Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp ii và tạo dạng chế phẩm của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và Klebsiella pneumoniae phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp II và tạo dạng chếphẩm của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens va Klebsiella pneumoniae phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solan

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM TP HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

FRO OK OK OK OK OK

KHOA LUAN TOT NGHIEP

KHAO SAT QUA TRINH NHAN SINH KHOI CAP II VA TAO

DANG CHE PHAM CUA VI KHUAN Bacillus amyloliquefaciens

VA Klebsiella pneumoniae PHONG TRU VI KHUAN

Ralstonia solanacearum GAY BENH

HEO XANH TREN CAY HO CA

SINH VIÊN THUC HIỆN : NGUYEN THI KIM NGANNGANH : BAO VE THUC VAT

KHOA : 2019 — 2023

Thanh phó Hồ Chí Minh, tháng 8/2023

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHÓI CÁP II VÀ TẠO DẠNG CHE PHAM CUA VI KHUAN Bacillus amyloliquefaciens

VA Klebsiella pneumoniae PHONG TRU VI KHUAN

Ralstonia solanacearum GAY BENH

HEO XANH TREN CAY HO CA

Tac gia

NGUYEN THI KIM NGAN

Khóa luận được dé trình dé đáp ứng yêu cầu

LỜI CẢM ƠN

Con xin khắc ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của Cha Mẹ Cảm ơn Cha Mẹ

và những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con, là nguồn độnglực to lớn đề con có thê vượt qua mọi khó khăn, vấp ngã và có được như ngày hôm nay

Em xin cảm ơn sâu sắc đến các quý thầy cô cùng Ban lãnh đạo của Khoa Nônghọc Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôitrong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Võ Thị Ngọc Hà vàThS Phạm Kim Huyền đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức chuyênmôn và nhiều kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Gửi lời cảm ơn đến bạn Trương Thị Ngọc Hân, bạn Nguyễn Quang Hiển và bạn

Hồ Ngọc Như Tiền là những người bạn cộng sự đã đồng hành với tôi trong quá trìnhthực hiện đề tài tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị, bạn bè tại phòng thí nghiệm bệnh cây của

Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn

hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoan thành khóa luận.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp DH19BV đã đồng hành với tôitrong 4 năm học tập và nghiên cứu tại Trường Dai học Nông Lam Thành phố Hồ Chí

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp II và tạo dạng chếphẩm của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens va Klebsiella pneumoniae phòng trừ

vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà” được thực hiện

từ tháng 02/2023 đến tháng 08/2023 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật,Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, với mục tiêu:Xác định điều kiện nhân sinh khối cấp II tốt nhất cho vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI, tạo chế phamdạng bột của 2 dong vi khuẩn có khả năng phòng trừ vi khuẩn gây bệnh héo xanh trêncây họ ca trong điều kiện phòng thí nghiệm

Khảo sát điều kiện tăng sinh khối được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặplại Đánh giá hiệu quả phòng trừ của chế phẩm được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại

là 16 nghiệm thức, 14 nghiệm thức chế phẩm với 7 chế phẩm chứa vi khuẩnBacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 và 7 chế phẩm chứa vi khuân Klebsiellapneumoniae chủng ĐXTI, 1 nghiệm thức đối chứng là vi khuẩn Ralstonia solanacearum

và 1 nghiệm thức đối chứng nước cat

Điều kiện nhân sinh khối cấp II của vi khuan Bacillus amyloliquefaciens chủngĐXT6 đạt tối ưu trên môi trường cám gạo kết hợp với mật rỉ đường ở nhiệt độ 35°C, pH = 7

và trong thời gian 36 giờ; vi khuẩn Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 tăng sinh khối tối

ưu trên môi trường cao nam men kết hợp mật rỉ đường ở nhiệt độ 35°C, pH = 7 và trong thờigian 48 giờ Trong điều kiện phòng thí nghiệm tai thời điểm 28 ngày sau tồn trữ chế phẩmhumic kết hợp bột talc chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 vaKlebsiella pneumoniae chủng ĐXTI cho hiệu quả phòng trừ bệnh tốt nhất

ill

1 1„]: Cổ? G3/6HDseesseniirsstihtdobriDtAEGEGISHHHHDTHOIGRIGSEUSSNGBMNNGEGHEENIRHNSSISNHHR-GSHQDS/Đ4H0WGG/20800100088 3

I9 24 3

WN BCA TƠ bssssdsegneasosgrdngpobaSriaxisbodgirlgtsgirgoozsusiggisplgrrgicsraiggousiclzge601304kinzaxgg2t0esaalgiagzsfgoagssitpzmesdgri 4

1.2 Tổng quan về bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solana€eafHim - 41.2.1 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solaniaC€@FMI -5:-2- 252: 41.2.2 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh 2-22 2 S2+E£SE2E22E2EE2E22E22222222222z2zze 4

1.2.3 Bins PhAp phịng TH ::¿‹¿sscccseseterkeioeeeie-lnncusoralAubsbsuSEidesoosifSuinvsdikeiuSiidi0 giBnKiRnggoi.00401208,588 >

1.3 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia soÏand€€đf'IIM - 2-2-5 5252S222+S2E+E2£2£££2+22E2£z£zcs2 5

1.3.1 Lich Sten @hiG i @ WU csccsceascenereneeerenmee nnn sm rece ere eee 5

1.3.2 Đặc điểm cấu tạo va điều kiện phát trién o.oo ccc cccc cece eeeeeeeeeeeeeeeeeeeees 5

1:3.3 Hình thức x4m nhap yao cây ký CHỦ: sec s6 6620265029060644512554)3806401856.0/5085058051840564g56 6

1.4 Tổng quan về vi khuân đối kháng và cơ chế đối kháng . 52552552552 6

SA (9401 0002 2///1 )//27././.22 00 ấnm 6

In uy nh S £AA䌜—œ:.,:: ) Ơ 6

1.4.1.2 Lich sử phát triỂn - 2-5 S S225 25212182525212121212211212121212121111211111212122 0 x6 61.4.1.3 Đặc điểm hình thái - + 2< Ss 2S SE 521121511121211111211121211111111121 12111 0c 71.4.1.4 Đặc điểm sinh học + S225 252521525512121212121121212121211121111212111212121 0x6 71⁄4.1.5 Cơ chế đủi kháng creccceseeeevee ctssvesorenseevenservesvesnsvesiuswsneescievovetsrsnvesersuesiivesiesinves 81.4.2 Vi khudan Klebsiella pneumoniae TNNnnẽnn6a 81.5 Tinh hình nghiên cứu và ứng dung vi khuan Bacillus amyloliquefaciens va Klebsiella

PRENINONN GS cresecesersosspmscnensnrsouruasnensues sousecepenersserarueneueysaeeaeceersmeereseneurennsenmeqpenecourunweeees 9

1.5.1 Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens cc.c.ccsscsssssesesssssesessessesessssvesesseensscssesseses 91.5.2 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae .ccccccccscssesesseseseesesessesesesesesessesessssesees 101.6 Tổng quan về điều kiện nhân sinh khối của vi khuan - 2252552: 111.6.1 Mơi trường và thời gian nuơi CAY oo eee ccc ccs cseesesseesssesseesesesseetesessestsneseseees 11

In — 11

1;6:3: PH M61 TONG anes scasrassncasncasuesssnansewsevensvessesevaespaxvenerssewwrvesneesneesreseerausnmasaunsees 12

1.7 Sơ lược về chế phẩm vi sinh - 2 2 +2+222E+EE2E22E2212522522123121222212122122.2Xe2 12Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 N61 dung nghién CU 15

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên CU 2.0.0 cccccccc ees eeseeeeseeseeessesesesseseseesseeeeesseeeees 15

2.3 Vat liéu thi nghigm 0 15

251.1 Tự eụ, thiêu bị miễn Ws dennncearnnesnconermmcnicinounaensamereneineaniemecstnnnmese ese 15

2.3.2, VậtLliệu NSHIEH CUU -eiesecsinnceseoerezaneerantenantentanemwensediadertainracantednarteincaminasinnedats 16

2.3.3 Hĩa chất và thành phần mơi trường 2-2 2 +2+S£E22E+E£EE2EEEEEE2E22E2EEecxzzcex l6

2.4 Phuong 80) )06)0 i00 TA 18

2.4.1 Khao sát kha năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuan Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều kiện

phong thi mghi6m 00137 18

2.4.1.1 Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng ĐXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều kiện phòng

2.4.1.2 Khao sát nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp của khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều kiện

I81911150160119112071PẸ727Ẹ7.77e7ee ốốốốốốốốốố cn lini i Stnageiartiinlinaian 19

2.4.1.3 Khảo sát mức pH nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 trong điều kiện

0058100130100 19

2.4.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủngPXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trênhat cà chua sau 28 ngày tồn trữ trong điều kiện phòng

00110155: 22

2.4.3.1 Đánh giá hiệu qua chế phâm dang bột chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefacienschủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI phòng vi khuan Ralstonia

solanacearum trên hạt cà chua - - 2201212231111 12121 1111211111111 1 1111221111122 xk 32

2.4.3.2 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm dạng bột chứa vi khuan Bacillus

amyloliquefaciens ching DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trừ vi khuẩn

Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua 5 222121111112 222222221111 1xx zxz 23

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-5222 222222E22xczzzcrxerrcree 253.1 Khảo sát khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều kiện

I91191152/81190115111150PRPRSTSSS ốẽốẽẽ CC TC 25

3.1.1 Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens chung DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 trong

điều kiện phòng thi nghiệm - 2: 2 cceeeseeeesseseeessessesteesseesesssetssssesseseeseeeeeees 25

3.1.2 Khảo sát nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều kiện

phong thi mghi6m 017 27

3.1.3 Khao sát mức pH nhân sinh khối cấp II thích hợp của của vi khuan Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều kiện

0058100131003 — 29

3.2 Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột chứa vi khuân Bacillus

amyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng DXT]1 30

3.3 Đánh giá hiệu qua chế pham dang bột chứa Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6

va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt

cà chua sau 28 ngày t6n trữ trong điều kiện phòng thí nghiệm 2525252 323.3.1 Đánh giá hiệu quả chế pham dang bột chứa vi khuân Bacillus amyloliquefacienschủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI phòng vi khuẩn Ralstonia

solanacearum trên hạt cà chua 22111112 2222222 2111111111152 1111111122211 1x kca 32

3.3.2 Đánh giá hiệu qua của chế phẩm dạng bột vi khuẩn Bacillus amyloliquefacienschủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXT1I trừ vi khuẩn Ralstonia

solanacearum tên lat oã:GHEieesesssasooaayordDEso weacueu mere rauecteens toate 36

KET LUẬN VA ĐÈ NGHI o o 0 ccccccccsccsscsceccceeseeceeeeseeseeseesseseessessessessesseseeees 41TÀI LIỆU THAM KHẢO ccc 52222222212E22125525221221212212112122121 22122121 Xe 42

PHY 00222 — 49

vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 2.1 Danh sách các vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu - 16Bang 3.1 Mật độ quang (ODøoo) của Vi khuan B amyloliquefaciens chủng DXT6 khităng sinh khối trong 5 loại môi trường khác nhau tại các thời điểm ở nhiệt độ phòng

2c 26

Bảng 3.2 Mật độ quang (ODsoo) của vi khuẩn K pneumoniae chủng DXT1 khi tăng sinh

khối trong 5 môi trường khác nhau tại các thời điểm ở nhiệt độ phòng (28 + 2°C) 27

Bảng 3.3 Mật độ quang (ODøsø) của vi khuẩn B amyloliquefaciens chủng DXT6 và K.pneumoniae chủng ĐXTI khi tăng sinh khối ở các mức nhiệt độ khác nhau 28

Bảng 3.4 Mật độ quang (ODsoo) của vi khuẩn B amyloliquefaciens chủng DXT6 và vikhuẩn K pneumoniae chủng ĐXTI khi tăng sinh khối ở các mức pH - 29Bang 3.5 Mật độ quang (OD600) của vi khuẩn B amyloliquefaciens chủng ĐXT6 tạithời điểm 7, 14 và 28 ngày sau tồn trữ chế phẩm - 2 2 2+22+++2z+2zzzzzzzszz: 31Bang 3.6 Mật độ quang (OD600) của vi khuẩn K pneumoniae chủng DXT1 tại thờiđiểm 7, 14 và 28 ngày sau tồn trữ chế phẩm - ¿2 2222 +E22+2E2E2EE2EzZ+zEzzxzzxe2 31Bang 3.7 Hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm chứa vi khuẩn B amyloliquefaciens chủngPXT6 và K pneumoniae chủng ĐXTI trên hạt ca chua tại thời điểm 28 ngày sau tồn

li di rỉ: Tasaesrsoeaortndtrrgreorg0 lo gaA00000 010 000B000900X05000/000020090000206008/Gi 33Bảng 3.8 Hiệu quả trừ bệnh của chế pham chứa vi khuan B amyloliquefaciens chủngĐXT6 và K pneumoniae chủng ĐXTI trên hạt cà chua tại thời điểm 28 ngày sau tồntrữ chế phẩm ¿2-2 2S E22E2E£E2E2E22125221212121211111rrrerr 33

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 (A), vi khuan Klebsiella

pneumoniae ching ĐXTI (B) va vi khuan Ralstonia solanacearum chủng

) SCC) en a ee eee ee a ee ee eee eee 16

Hình 3.3 Mot trưởng nhân sinh khối cần Ts scccccnacasnancssionranssannrenenanmnnnasanscaasannannons 18Hình 2.3 Chế phẩm chat mang sau khi trộn -2- 2+2 22Sz2S£2+2E2EzE22Ezzzzzzzzeex 21Hình 3.1Kha nang phòng bệnh của chế phẩm chứa vi khuan B amyloliquefaciens chủngPXT6 và K pneumoniae chủng ĐXTI với vi khuan R solanacearum chủng CXT3 trên

Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Luong thực và Nông nghiệp của Liên hợp quốc)Lần lặp lại

Ngày sau tồn trữ

Trách nhiệm hữu hạn

Trồng trọt

GIỚI THIỆU

Đặt van dé

Cây họ ca (Solanaceae) bao gồm nhiều loài cây cung cấp thực phẩm trong đờisống con người như cà chua, cà tím, ớt và khoai tây (Angiosperm Phylogeny, 2003).Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng am quanh nam nén thuan loicho cây ho ca sinh trưởng và phát triển Theo thống kê của Chi cục TT & BVTV LâmĐồng (2020), trên địa bàn các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Đà Lạt và Lạc Dương,nông dân xuống giống trồng cây rau họ cà trên diện tích từ 13.300 ha đến gần 13.600

ha, chiếm 25% tong dién tich rau cac loai trén toan tinh Lam Dong Tuy nhién, viéc san

xuất còn gặp nhiều han chế do nhiều tác nhân gây bệnh như nam, vi khuẩn và côn trùnggây hại, nhất là trong bối cảnh biến đổi khí hậu hiện nay rất phù hợp cho sâu bệnh hạiphát triển nhanh chống Trong đó, bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearumgây hại nghiệm trọng trên cây họ cà (Nguyễn Tat Thắng va Đỗ Tan Dũng, 2011)

Việc phòng trị bệnh héo xanh thường rất khó khăn do vi khuẩn gây bệnh có phạm

vi ký chủ rộng, chúng có khả năng tồn tại rất lâu trong tàn dư thực vật và trong đất (Vũ

Triệu Mân, 2007) Tuy nhiên sử dụng thuốc bảo vệ thực vật làm tăng tính kháng củamam bệnh, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng sức khỏe con người do lượng hóa chấttồn dư trên nông sản Phát triển ngành nông nghiệp theo hướng xanh và bền vững là vấn

đề tất yêu của mọi quốc gia và phân bón hữu cơ sinh học đang là giải pháp ưu thế đượcnhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới(Bhardwaj và ctv, 2018) Nên việc sử dụng các biện pháp sinh học để xử lý bệnh câyngày càng được day mạnh do biện pháp phòng trừ sinh học làm tăng năng suất cây trồng,thân thiện với môi trường và phù hợp với xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp

II và tạo dạng chế phẩm của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và Klebsiellapneumoniae phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên

cay họ ca” được thực hiện.

Mục tiêu

Khảo sát điều kiện nhân sinh khối cấp II và tạo chế pham dang bột của vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens chung DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXT 1 phòng

trừ vi khuan Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây ho ca.

Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện trên hai vi khuẩn có lợi Bacillus amyloliquefaciens

chủng DXT6, Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 và vi khuẩn hai Ralstonia

solanacearum gay bệnh héo xanh trên cây họ cà do phòng thí nghiệm Bộ môn Bao vệ

Thực vật cung cấp

Đề tài chỉ đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh của chế phẩm dang bộtchứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng ĐXT6 va Klebsiella pneumoniaechủng ĐXTI sau thời gian tồn trữ trên hạt cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu tổng quan về cây họ cà

Cây họ ca có tên khoa học là Solanaceae, là một loại thực vật có hoa Tên khoa

học của họ này có nguồn gôc từ tiêng Latinh Solanum, nghĩa là “cây cà được”.

Ở Việt Nam, họ cà gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ, phân bố rộng khắp cảnước Một số loài được trồng dùng làm thực phẩm (ca tim, cà pháo, ca chua, khoai tây),gia vi (ớt), cây công nghiệp (thuốc lá) hoặc cây dược liệu

1.1.1 Cây cà chua

Cây cà chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum L., thuộc ho cà

(Solanaceae) là một loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ Theo Somraj và ctv

(2017); Nalla và ctv (2016) thì cà chua là một loại cây rau quan trọng, phổ biến và được

trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và

ôn đói.

Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2020), diện tích trồng cà chua trên thế

giới vào khoảng 5.051.983 ha với sản lượng 186.821.216 tan Là cây rau có giá trị, có sảnlượng chiếm 1/6 tổng sản lượng rau hàng năm trên thé giới và luôn đứng ở vị trí số 1 vềsản lượng Cà chua có tầm quan trọng chỉ sau khoai tây ở nhiều quốc gia và đứng thứ nhất

về rau được bảo quản, chế biến và cả mục đích sử dụng tươi

1.1.2 Cây khoai tây

Khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ cà (Solanacea) có

nguồn gốc xuất xứ ở dãy Andes Khoai tây được trồng lâu đời ở Nam Mỹ và được đưavào châu Âu từ thé ki 16 Sau đó, khoai tây được trồng ở nhiều nơi và dần trở thành câylương thực chủ đạo Ở nước ta, khoai tây được du nhập vào từ người Pháp đầu thế kỉ 19

Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2020), điện tích trồng khoai tây trên thế

giới vào khoảng 16.494.810 ha với sản lượng 359.071.403 tan

3

1.1.3 Cây ớt

Cây ớt (Capsicum annuum L.) có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ.Cây ớt có mặt ở nước ta được du nhập từ Trung Quốc, Án Độ Diện tích phân bố khárộng rãi, tập trung ở miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam diện tích trồng ớt còn phân

tán.

Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2020) cây ớt được xem là một trongnhững cây trồng quan trong của vùng nhiệt đới Diện tích trồng ớt trên thế giới vàokhoảng 2.069.990 ha cho mục đích lay quả tuoi với sản lượng 36 136.996 tan

1.2 Tổng quan về bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.2.1 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Bệnh phát sinh từ cây non đến khi thu hoạch Triệu chứng thường biểu hiện ngaysau khi vi khuân xâm nhập vào cây Ở cây bị bệnh, ban ngày lá mat màu nhẫn bóng, táixanh, héo cup xuống Ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toàn cây, còn ở giaiđoạn trưởng thành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước Ở 1 — 2 ngày đầu cây

có thể phục hồi lại được vào lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2 — 3 ngày lá héokhông thể hồi phục lại được nữa và toàn cây bi héo rũ rồi chết

Vỏ thân gần gốc của cây bị bệnh san sùi, khi cắt ngang thấy bó mach bị hóa nâu

Trong điều kiện âm độ cao, thân cây bị bệnh dần dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cat

có thé thay dich nhay vi khuẩn tiết ra mau trang sữa Rễ có màu nâu den và thối

(Kucharek, 1998).

1.2.2 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh

Thời gian vi khuẩn tồn lưu trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố như âm độ, nhiệt

độ, hóa lý đất Vi khuẩn có thê tồn lưu trong đất từ 5 — 6 năm, trong cơ thê ký chủ thựcvật hoặc trong hạt giống có thé sống tới 7 tháng, còn nêu bám dính trên bề mặt hat chitồn tại 2 — 7 ngày (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998)

Bệnh héo xanh phát sinh phát triển phụ thuộc vào điều kiện đất đai như trên các

chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân đất thấp, đất được luân canh với lúa nước

làm giảm tỷ lệ bệnh đáng kê (Đỗ Tan Dũng, 2001)

Thời vụ trồng cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh, thời

vụ trồng có mưa nhiều, ẩm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh Mật độtrồng cao tỷ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phát

sinh phát triển bệnh

1.2.3 Biện pháp phòng trừ

Việc phòng trị bệnh héo xanh thường rất khó khăn do chúng có phạm vi ký chủrộng, có kha năng lưu tồn rất hữu hiệu trong dat (Đỗ Tan Dũng, 2001) Luân canh câytrồng không phải ký chủ của vi khuân R solanacearum là một trong những giải phápquan trọng giúp giảm mật độ vi khuẩn trong đất và hạn chế tối đa nguồn bệnh từ các tàn

dư thực vật ở vụ trước Xử lý và cải tạo đất bằng việc bón tăng cường phân chuồng, lưuhuỳnh, canxi cũng đem lại những kết quả khác biệt (Kelman và ctv, 1994)

Sử dụng vi sinh vật đối kháng như Bacillus sp., Pseudomonas sp dé xử li hạt

trước khi gieo, nhúng rễ cây con trước khi trồng hoặc đưa vi sinh vật đối kháng vào

vùng rễ sau trồng làm ức chế, canh tranh và tiêu diệt vi khuân R solanacearum bướcđầu mang lại hiệu qua đáng ké (Trương Thị Hồng Hai và Trần Viết Thắng, 2014)

Biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vật được cho là ít có hiệu quả trong phòngchống vi khuẩn R solanacearum do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gâybệnh và sinh sản trong hệ thống mạch dẫn của cây (Đỗ Tấn Dũng, 2006)

1.3 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gay hai hơn 200 loai thực vat Đây là loài vi khuẩngây bệnh mạch dẫn được nghiên cứu bởi Halted vào năm 1892 Đến năm 1896, tiếp tục

được Erwin Frink Smith nghiên cứu, mô tả và định tên Ralstonia solanacearum Thời gian

sau đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu vào nghiên cứu bệnh do vi khuẩn

R solanacearum gây ra một cách toàn diện hơn, phải kề đến như là Kelman (1952; 1954),Hayward (1960; 1964; 1976), Yabuuchi (1992), (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998)

1.3.2 Đặc điểm cấu tạo và điều kiện phát triển

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuân gram am, hinh que, hai dau hoi

tròn, có lông roi ở một đầu, kích thước tế bào 0,5 —1,5 um Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt

5

độ 25 — 35°C, nhiệt độ tối đa là 41°C, nhiệt độ tối thấp 10°C, nhiệt độ gây chết là 55°C.

Vi khuẩn phát triển trên phạm vi rộng pH = 6,8 — 7,2 (Vũ Triệu Man, 2007)

1.3.3 Hình thức xâm nhập vào cây ký chủ

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vao câyqua vết thương hoặc qua lỗ thở tự nhiên, vết nứt đầu rễ và di chuyển vào trong bó mạch,sau đó phá bó mạch làm tắc nghẽn sự vận chuyền nước và chất đinh dưỡng gây ra bệnhhéo xanh trên các cây họ cà, mạnh nhất khi cây đang trong giai đoạn phát triển (Vũ Triệu

Mân, 2007).

1.4 Tổng quan về vi khuẩn đối kháng và cơ chế đối kháng

1.4.1 Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

1.4.1.1 Phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey (Vos và ctv, 2009), Bacillus amyloliquefaciens

được phân loại như sau:

Giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae, chi

Bacillus, nhóm Bacillus subtilis, loài Bacillus amyloliquefaciens.

1.4.1.2 Lich sir phat trién

Bacillus amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện đầu tiên vào năm 1943 nhờkhả năng sinh œ-amylase va protease Tại thời điểm đó B amyloliquefaciens được xem

như một dòng khác của loài Ö subtilis hay loài phụ B subtilis subsp amyloliquefaciens.

Welker và Campbell (1967), đã chứng tỏ vi khuẩn Ö amyloliquefaciens có nhữngđặc điểm hình thái và sinh học khác với B subtilis có kha năng phát triển trong khi nồng

độ muối NaCl đến 10%, kha năng lên men lactose tạo acid và kết quả khi lai DNA giữa

B subtilis W23 và B amyloliquefaciens F cho thay sự tương đồng DNA giữ hai loài này

chỉ 14,7 — 15,4%.

Đến năm 1987, B amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng dựa

trên kết quả lai DNA của B amyloliquefaciens so với các loài có quan hệ gần với chúng

như Ö sbtilis, B licheniformis và B pumilus lần lượt đạt và tỉ lệ tương đồng là 23%,

15% và 5% (Priest và ctv, 1987).

Borriss va ctv (2010), đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số sosánh hệ gen bang kỹ thuật microarray Borriss đã đề xuất tách loài

B amyloliquefaciens này thành 2 nhóm loài phụ là B amyloliqueafaciens subsp.

plantarum (có khả năng sông nội cộng sinh trong rễ cây thực vat) và B.amyloliqueafaciens subsp amyloliquefaciens (không có kha năng sống nội cộng sinh

trong rễ cây thực vật).

1.4.1.3 Đặc điểm hình thái

Những mô tả về hình thái của Bacillus amyloliqueafaciens được cung cấp dưới

đây dựa theo Welker va Campbell ,1967 va Gordon và ctv, 1973.

Bacillus amyloliqueafaciens là vi khuân hiéu khí, gram dương, hình que, có kích

thước tế bao 0,7 — 0,9 um x 1,8 — 3,0 um, có khả năng di động Các tế bao có thể đứngriêng lẻ hoặc xếp đôi với nhau, có nhiều roi và có khả năng sinh nội bao tử

Nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

B amyloliqueafaciens từ 30°C đến 40°C Chúng không thé sinh trưởng và phát triển khi

nhiệt độ môi trường xuống thấp dưới 15°C hoặc trên 50°C (Priest va ctv, 1987) Trongđất, 8 amyloliquefaciens chủ yếu định vị ở vùng rễ của nhiều loài cây, tạo thành lớpmàng sinh học (biofilm), hoặc nội sinh trong mô và nhiều dòng có khả năng kích thíchtăng trưởng và bảo vệ cây đối với nhiều mầm bệnh Vi sinh vật cũng hiện diện biểu sinh.Các dòng nội sinh và biểu sinh là nguồn tác nhân tiềm năng trong phòng trừ sinh họcbệnh cây và khả năng tạo bao tử là ưu thé trong việc sản xuất chế phẩm

Trên môi trường LB thạch: khuẩn lạc dang tròn, có màu trắng sữa, bề mặt khuẩnlạc khô, lồi va san sùi Mép khuẩn lạc có dang hình răng cưa không đều Khuan lạc bámchắc vào bề mặt thạch sau 2 ngày nuôi cấy, kích thước khuẩn lạc khá lớn và không đồngđều (Hình 2.1A) Trên môi trường LB lỏng: B amyloliqueafaciens phát triển làm đụcmôi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn và kết lại như vấn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc

1.4.1.4 Đặc điểm sinh học

B amyloliqueafaciens có khả năng tăng trưởng ở nồng độ 7% NaCl và nhiềuchủng chịu được nồng độ lên đến 10% NaCl (Welker và Campbell ,1967) Tương tự

như loài Bacillus khác, nội bao tử có thé tồn tại trong một gian dai cho đến khi điều kiện

môi trường thuận lợi cho sự tăng trưởng.

B amyloliqueafaciens có khả năng phân hủy myo-inositol hexakisphosphate giúp

gia tăng độ phì của đất trồng, đóng góp một cách có ý nghĩa đến dinh dưỡng phosphotrong cây và còn sản xuất các hợp chất kháng sinh như: bacillomycin D, surfactin,bacillaene, các enzyme ngoại bào, các chất kích thích sinh trưởng thực vật và các chấthoạt động bề mặt, bởi chúng giúp bảo vệ cây trồng khỏi các sinh vật gây bệnh

Bên cạnh đó, proteases va amylases được sản xuât bởi B amyloliqueafaciens

cũng được ứng dụng trong công nghiệp (Priest và ctv, 1987).

1.4.1.5 Cơ chế đối kháng

B amyloliqueafaciens sản xuất các chất kháng nam và kháng khuẩn, các enzymengoại bào, các chất kích thích sinh trưởng thực vật và các chất hoạt động bề mặt giúpbảo vệ cât trồng khỏi các sinh vật gây bệnh Chúng sản xuất các hợp chất có hoạt tínhđối kháng nấm và kháng khuẩn như: bacillomycin D, surfactin, bacillaene Bacillomycin D gây ra nhưng thay đối về cau trúc bề mặt màng tế bào và thành tế baocủa vi nam, giảm tích lũy oxy trạng thái hoạt tính (Gu, 2017) Iturin, fegycin và surfactin

là các lipopeptide vòng có tính kháng nam gây bệnh cây (Kadaikunnan và ctv, 2015).Surfactin là chất hoạt động như chat tay trên màng tế bao, chat nay có tính kháng khuẩn,

khang virus va kháng viêm.

1.4.2 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

Vi khuẩn K pneumoniae thuộc ho Enterobacteriaceae là vi khuẩn gram âm,

không di động và thuộc loại là vi khuẩn ky khí không bắt buộc (Kuswiyanto, 2016), códạng hình que, có kích thước 0,5 — 0,8 um x 1 — 2 pm, vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ

từ 15 đến 40°C, phát triển tối nhất ở nhiệt độ 35 — 37°C Vi khuẩn phát triển trên phạm

vi rộng pH = 6,5 — 7 (Prescott va ctv, 2009) Vi khuẩn K pneumoniae thường xuất hiện

tự nhiên trong đất, nước, gây bệnh cho người, động vật và một số xâm nhập vào câytrồng và sống nội sinh trong cây (Podschun và ctv, 2001) Khoảng 30% loài thuộc

K pneumoniae có khả năng cô định đạm trong điều kiện ky khí

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và

Klebsiella pneumoniae

1.5.1 Vi khuan Bacillus amyloliquefaciens

Theo nghiên cứu Thai Thành Được và Nguyễn Hữu Hiệp (2022), cho thay rang

ở nghiệm thức chủng vào dat với vi khuẩn cố định đạm kết hợp bón 75% NPK giúpchiều cao, đường kính gốc thân, chỉ số diệp lục ở lá, số lá, khối lượng chất khô, khốilượng 1000 hạt và năng suất hạt bắp tương đương với nghiệm thức chỉ bón 100% NPK.Như vay, việc chủng vi khuân Bacillus aryabhattai ADR3 và Klebsiella pneumoniaeDNRð vào hat bắp giúp tiết kiệm đến 25% lượng phân đạm cho cây bắp lai

Theo Huỳnh Văn Nghi (2014), đã nghiên cứu thành công với chế phẩm dạng bột

từ dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens dé phòng trị bệnh hại trên cây ớt Kết quảcho thấy, chế phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử càng cao sẽ sống sót càng lâu theo thời giantồn trữ Trong đó, chế phẩm chứa 100% nội bào tử vẫn duy trì mật số 8,91x108 CFU/gđến 7 tháng tồn trữ và vẫn còn hiệu lực khi đưa ra thí nghiệm ngoài nhà lưới

Các nghiên cứu của trường Đại học Cần Thơ, đã tuyển chọn được nhiều chủng

vi khuẩn vùng rễ thuộc chi Bacillus có thé kiểm soát nhiều loại bệnh đo nắm và vi khuẩngây ra trên nhiều loại cây trồng Ching Ö amyloliquefaciens-Bal có hiệu quả kiểm soátbệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bệnh héo rũ do nam F.oxysporum trên cà chua và ớt cả trong nhà lưới và ngoài đồng (Tran Vũ Phến và ctv,

2008, Trần Vũ Phến và ctv, 2010)

Các nhà khoa học trên thế giới cũng không ngừng nghiên cứu dé tuyển chọn các

vi sinh vật đối kháng mang những ưu điểm vượt trội phòng trừ bệnh hại cây trồng TheoPark và ctv (2003), đã nghiên cứu cho thay rang Bacillus amyloliquefaciens có khả năngkích kháng phổ rộng, kháng lại các nắm bệnh do virus, vi khuẩn và nam gây ra, có hiệuquả cao trong kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuan Ralstonia solanacearum và héo donam Fusarium spp trên cà chua Các loài thuộc Bacillus như B amyloliquefaciens, B

subtilis, B pateurii, B cereus, B pumilus, B mycoides va sphaericus có khả năng khích

kháng hay đối khang giúp giảm bệnh đo nhiều tác nhân và trên nhiều loại cây trồng khácnhau (Kloepper và ctv, 2004) Theo Gnanamanickam và ctv (2008), đã cho thấy vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens FZB42 kiểm soát được vi khuân héo rủ Ralstonia

solanacearum ở cà chua.

Theo Park và ctv (2006), thì Bacillus amyloliquefaciens có tác dung ức chế bệnhhéo xanh vi khuẩn R solanacearum trên cà chua trong 4 tuần sau xử lý Trong thínghiệm, vi khuẩn gây bệnh được chủng vào rễ cây cà chưa 20 ngày tuổi và vi khuẩnđược chủng trước đó 7 ngày, kết quả cho thay vi khuẩn không chi ức chế hiệu quả bệnhhéo xanh mà còn giúp gia tăng chiều cao cây Một số nghiên cứu trong nước về ứng

dụng của Bacillus sp trong phòng trừ sinh học bệnh cây trồng: Bacillus

amyloliquefaciens có hiệu quả đối với bệnh thối củ gừng do vi khuẩn R solanacearum(Trần Văn Nhã, 201 1) Vi khuẩn B brevis có hiệu quả kiểm soát bệnh vàng lá thối củsừng do nam Fusarium spp (Trần Thị Thúy Ai, 2011)

Theo Tan va ctv (2012), hai chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefacien CM-2

và T-5, có khả năng đối kháng với Ralstonia solanacearum (RS) gay bệnh trong ốngnghiệm Cả hai chủng CM-2 và T-5 đều cho thấy tác dụng kiểm soát sinh học và thúcđây tăng trưởng mạnh đối với cây giống cà chua Hiệu quả kiểm soát sinh học tốt nhấtthu được bằng cách xử lý cả cây con và đất bằng các tác nhân kiêm soát sinh học Sovới đối chứng, tỷ lệ mắc bệnh giảm lần lượt là 70,1 và 79,4% đối với CM-2 và T-5.Các chủng vi khuan B amyloliquefaciens, B pumilus và S marcescens trong ché phâmbột talc, mun cưa và vỏ trau cho thay khả năng sống sót tốt trong 9 tháng tồn trữ Đồngthời, khi xử lý các chủng này cho thấy sự tăng cường các hoạt động của các enzyme liênquan đến phòng vệ như phenyl alanin amonio lyase, peroxidase, chitinase và a-1,3-

glucanase trong lá chè (Chakraborty va ctv, 2013) Trong nghiên cứu của Wu (2015),

đã chỉ ra rằng difficidin va bacilysin từ 8 amyloliquefaciens FZB42 có hoạt tính khangkhuẩn chống lại Xanthomonas oryzae pv oryzea va Xanthomonas oryzae pv oryzicola

1.5.2 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

Theo nghiên cứu của Iniguez và ctv (2004), tất cả các chỉ tiêu cần thiết cho việcchứng minh kha năng có định đạm ở cây lúa mì (Triticum aestivum L.), cây trồng quantrọng nhất trên thế giới, được thé hiện khi cấy vi khuẩn cố định dam, Klebsiellapneumoniae 342 (Kp342) Kp342 làm giảm các triệu chứng thiếu nito (N) và tăng nồng

độ N và N tổng số trong cây Quá trình cố định đạm được xác nhận bằng cách pha loãng

10

đồng vị 15N trong mô thực vật và trong sản phẩm thực vật, chất diệp lục Tất cả những

quan sát này đều trái ngược với cây không được cấy, cây được cấy đột biến cô định damKp342 và cây được cấy tế bào Kp342 đã chết Nitrogenase reductase được sản xuất bởiKp342 trong không gian bào của vỏ rễ Loại hoang dã Kp342 và đột biến nifH đã xâmchiếm phần bên trong của rễ lúa mì với số lượng bằng nhau trên cơ sở trọng lượng tươi

Theo nghiên cứu cua Liu va ctv (2011), Klebsiella pneumoniae NG14 được phân lập từ

bề mặt rễ lúa cho thấy NGI14 chứa gen nifH có hoạt tinh nitrogenase, hoạt tính có định15N2 và có khả năng có định trên bề mặt rễ của cây lúa

1.6 Tong quan về điều kiện nhân sinh khối của vi khuẩn

1.6.1 Môi trường và thời gian nuôi cấy

Thành phần môi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đếnhoạt động sống cũng như khả năng duy trì hoạt tính sinh học của vi sinh vật Theo Okafor(2007), môi trường lỏng thường được sử dụng trong nhân nuôi vi khuẩn Môi trườngcần đáp ứng đầy đủ yêu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn, cũng như các mục đích kỹ thuậtcủa quy tình sản xuất Dinh dưỡng phải được thiết lập sao cho thúc day hiệu quả nhất

sự tổng hợp sản phẩm

Môi trường cần đáp ứng điều kiện dinh dưỡng sao cho vi khuẩn rút ngắn đượcgiai đoạn chuẩn bị, sau đó phát triển dé cho sinh khối Trong nghiên cứu, vi khuẩnthường được nhân nuôi môi trường tổng hợp với hóa chất tinh khiết, nhưng trong sảnxuất môi trường có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng Trong sản xuất, cần chú ý chọnnguồn cung cấp thành phan dinh dưỡng sao cho có chi phí thấp, luôn hữu dung, có chấtlượng ồn định và thuận lợi cho quá trình xử lý sau nhân nuôi (Dahod và ctv, 2010)

Theo Nguyễn Đức Lượng va ctv (2006), thời gian là yếu tố quan trọng ảnh hưởngđến sinh khối, xác định thời điểm thu sinh khối của vi khuẩn nhiều nhất có ý nghĩa thực

tế trong việc tạo chế phẩm sinh học

1.6.2 Nhiệt độ

Theo Nguyễn Thị Lam Đoàn (2021), nhiệt độ là một trong những yếu tổ thenchốt, tác động trực tiếp đến khả năng sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Mỗi vikhuẩn phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất định Nhiệt độ quá thấp một số vi khuẩn

11

không phát trién được nhưng vẫn còn sống, ở nhiệt độ quá cao cũng có thé gây chết visinh vật do sự biến tính của các protein và vật chất di truyền.

1.6.3 pH môi trường

Bên cạnh yếu tô về môi trường, thời gian và nhiệt độ thì độ pH của môi trườngcũng có tác động rất lớn đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật Trong các thông sốảnh hưởng đến quá trình lên men, pH là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng và quá trình trao đổi chat

1.7 Sơ lược về chế phẩm vi sinh

Theo Stephens và Rask (2000), các chế phẩm vi sinh cần kết hợp các thông sốvật li, hóa học và sinh hoc dé đảm bảo các chủng vi khuẩn khi sử dung có mật số cao vaduy trì lâu dài khi sử dụng trong các khoảng thời gian tối thiểu Chế phẩm vi sinh đượcsản xuất và theo nhiều hướng, nhiều dạng khác nhau phụ thuộc vào điều kiện sản xuất

và mục đích sử dụng Nhưng nhìn chung việc sản xuất chế phẩm vi sinh đều theo mụcđích: tiện cho người sử dụng và hiệu quả kinh tế cao nhất (N guyén Xuân Thành, 2003)

Các chế phâm thường có các dang bột, dang lỏng và dang hạt Các chế phẩmdang hat hầu hết được sản xuất từ than bùn, từ khoáng như silica, zeolite Chế phẩmdang lỏng chủ yếu sử dung nước và một số thành phần như khoáng va dầu hữu cơ, cóquy trình sản xuất đơn giản với nhiều thuận lợi như giá thành nguyên liệu thấp do quy

mô sản xuất nhỏ (Bashan, 1998; Singleton va ctv, 2002; Albareda va ctv, 2008) Tuynhiên, tỉ lệ sóng sót của vi khuẩn trong chế phẩm dang long thấp vì kỹ thuật này không

cung cấp môi trường bảo vệ cho các vi khuẩn Ngoài ra, môi trường lỏng đễ bị tạp nhiễm

trong suốt quá trình trữ, vận chuyên và ứng dụng vào đất (Bashan và ctv, 2002)

Dựa trên cơ chất nuôi vi khuẩn chế phẩm vi sinh còn có thé phân thành các loạisau: chế phẩm nhân nuôi trên cơ chất gelatin, dịch thể, khô, đông khô và bột (NguyễnXuân Thành, 2003) Trong đó, chế phẩm dạng bột được hầu hết các nước trên thế giớisản xuất Vì quy trình sản xuất đơn giản, dé làm, ít tốn kém, giá thành thấp, nguyên liệu

có sẵn trong tự nhiên, mật số vi sinh vật còn hiệu lực trong chế phẩm cao Sinh khối visinh vật được chủng vào chất mang các hợp chất hữu cơ hoặc vô co tự nhiên hoặc tổnghợp có tác dụng làm nơi cư trú và bảo vệ sinh vật trong chế phẩm từ khi sản xuất đến

12

khi sử dụng Đặc biệt, dạng chat mang này thích hợp với những vi khuẩn gram dương

có khả năng sinh nội bào tử trong điều kiện khô han (N guyén Xuân Thanh, 2003)

Trong chế phẩm vi sinh bao gồm chất mang và kèm theo một số thành phần khác.Theo Smith (1992), ngoài việc chất mang phải đảm bảo hai tính chất cơ bản là hỗ trợtăng trưởng của vi sinh vật và duy trì mật số mong muốn của các chủng vi sinh vật trongkhoảng thời gian chấp nhận được, thì cần đảm bảo tính khả thi và tính kinh tế khi thựchiện Chat mang phải có khả năng giữ nước cao, không độc với các dòng vi khuẩn chủngvào và an toàn đối với môi trường

Nhiều chất mang khác nhau được nghiên cứu sử dụng như đất khoáng (Chao và

Alexander, 1984), phụ phẩm cây trồng (Sparrow và Ham, 1983), đất sét (Graham-Weiss

và ctv, 1987), liginite, một số loại than đá (Paczkowski va Berryhill, 1979), phân động

vật, đá phosphate, bột talc (Bashan, 1986).

Talc: còn được gọi là hoạt thạch hay magnesium silicate, có công thức hóa học

Mg:(SuOio)(OH›), với các thành phần: MgO (31,7%); SiO; (63,5%); HạO (4,8%)(Nguyễn Văn Chiến, 1961) Bột tale được sử dụng nhiều trong nghiên cứu các công thứctồn trữ vi khuan bởi chúng có hiệu quả nhiều trong việc duy trì mật số tế bao trong thời

gian ton trữ Ngoài vai trò là chất mang cho vi khuẩn bám vào, bột talc hòa với thành phan

có magnesium là một loại khoáng giữ vai trò quan trọng trong việc ồn định ribosome,màng tế bao, acid nucleic và cần cho hoạt động của các enzyme Do đó có thể xem bộttalc là nguồn khoáng bồ sung cho môi trường tồn trữ vi khuân (Nguyễn Văn Chiến, 1961)

Cám gạo: gồm lớp aleurone và những lớp vỏ gạo với một số chất nội nhũ đượcsinh ra từ quá trình nghiền Lớp này chiếm khoảng 12% khối lượng hạt, chứa nhiềuprotid, tĩnh bột, cellulose, pentosan, các giọt lipid, phần lớn các vitamin và khoáng củahạt Cám xay, có khả năng kích thích sự nảy mam của tế bao, làm cho tế bào chuyền từtrang thái ngủ sang trạng thái hoạt động dẫn đến sự tăng sinh của các tế bào sinh dưỡng

(Saunders, 1985).

Humic: gồm C, H, O, N Hàm lượng nguyên tố này khác nhau dựa vào loạiđất, thành phần hóa học của tàn du sinh vật, trong điều kiện mun hóa: C: 56,2 — 61,9%;H: 3,4 - 4,8%; O: 29,5 — 34,8%; N: 3,5 — 4,7% Humic là thành phan của hợp chấtmùn và là hợp chất có trọng lượng phân tử lớn hình thành chất đa điện phân có đặctính hút nước, gọi là hợp chất mùn Chúng có vai trò tạo nên cấu trúc đất tơi xốp, khả

13

năng giữ nước, sự trao đôi ion va cation và liên quan mật thiệt dén quá trình chelate

các khoáng chất

Biochar: còn được gọi là than sinh học được sản xuất từ quá trình nhiệt phân sinhkhối và được ứng dụng dé có định nguồn carbon nhằm giảm thiểu khí CO; thải vào khíquyền Thành phan chính của than sinh học là hydro, oxy và nguồn carbon phong phú(70 — 80%) (Gao va ctv, 2019) Than sinh học có thé làm tăng độ phì nhiêu cua đất, cảithiện tinh chất hóa lý của đất và thay đổi sự đa dạng vi sinh vật trong đất cũng như thành

phan quan xã (Graber và ctv, 2014) Biochar giúp tăng khả năng giữ chất dinh dưỡng,

giảm độ chua của đất, thay đồi hệ thống vi sinh vật cũng như cấu trúc đất tốt hơn (Elad

va ctv, 2010) Ngoài ra, biochar còn là được làm vật liệu chất mang rất hiệu quả thaythé cho các vật liệu chất mang khác đã sử dụng phổ biến trước đây như than bùn valignite vì những vật liệu chất mang được sử dụng trước đây là nguồn tài nguyên khôngtái tạo và chúng thải ra một lượng lớn CO> vào khí quyền gây ra hiệu ứng nhà kính Cautrúc biochar có những kẽ hở và lỗ hỏng giúp bảo vệ sinh tồn tại trong thời gian dài

Carboxymethylcellulose (CMC): là dẫn xuất hòa tan của cellulose, dé bi thủyphân bởi các enzyme cellulose của sinh vật, CMC được dùng dé xác định khả năng sảnxuất các enzyme phân hủy cellulose không kết tinh của các sinh vật (Paul va Diana,1993) CMC có nhiều công dụng khác nhau như g1ữ nước, tạo đặc, chất phụ gia, ồn địnhhuyền phù nên được dùng dé bảo vệ hệ bùn trong khoan dầu khí CMC tinh khiết đượcdùng trong hóa dược, hóa mỹ phâm (Hồ Sỹ Tráng, 2003)

Calcium Carbonate (CaCO3): có hoạt tính làm tăng pH môi trường, do đó trong

các công thức tồn trữ vi khuẩn thường chứa CaCO; dé giúp 6n định pH Ti lệ trộnCaCO:: chất mang thường là 15:1000 dé 6n định pH ở mức trung tính (Vidhyasekaran

và Muthamilan, 1995; Bharathi và ctv, 2004).

Chitosan là một hợp chất cao phân tử sinh học, cấu tạo bởi hàng ngàn gốcGlucosamine, được thủy phân từ chat Chitin có trong vỏ cứng của các loài giáp xác vacôn trùng Nếu thủy phân đến cùng sẽ tạo ra Glucosamine, Chitin, Chitosan vàOligoglucosamine là những sản phẩm sinh học không độc, có khả năng phân hủy trong

tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trường, có hoạt tính sinh học cao, nhóm độc IV, không

độc với người và môi trường (Vòng Bình Long, 2009).

14

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát điều kiện nhân sinh khối cấp II của vi khuân Bacillus amyloliquefaciens

chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae ching DXT1.

Khao sát nguyên liệu lam chất mang tạo chế phẩm dang bột chứa vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumonia chủng DXT1.

Đánh giá hiệu quả chế phẩm dang bột chứa vi khuan Bacillus amyloliquefacienschủng ĐXT6 và Klebsiella pneumonia chủng ĐXTI với vi khuẩn Ralstoniasolanacearum gây bệnh héo xanh trên hạt cà chua sau 28 ngày tồn trữ trong điều kiện

phòng thí nghiệm.

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2023 đến thang 08 năm 2023

Thi nghiém duoc tién hanh tai phòng thí nghiệm Bộ môn Bao vệ Thực vật, KhoaNông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

(SSL1, Stuart, Anh), máy NanoVueTM Plus (SCIE-PLAS LTD, Biochrom, Anh), May

lắc Vortex — ZX3 (Velp, Y)

15

2.3.2 Vật liệu nghiên cứu

Các vi khuẩn được cung cấp tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật.Bảng 2.1 Danh sách các vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất: cồn 70%, cồn 96%, agar, peptone (Trung Quốc), glycerol (Trung Quéc),

NaCl (Trung Quốc), cao nam men (Việt Nam), chitosan (Việt Nam), CaCO; (Trung Quốc),

CMC (Japan).

Thanh phan môi trường

Mật ri đường: Công ty TNHH Thiên Thao Hân Thành phan: sucroza 44%, glucoza

13%, fructoza 10%, axit amin 3%.

Cám gạo: Công ty TNHH Xây dựng Dich vụ môi trường nguồn sống xanh Thanh

phần: protein, vitamin Bó, vitamin E, canxi, đường, chất xơ tiêu hóa được, calori.

Bột bắp: Công ty cô phan bột — thực phẩm Tài Ký

16

Cao nam men: Công ty TNHH ICFood Việt Nam Thành phan: Total nitrogen > 9%,amino nitrogen > 3%, độ am < 6%, sodium chloride < 2%, pH 5,3 - 7.2.

Biochar: Công ty TNHH MTV xuất khẩu than tự nhiên va than sinh học

Talc: Công ty TNHH Sản xuất Thương mại Nguyên Liệu Công Nghiệp MiềnNam (Simico) Thành phan: 60% SiOa, 30% MgO

Humic: được sản xuất và phân phối bởi Công ty TNHH Sản xuất Thương mại

Dịch vụ công nghệ sinh học Abio Việt Nam.

2.3.4 Một số môi trường thí nghiệm

Môi trường WA (Water Agar): Agar 20 g, nước cat 1000 mL Hap khử trùng ở

Môi trường cao nam men + mật rỉ đường: Mật rỉ đường 7 g, cao nam men 5 g,

nước cat 1000 mL Hap khử trùng ở 121°C

17

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều

kiện phòng thí nghiệm

2.4.1.1 Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 trong

diéu kién phong thi nghiém

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên haiyếu tố gồm 2 vi khuẩn Với 5 môi trường (bột bap + mật ri đường, cám gạo + mật riđường, khoai tây + mật ri đường, cao nấm men + mật ri đường va LB) và 4 mức thờigian (12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ), 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL gồm 20 nghiệmthức và mỗi nghiệm thức là 3 ống nghiệm

|Inmn= pm w

Hình 2.2 Môi trường nhân sinh khối cấp II Bột bắp + mật ri đường (A),

cám gạo + mật rỉ đường (B), khoai tây + mật rỉ đường (C),

cao nắm men + mật rỉ đường (D) va LB (E)

18

Phương pháp thực hiện: Hút | mL dung dịch khuẩn có giá trị ODaoo là 0,3 ở môitrường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trườngnhân sinh khối cấp II sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (Nguyễn Thị Ngọc

Sương va ctv, 2016).

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (OD600) tại thời điểm 12 gid, 24 gid, 36 gid,

48 giờ sau khi nhân sinh khối

2.4.1.2 Khảo sát nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp của khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều

kiện phòng thí nghiệm

Bồ trí nghiệm

Dựa trên thí nghiệm mục 2.4.1.1 chọn môi trường và thời gian tối ưu đề khảo sát

sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến nhân sinh khối của vi khuẩn

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 2 vi khuẩn.Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 3 nghiệm thức ở mức nhiệt độ là 25°C, 30°C và35°C, mỗi nghiệm thức là 3 ống nghiệm

Phương pháp thực hiện: Hút 1 mL dung dịch khuẩn có giá trị ODøoo là 0,3 ở môitrường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trườngnhân sinh khối cấp II tối ưu ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B amyloliquefaciens chủngĐXT6 và K pneumoniae chủng ĐXTI Sau đó lắc 150 vòng/phút ở các mức nhiệt độ25°C, 30°C và 35°C (Nguyễn Thị Ngọc Sương và ctv, 2016)

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (ODøp) sau thời gian nhân sinh khối tối ưu

ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B amyloliquefaciens chủng DXT6 va vi khuẩn

Bồ trí thí nghiệm

Dựa trên thí nghiệm ở mục 2.4.1.1 và mục 2.4.1.2, từ đó chọn môi trường, thời

gian và nhiệt độ tối ưu dé khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sinh khối của vi khuẩn

Thí nghiệm bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố, gồm 2 vi khuẩn.Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 4 nghiệm thức ở mức pH là 6; 6,5; 7 và 7,5 và mỗinghiệm thức là 3 ống nghiệm

Phương pháp thực hiện: Hut 1 mL dung dịch khuẩn ở môi trường nhân sinhkhối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trường nhân sinh khối cấp IItối ưu ở mục 2.4.1.1 với vi khuẩn 8 amyloliquefaciens chủng DXT6 và K pneumoniaechủng ĐXTI Sau đó lắc 150 vòng/phút với nhiệt độ tối ưu ở mục 2.4.1.2 (Nguyễn Thi

Ngọc Sương và ctv, 2016).

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (ODøoo)sau thời gian nhân sinh khối tối ưu

ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B amyloliquefaciens chủng DXT6 va vi khuẩn

K pneumoniae chủng ĐXT 1.

2.4.2 Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột của vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐX T1

Nguyên liệu dùng làm chat mang dang bột chứa vi khuẩn B amyloliquefaciens chủngPXT6 và K pneumoniae chủng DXT1 bao gồm: Cám gạo, tale, biochar và humic được lựachọn với các tiêu chí đễ tìm, giá thành rẻ, giúp vi khuẩn duy trì mật số lâu nhất và hiệu quảphòng trừ bệnh trên hạt ca chua ở điều kiện phòng thí nghiệm (Đặng Hoài An và ctv, 2017)

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơnyếu tố gồm 2 vi khuẩn Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 7 nghiệm thức: Chất mangcám gạo bồ sung 10% chitosan (Cám); chất mang cám gạo bồ sung 10% tale và 10%chitosan (Cám + talc); chất mang tale bổ sung 10% chitosan (Talc); chất mang biochar

bổ sung 10% chitosan (Biochar); chất mang biochar bổ sung 10% talc và 10% chitosan(Biochar + talc); chất mang humic bồ sung 10% chitosan (Humic); chất mang humic bổ

sung 10% tale và 10% chitosan (Humic + talc), mỗi nghiệm thức là 3 túi zip.

20

Hình 2.3 Chế phẩm chất mang sau khi trộn Chất mang cám gạo bé sung 10%chitosan (Cám) (A); chất mang cám gạo bé sung 10% tale và 10% chitosan (Cám +talc) (B); chất mang talc b6 sung 10% chitosan (Talc) (C); chat mang biochar bổsung 10% chitosan (Biochar) (D); chất mang biochar bổ sung 10% tale và 10%chitosan (Biochar + talc) (E); chat mang humic bổ sung 10% chitosan (Humic) (F);

chất mang humic bổ sung 10% tale và 10% chitosan (Humic +talc) (H)

Phương pháp thực hiện

Hỗn hợp chat mang thực hiện theo quy trình của Vidhyasekaran và Muthamilan(1995) với công thức: 1.000 g chất mang + 10 g CMC + 15 g CaCO3 và bồ sung chấtphụ gia có cải tiến với các chất mang khác nhau

Sau đó, phân phối từng loại hỗn hợp chất mang sau khi trộn vào các đĩa petri(5 g/đĩa) và hấp khử trùng 2 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ

Vi khuẩn sau khi nhân sinh khối ở điều kiện tối ưu được tiến hành đo mật độquang (ODsøo) Sau đó, dựa vào kết quả ở đường chuẩn dé pha huyền phù vi khuẩnODsoo = 0,3 (Võ Thi Phương Trang, 2013) Bơm 2 mL huyền phù vi khuẩn đối khángvào đĩa petri chứa hỗn hợp chất mang và trộn đều hỗn hợp Sau đó cho vào tủ sấy ởnhiệt độ 40°C trong thời gian 24 giờ Và tồn trữ trong túi zip ở điều kiện nhiệt độ

phòng 28 + 29C.

21

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (ODsoo) của vi khuan B amyloliquefacienschủng DXT6 và K pneumoniae chủng ĐXTI sau 7, 14 và 28 ngày sau tồn trữ (Cân 1 g

chế phẩm cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cat đã khử trùng, lắc trong 24 gid)

2.4.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefacienschủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI với vi khuẩn Ralstoniasolanacearum trên hạt cà chua sau 28 ngày tồn trữ trong điều kiện phịng thí nghiệm2.4.3.1 Đánh giá hiệu quả chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefacienschủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 phịng vi khuẩn Ralstonia

solanacearum trén hat ca chua

Bồ trí thi nghiệm

Thí nghiệm phịng bệnh được bố trí theo kiểu hồn toản ngẫu nhiên đơn yếu

tố Với 3 lần lặp lại (LLL), với mỗi LLL là 16 nghiệm thức, trong đĩ cĩ 14 nghiệmthức chế phẩm, 1 nghiệm thức đối chứng nước cat và 1 nghiệm thức đối chứng bệnh.Với 7 chế phẩm (Cám, Cam + talc, Talc, Biochar, Biochar + talc, Humic,Humic + talc) chứa vi khuan B amyloliquefaciens chủng DXT6 và 7 chế pham (Cám,

Cam + talc, Talc, Biochar, Biochar + talc, Humic, Humic + talc) chứa vi khuẩn

K pneumoniae chủng DXT1 với mỗi nghiệm thức là 3 dia petri, mỗi dia petri cĩ 10

hạt cà chua.

Phương pháp thực hiện: Theo phương pháp Silva và ctv (2003).

Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây Ủ hạt trên giấy thâm

vơ trùng được làm 4m đặt trong đĩa petri, giữ ở nhiệt độ phịng Huyền phù vi khuẩn

R solanacearum được nhân sinh khối trong mơi trường LB ở nhiệt độ phịng Sau 48giờ, Sau đĩ, dựa vào kết quả ở đường chuẩn dé pha huyền phù vi khuan về mật độquang ODsoo là 0,3 (Hong và ctv, 2012) Tiếp theo pha lỗng chế phẩm, cân 1 g chếphẩm cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất đã khử trùng, lắc đều và tiến hành đomật độ quang ODøòo tại thời điểm 28 ngày sau tồn trữ chế phẩm

Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vào dung dịch chế phẩm chứa

vi khuẩn đối kháng đã chuẩn bị trong 30 phút Hạt làm khơ nhanh trên giấy thấm vơ

22

trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuẩn bệnh trong 30 phút Hạt làm khô nhanh trêngiấy thấm vô trùng, đặt vào đĩa môi trường WA ở nhiệt độ phòng.

Chỉ tiêu theo đõi: Do chiều dai thân (mm), chiều dai rễ (mm), khối lượng tươi

(mg), khối lượng khô (mg) tại thời điểm 7 ngày sau khi đặt vào dia petri.

Chiều dai thân (mm): đo từ gốc đến ngọn Chiều dài rễ (mm): đo từ gốc chođến đỉnh rễ dài nhất Khối lượng tươi (mg): cân khối lượng tat cả các cây Khối lượngkhô (mg): cân khối lượng khô của cây sau khi sấy ở 70°C đến khi đạt trọng lượngkhông đổi

2.4.3.2 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens chủng ĐXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 trừ vi khuẩn

Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua.

(Cam, Cam + talc, Talc, Biochar, Biochar + talc, Humic, Humic + talc) chứa vi khuẩn

K pneumoniae chủng DXT1 với mỗi nghiệm thức là 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri có 10

hat ca chua.

Phuong phap thuc hién: Theo phuong phap Silva va ctv (2003).

Chuẩn bị hạt giống, huyền phù vi khuẩn R solanacearum va pha loãng dung

dịch chế pham tương tự mục 2.4.3.1

Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vào huyền phù vi khuẩn bệnh

đã chuẩn bị trong 30 phút Hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, tiếp tục ngâmhạt vào dung dịch chế phẩm chứa vi khuẩn đối kháng trong 30 phút Hạt làm khônhanh trên giấy thấm vô trùng, đặt vào đĩa môi trường WA, đặt ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo đõi: Do chiều dai thân (mm), chiều dai rễ (mm), khối lượng tươi(mg), khối lượng khô (mg) tại thời điểm 7 ngày sau khi đặt vào đĩa petri

23

Chiều dài thân (mm): đo từ gốc đến ngọn Chiều dai rễ (mm): đo từ gốc chođến đỉnh rễ dài nhất Khối lượng tươi (mg): cân khối lượng tat cả các cây Khối lượngkhô (mg): cân khối lượng khô của cây sau khi sấy ở 70°C đến khi đạt trọng lượngkhông đổi.

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khao sát khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều

kiện phòng thí nghiệm

3.1.1 Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1

trong diéu kién phong thi nghiém

Môi trường và thời gian là yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trìnhnhân sinh khối của các dòng vi khuẩn Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởngrất lớn đến hoạt động sống cũng như khả năng duy trì hoạt tính sinh học của vi khuẩn.Trong đó môi trường lỏng thường được sử dụng trong nhân sinh khối vi khuẩn(Okafor, 2007) Thời gian cũng là yếu tố góp phần ảnh hưởng đến nhân sinh khối và xácđịnh thời điểm ức chế sự phát triển tối đa của dòng vi khuẩn có ý nghĩa thực tế trongviệc tạo chế phẩm sinh học Từ đó nhằm hướng đến việc cần xác định được môi trường

và thời gian nhân sinh khối tối ưu cho 2 dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủngĐXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều kiện phòng thí nghiệm

Kết quả mật độ quang ODsoo ở Bang 3.1 cho thay giá trị trung bình thời gian nhânsinh khối mật số vi khuẩn B amyloliquefaciens chủng DXT6 tăng sinh khối ở thời gian

36 giờ giá trị ODaoo cao nhất đạt là 0,17 và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với cácnghiệm thức con lại, ở thời gian 12 giờ giá trị ODsoo dat thấp nhất là 0,13 Giá trị trungbình môi trường nhân sinh khối mật số vi khuan B amyloliquefaciens chủng DXT6 tăngsinh khối ở nghiệm thức cám gạo kết hợp với mật rỉ đường có giá tri ODsoo đạt cao nhất

là 0,25 và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại, ở nghiệmthức nam men kết hợp với mật rỉ đường có giá trị ODaoo đạt thấp nhất là 0,07 Trên môitrường cám gạo kết hợp với mật ri đường trong thời gian 36 giờ giá trị ODsoo đạt giá trịcao nhất là 0,34 và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại, môi

25

trường cám gạo kết hợp với mật rỉ đường trong thời gian 12 giờ giá trị ODøoo đạt thấpnhất là 0,16.

Như vậy, vi khuẩn Ö amyloliquefaciens chủng DXT6 tăng sinh khối tối ưu khinhân sinh khối trên môi trường cám gạo kết hợp với mật rỉ đường trong thời gian 36 giờ.Bang 3.1 Mật độ quang (ODsoo) của vi khuan B amyloliquefaciens chủng DXT6 khităng sinh khối trong 5 loại môi trường khác nhau tại các thời điểm ở nhiệt độ phòng

Thời gian nhân sinh khối (T) (giờ)

Môi trường Trung bình

Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các SỐ có cùng ký tự di kèm thể hiện sự khác biệt không có ý

nghĩa thong kê ở mức a= 0,01; Các loại môi trường bột bắp, cám gao, cao nam men, khoai tây có kết hợp mật rỉ đường, ngoại trừ môi trường LB **; khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở mức

œ= 0,01.

Ở Bảng 3.2 kết qua cho thay, mật số vi khuân K pneumoniae chủng DXT1 tănggiảm theo thời gian Đối với nghiệm thức cám gạo kết hợp mật ri đường, cao nam menkết hop mật ri đường, khoai tây kết hợp mật rỉ đường va LB mật số vi khuan

K pneumoniae chủng ĐXTI tăng dần qua mức thời gian tối ưu và giảm ở 48 giờ, nhưngđối với nghiệm thức bột bắp giảm dần qua các mức thời gian

Giá trị trung bình thời gian nhân sinh khối mật số vi khuẩn K pneumoniae chủngĐXTI tăng sinh khối ở nghiệm thức 48 giờ giá trị ODøsoo cao nhất đạt là 0,18 và khácbiệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại, ở nghiệm thức 24 giờ giá trịODsoo thấp nhất đạt là 0,13 Giá trị trung bình môi trường nhân sinh khối mật số vi khuẩn

K pneumoniae chủng ĐXTI tăng sinh khối ở nghiệm thức cao nắm men kết hợp mật ri

26