial enzymes Journal of Food Science 66(8) (2004), pp 1100-1107 29 Brao M., Tanksala A.M., Ghatge M.S., and Deshpande V.V., Molecular and biotechnological aspects of microbiol proteinase Microbiological and Molecular Biology Reviews (1998), pp 597-635 30 Byun S.G., Kim M.D., Lee W.H., Lee K.J., Han N.S., and Seo J.H., Production of GDP -Lfucose, L-fucose donor for fucosyloligosaccharide synthesis, in recombinant Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol 74 (2007), pp 768-775 31 Chu I.M., Lee C., and Li T.S., Production and degradation of alkaline protease in bath cultures of Bacillus subtilis ATCC 14416 Enzyme Microbiol, 14 (1992), pp 755-761 32 Desmond E.P., Strain W.L and Behal F.J., Aminopeptidases of Bacillus subtilis Journal of Bacteriology (1975), pp 353-363 33 Esawy M.A., Wafaa, Helmy A., Ahmed S.A., and Combet Y., Natural material role in production, activation and stabilization of alkaline protease pro duced from a new isolated Geobacillus calldoxylosilyticus IRDO Journal of Applied Sciences Research 2(10) (2007), pp 1062-1068 34 Fu Z., Hamid S.B.A., Razak C.N.A., Basri M., Salleh A.B., and Rahman R.N.Z.A., Secretory expression in Escherichia coli and single-step purification of a heat-stable alkaline protease Protein Expr Purif 28 (2003), pp 63-68 35 Gubba S., Low D.E., and Musser J.M., Expression and characterization of group A Streptococcus extracellular cysteine protease recombinant mutant proteins an d documentation of seroconversion during human invasive disease episodes Infect Immun 66(2) (1998), pp 765-770 36 Gupta P., Ghosalkar A., Mishra S., and Chaudhuri T.K., Enhancement of over expression and chaperone assisted yield of folded recombinant acon itase in Escherichia coli in bioreactor cultures J Biosci Bioeng 107(2) (2009), pp 102–107 37 Halio S.B., Blumentals I.I., Short S.A., Merrill B.M., and Kelly R.M., Sequence, expression in Escherichia coli, and analysis of the gene encoding a novel intrace llular protease (PfpI) from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus J Bacteriol 178(9) (1996), pp 2605-2612 38 Horikoshi K., Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganism, a lkaline protease produce by Bacillus sp Agri Biol Chem., Part I, 35(221) (1971), pp 1407-1414 39 Horikoshi K., and Akiba T., Alkalophilic Microorgannisms: A New Microbial World Scientific Societies Press (1982), Tokyo 40 Harcum S.W., and Bentley W.E., Detection, quantification, and characterization of proteas e in recombinant Escherichia coli Biotechnology Techniques, Maryland, 7(6) (1993), pp 441-447 41 Karbalaei-Heidari H.R., Ziaee A.A., Amoozegar M.A., Cheburkin Y., and Budisa N., Molecular cloning and sequence analysis of a novel zinc -metalloprotease gene from the Salinivibrio sp strain AF-2004 and its extracellular expression in E coli Gene 408 (2008), pp 196-203 42 Kunst F., Ogasawara N., Moszer I., Albertini A.M., Alloni G., Azevedo V., Bertero M.G., Bessières P Bolotin A., Borchert S., Boriss R., Bour sier, Brans A., Braun M., Brignell S.C., Bron S., Brouillet S., Bruschi C.V., Caldwel B., Capuano V., Carter N.M., Choi S.K., Codani J.J., Connerton I.F., and Danchin A., The complete genome sequence of the grampositive bacterium Bacillus subtilis Nature 390(6657) (1997), pp 249-256 43 Lee J.K., Kim Y.O., Sunitha K., and Oh T.K., Expression of thermostable alkaline protease gene from thermoactinomyces sp E79 E coli and activation of the gene product Biotechnology Letter, 20(9) (1998), pp 837-840 44 Li P., Zhinan X., Xiangming F., Fang W., and Peilin C., High -level expression of soluble human beta-defensin-2 in E coli Process Biochem 39 (2004), pp 2199–2205 45 Margetts M.B., Barr I.G., and Webb E.A., Overexpression, purification, and refolding of a Porphyromonas gingivalis cysteine protease from Escherichia coli Protein Expr Purif 18 (2000), pp 262-268 46 Maurer K.H., Detergent proteases Current Opinion in Biotechnology 15 (2004), pp 330-334 47 Mierendorf R.C., Morris B.B., Hammer B., and Novy R.E., Expres sion and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System In: Rapley R (ed) The Nucleic Acid Protocols Handbook Humana Press Inc., Totowa, NJ (2000), pp 947-977 48 Min Z., Cong Z., Xiang D.L., Ping L.F., and Chen G., Expression, purification, an d characterization of a thermophilic neutral protease from Bacillus stearothermophilus in Bacillus subtilis Life Scientic Chine, 51(1) (2006), pp 52-59 49 Munoz R., Garcia J.L., Carrascosa A.V., and Gonzalez R., Cloning of the authentic bovine gene encoding pepsinogen a and its expression in microbial cells American Society for Microbiology, 70(5) (2004), pp 2588-2595 50 Nirasawa S., Nakajima Y., Zhang Z.Z., Yoshida M., and Hayashi K., Molecular cloning and expression in Escherichia coli of the extracellular endoprotease of Aeromonas caviae T-64, a pro-aminopeptidase processing enzyme Biochim Biophys Acta 1433 (1999), pp 335-342 51 Niu Q., Huang X., Zhang L, Li Y., Li J., Yang J., and Zhang K., A neutral protease from Bacillus nematocida, another potential virulence factor in the infection against nematodes Arch Microbiol 185 (2006), pp 439-448 52 Nogi Y., Takami H., and Horikoshi K., Chacterization of alkaliphilic Bacillus trains used in industry: proposal of five novel species Int J Syst Evol Microbiol 55 (2005), pp 2309-2315 53 Park C.H., Lee S.G., Lee W.S., and Byun S.M., Hetero - and autoprocessing of the extracellular metalloprotease (Mpr) in Bacillus subtilis Journal of Bacteriology 186(19) (2004), pp 6457-6464 54 Rahman R.N.Z.R.A., Basri M., and Salueh A.B., Thermotable alkaline protease from Bacillus stearothermophilus F1; nutritional factors affecting protease production Annals of Microbiology 53 (2003), pp 199-210 55 Ramalho-Ortigao J.M., Kamhawi S., Rowton E.D., Ribero J.M.C., and Valenzuela J.G., Cloning and characterization of trypsin and chymotrypsin -like proteases from the midgut of the sand fly vector Phlebotomus papatasi Elsevier Science 33(2) (2003), pp 163-171 56 Raju A.A., Rose C., and Rao M.N., Enzymatic hydrolysis of tannery fleshing using chicken intectine proteinases Animal Feed Science Technology 66 (1997), pp 139-147 57 Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., Molecular cloning: a Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press (1989), USA 58 Sarmantar W., Cheevadhanarak S., and Taticharoen M., Production of alkaline protease by a gentically engineered Aspergillus oryzae U1521 Appl Microbiol 45 (1999), pp 99-103 59 Shen Y., Lao X.G., Chen Y., Zhang H.Z., and Xu X.X., High -level Expression of Cecropin X in Escherichia coli Int J Mol Sci (2007), pp 478-491 60 Stepek G., Jerzy M., Behnke J.M., Buttle D.J., and Duce I.R., Natural plant cysteine proteinases as anthelmintics ? Trends in Parasitology, 20 (2004), pp 322 -327 61 Riepe H.R., McKav L.L., Oversecretion of the neutral proteas e from Bacillus subtilis in Lactococcus lacfis spp lactis JF254 J Dairy Sci 77 (1994), pp 2150 -2159 62 Takami H., Akiba T., and Horikoshi K., Production of extremely thermostable alkaline protease from Bacillus sp No AH -101 Appl Microbiol Biotechnol 30 (1989), pp 120-124 63 Tang X.M., Shen W., Lakay F.M., Shao W.L., Wang Z.X., Prior B.A., and Zhuge J., Cloning and over-expression of an alkaline protease form lichenniformis Biotechnology Letters 26(12) (2004), pp 975-979 64 Tran L., Wu X.C., and Wong S.L , Cloning and expression of a novel protease gene encoding and extraccellular Neutral protease from Bacillus subtilis Journal of Bacterriology 173(20) (1991), pp 6364-6372 65 Van der Poel A.F.B., Huisman J., and Saini H.S., Recent advances of research in a ntinutritional factors in legume seeds Proceedings of nd International Workshop on antinutritional factors (ANFS) in legume seads, Wageningen Press: Wageningen (1993), 550 pp 66 Vermelho A.B., Merelles N.L., Lopes A., Petinate S.D.G., Chaia A.A., and Branq uinha M.H., Detection of extracellular protease from microorganisms MH on agar plates Mem Inst Oswaldo Cruz Rio de Janeiro , 91(6) (1996), pp 755-760 67 Ward O.P., Proteolytic enzymes, In: Comprehensive Biotechnology, III Academic Press (1986), New York 68 Wiliam M.F., Microbial enzyme and biotechnology Applied Science Publishers, London, New York (1983) 69 Yang M.Y., Ferrari E., and Henner D.J., Cloning of the neutral protease gene of Bacillus and use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation Journal of Bacteriology 160(1) (1984), pp 15-21 70 Yang J., Yang C., Jiang H., and Qiao C., Overexpression of methyl parathion hydrolase and its application in detoxification of organophosphates Biodegradation 19 (2008), pp 831839 71 Xu Z., Zhong Z., Huang L., Peng L., Wang F., and Cen P., High -level production of bioactive human beta-defensin-4 in Escherichia coli by soluble fusion expression Appl Microbiol Biotechnol 72 (2006), pp 471-479 PHỤ LỤC PROJECT SUMMARY Project Title: Molecular cloning and expression of protease gene in Bacillus subtilis Code Number: Principal Researcher: Nguyen-Hoang Loc Implementing Institution: Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University Cooperating Institution(s): College of Sciences, Hue University, College of Agryculture and Foresty, Hue University Objectives and Contents: - Research objectives + Cloning of neutral protease gene from Bacillus subtilis C10 + Analyzing of expression level of neut ral protease in recombinant E coli cells - Research content + Isolating of neutral protease gene from Bacillus subtilis C10 + Cloning neutral protease gene in vector (pET200/D-TOPO) + Transformation of recombinant pET200/D-TOPO vector into commercial E coli strain BL21 (DE3) + Analyzing of neutral protease expression level in recombinant E coli cells + Recovering of extracellular neutral protease from recombinant E coli cells and investigate effect of some factors on the production of recombinant extracellular neutral protease Results obtained: - Results in science: + The specific primers were designed to amplify a neutral protease gene ( nprC10) from genome of a bacteria strain of Bacillus subtilis C10 The analysis shown the nprC10 gene, 1916 bp in length, containing a coding sequence of 1566 bp started from the codon GTG at nucleotide 161 and terminated in the TAA codon at nucleotide 1726 Sequence alignment of the nprC10 gene revealed 99% identity with that of the nprE neutral protease gene (access number: K01985) + The nprC10 gene product was determined to have a molecular weight of approximately 57.3 kDa and containing a signal peptide -like sequence at the N-terminal region Sequence comparison indicated that the mature form of this neut ral protease has 100% identity with the neutral protease of the nprE gene The expression of the nprC10 gene in strain of E coli BL21 (DE3) was induced by IPTG and confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis The specific activity of the intracellular nprC10 neutral protease reached a maximum value of 0.11 unit/mg The neutral protease of Bacillus subtilis C10 was produced in E coli BL21 (DE3) cells and secreted to the medium using a signal peptide The effects of some factors such as incubation temperature and time, IPTG concentration and post -induction time, and Ca 2+ ion concentration on extracellular neutral protease expression were investigated Our results shown that the enzyme exhibited a highest specific activity of 1.83 unit/mg protein at 20 oC after 19 h of 0.1 mM IPTG post -induction when cell density reached OD 600 value of 2, and the culture medium was supplemented with 10 mM Ca 2+ ion - Results in application: not yet - Results in education: + master student: finished thesis + master student: will finish thesis on October 2009 + undergraduate students: will finish thesis on June 2009 - Publication: Nguyen Hoang Loc, Nguyen Van Song, Hoang Tan Quang, Le Duc Dung, Duong Duc Loi, Truong Thi Bich Phuong, Do Thi Bich Thuy (2008) Cloning and expression of neutral protease gene from Bacillus subtilis, Vietnamese Journal of Biotechnology 6(4B): 963-970 Hoang Tan Quang, Le Duc Dung, Bui Thi Hong Lam, Dao Thi Thuy Trang, Truong Thi Bich Phuong, Nguyen Hoang Loc Effect of some factors on the production of recombinant extracellular neutral protease from Escherichia coli Indian Journal of Microbiology (submitted) Budget used: - Research contacts 32,500,000 VND - Lituratures, translation, print… 7,500,000 VND - Seminar 5,000,000 VND - Principal Researcher salary 2,500,000 VND - Management fee 2,500,000 VND Implementing Institution (full name, signature and stamp) Principal Researcher (f ull name and signature) Assoc Prof Nguyen Hoang Loc ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRUNG TÂM HỖ TRỢ NGHIÊN CỨU CHÂU Á PHIẾU ĐĂNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tên Đề tài: Tạo dòng biểu gen protease vi khuẩn Bacillus subtilis Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế Địa chỉ: 07 đường Hà Nội, Huế Điện thoại: 054.3830208 Cơ quan quản lý đề tài: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á - ĐHQGHN Địa chỉ: Phòng 501, Nhà Điều hành ĐHQGHN, 144 Xuân Thu ỷ, Cầu Giấy Điện thoại: 754 7987 Tổng kinh phí thực chi: Trong đó: - Từ kinh phí Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á tài trợ 50.000 x 1000 đ x 1000 đ USD - từ nguồn kinh phí khác - kinh phí tự có x 1000 đ USD - thu hồi x 1000 đ USD Thời gian nghiên cứu: 24 tháng Thời gian bắt đầu: 3/2007 Thời gian kết thúc: 3/2009 Tên cán phối hợp nghiên cứu (Họ tên) Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hoàng Lộc Những người tham gia - Trương Thị Bích Phượng - Đỗ Thị Bích Thủy - Nguyễn Văn Song - Hoàng Tấn Quảng - Lê Đức Dũng - Nguyễn Đức Huy - Nguyễn Hoàng Bách USD Số đăng ký Đề tài Số chứng nhận Tình trạng bảo mật đăng ký kết nghiên cứu Ngày  Phổ biến rộng rãi Ngày Tóm tắt kết nghiên cứu: - Phân lập tạo dịng thành cơng gen mã hóa enzyme protease trung tính ( nprC10) từ Bacillus subtilis C10 biến nạp thành công vào tế bào E coli BL21 (DE3) Đây gen có chiều dài đoạn hồn chỉnh khoảng 1916 bp đoạn mã hóa 1566 bp, tương đồng 99% với gen nprE trình tự nucleotide lẫn trình tự amino acid - Kết điện di SDS, phân tích hoạt tính protease cho thấy protease tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 57,3 kDa, phù hợp với tính tốn protein dung hợp biểu nội bào ổn định, có hoạt tính thủy phân protein - Đã thành công việc biểu protease tái tổ hợp môi tr ường ngoại vào xây dựng mơ hình sản xuất protease bình tam giác Protease tái tổ hợp tiết mơi trường ngoại bào có hoạt độ cao sau 19 cảm ứng 0,1 mM IPTG 20 oC mật độ tế bào đạt (OD600) nồng độ Ca 2+ 0,01 M với giá trị hoạt độ tổng số hoạt độ riêng 0,86 u/ml 1,83 u/mg Kiến nghị quy mô đối tượng áp dụng kết nghiên cứu: Kết nghiên cứu áp dụng thử nghiệm lĩnh vực công nghiệp thực phẩm Chức vụ Chủ nhiệm Thủ trưởng Chủ tịch Thủ trưởng Đề tài Cơ quan chủ trì đề Hội đồng đánh Cơ quan quản tài giá thức lý Đề tài Họ tên Nguyễn Hoàng Lộc Lê Văn Thăng Học hàm, PGS TS PGS TS Học vị Ký tên Đóng dấu Cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài (Xác nhận, đóng dấu) (Họ tên, chữ ký) PGS TS Nguyễn Hoàng Lộc