Khảo sát hiệu quả giảm bệnh của vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens vl4 6 Đối với bệnh thán thư trên cây dưa leo Ở Điều kiện nhà lưới

Hoạt tính của bốn enzyme liên quan đến cơ chế khángbệnh gồm peroxidase, catalase, polyphenol oxidase và phenylalanine ammonia lyasetăng lên khi cây dưa leo được xử lý với vi khuẩn VL4.6

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN VĂN SĨ

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ GIẢM BỆNH CỦA VI

KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 ĐỐI VỚI

BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY DƯA LEO Ở

ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 8420201

NĂM 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN VĂN SĨ

MÃ SỐ HV: M0520013

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ GIẢM BỆNH CỦA VI

KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 ĐỐI VỚI

BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY DƯA LEO Ở

ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 8420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS TS NGUYỄN ĐẮC KHOA

NĂM 2024 CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận văn này, với đề tựa là “Khảo sát hiệu quả giảm bệnh của vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens VL4.6 đối với bệnh thán thư trên cây dưa leo ở điều kiện nhà lưới”,

do học viên Nguyễn Văn Sĩ thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn ĐắcKhoa Luận văn đã báo cáo và được Hội đồng chấm luận văn thông qua ngày

09/07/2024 Luận văn đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng chấm luận vănxem lại.

Thành viên đọc luận văn sau khi chỉnh sửa

PGS TS Nguyễn Đắc Khoa

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, bên cạnh nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi đã nhận

được sự quan tâm, giúp đỡ và động viên của gia đình, cùng với sự hướng dẫn chỉ dạycủa quý thầy cô và sự hỗ trợ từ bạn bè và các bạn sinh viên.

Đầu tiên con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình đã luôn tạo điều kiện tốt nhất

để tôi được học tập và hoàn thành tốt công việc của mình

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh Đạo cùng quý thầy cô Giảng viên Viện Công nghệsinh học và Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ đã truyền dạy cho tôi nhiều kiến thức

và kinh nghiệm trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Viện

Chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Đắc Khoa và cô Nguyễn Thị Liên đã hướng dẫn tậntình cùng với lời khuyên hữu ích, kinh nghiệm quý báu cho tôi và tạo điều kiện thuậnlợi để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn đến bạn Nguyễn Tăng Phú, Mai Hồng Tân và các bạn sinh viên ở phòng thínghiệm Vi sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân và xin chúc gia đình, quý thầy cô, các anh chị và cácbạn bè sức khỏe

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 09 tháng 07 năm 2024

thiệt hại nặng về năng suất và chất lượng trái dưa leo Nghiên cứu này được thực hiện

nhằm khảo sát hiệu quả và cơ chế giúp giảm bệnh của chủng vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens VL4.6 Ba mật số (104, 106và 108tế bào/mL) và ba biện pháp xử lýhuyền phù vi khuẩn (phun lên lá, tưới vào đất và kết hợp phun lên lá và tưới vào đất)

được khảo sát trong điều kiện nhà lưới Trong đó, phun huyền phù vi khuẩn B.

amyloliquefaciens VL4.6 mật số 106tế bào/mL lên lá cây dưa leo là nghiệm thức cóhiệu quả giúp giảm bệnh cao nhất Hiệu quả giúp giảm bệnh của vi khuẩn VL4.6 liênquan đến cơ chế kích kháng Hoạt tính của bốn enzyme liên quan đến cơ chế khángbệnh gồm peroxidase, catalase, polyphenol oxidase và phenylalanine ammonia lyasetăng lên khi cây dưa leo được xử lý với vi khuẩn VL4.6 và tăng cao hơn khi có sự hiện

diện của cả mầm bệnh C lagenarium và vi khuẩn VL4.6 Kết quả nghiên cứu cho thấy

vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 có tiềm năng trong phòng trừ sinh học bệnh thán

thư trên dưa leo, giúp giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học, nâng cao năng suất và chấtlượng trái dưa leo thương phẩm

Từ khoá: Bacillus amyloliquefaciens, Colletotrichum lagenarium, dưa leo, kích kháng,

phòng trừ sinh học, thán thư

ii

ABSTRACT

Anthracnose (Colletotrichum lagenarium) causes severe losses in yield and

quality of cucumbers This study aims at testing for the disease-reducing effects of

Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 and investigating possible mechanisms involved in

the observed disease reduction, focusing induced resistance Three cell densities (104,

106, and 108cells/mL) and three application methods (foliar spraying, soil drenching

and a combination of foliar spraying and soil drenching) of the B amyloliquefaciens

VL4.6 suspensions were tested under net house conditions Foliar spraying using

106cells/mL suspension showed strongest effects among the treatments tested Inducedresistance involved in the observed disease reduction Indeed, activities of the fourdefense-related and/or antioxidant enzymes, i.e., peroxidase, catalase, polyphenol

oxidase and phenylalanine ammonia-lyase, increased in cucumber leaf tissues after the

application of B amyloliquefaciens VL4.6 and reached higher levels with the presence

of both pathogen inoculation and B amyloliquefaciens VL4.6 application This

bacterium is therefore a potential biological control agent to improve yield and quality

of cucumbers and reduce chemical uses to control anthracnose in practice

Keywords: anthracnose, Bacillus amyloliquefaciens, biological control, Colletotrichum

lagenarium, cucumber, induced resistance

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Nguyễn Văn Sĩ, là học viên ngành Công nghệ Sinh học, khoá 2020 – 2022.Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thântôi được sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Đắc Khoa Các thông tin được sử dụngtham khảo trong đề tài luận văn được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểmchứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn gốc rõ ràng ở phần Danhmục Tài liệu tham khảo Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là

do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đềtài khác đã được công bố trước đây Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảmbảo cho lời cam đoan này

Cần Thơ, ngày 09 tháng 07 năm 2024Nguời hướng dẫn Tác giả luận văn (ký tên) (ký tên)

PGS TS Nguyễn Đắc Khoa Nguyễn Văn Sĩ

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT

iii LỜI CAM ĐOAN

iii MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ix CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Bệnh thán thư trên dưa leo .3

2.1.1 Đặc điểm thực vật học của dưa leo 3

2.1.2 Colletotrichum và bệnh thán thư do C lagenarium 4

2.2 Các biện pháp quản lý bệnh hại cây trồng 8

2.2 Lợi ích của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 10

2.3 Cơ chế kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng 11

2.3.1 Tổng quan về hệ thống kích kháng lưu dẫn (induced systemic resistance – ISR) .11

2.3.2 Cơ chế ISR qua trung gian PGPR 12

2.3.3 Các hợp chất từ PGPR có khả năng kích thích tính kháng của cây trồng 13

2.4 Vai trò của một số enzyme tham gia trong cơ chế kích kháng ở cây trồng 15

2.4.1 Vai trò của catalase 15

2.4.2 Vai trò của peroxidase 15

2.4.3 Vai trò của polyphenol oxidase 16

2.4.4 Vai trò của phenylalanine ammonia-lyase 16

2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước 17

2.5.1 Ngoài nước 17

2.5.2 Trong nước 19

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22 3.1 Phương tiện nghiên

cứu 22 3.1.1 Thời gian và địa

điểm nghiên cứu 22

v3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 22

22 3.1.4 Vật liệu 22

3.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.2.1 Khảo sát hiệu quả giảm bệnh thán thư của chủng vi khuẩn B.

amyloliquefaciens VL4.6 trong điều kiện nhà

bệnh thán thư trên dưa leo trong điều kiện nhà lưới 28

4.2 Sự thay đổi hoạt tính enzyme ở các nghiệm thức xử lý chủng vi khuẩn B.

amyloliquefaciens VL4.6 32

4.2.1 Hoạt tính peroxidase 32

37 4.2.3 Hoạt tínhpolyphenol oxidase 42 4.2.4 Hoạt tínhphenylalanine ammonia-lyase 46

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52

53 PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram phần ăn được của trái dưa leo 4

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Mô hình chu kỳ sống của Colletotrichum higginsianum trên Arabidopsis

thaliana 5

Hình 2.2: Các cấu trúc của C lagenarium (Damm et al., 2013) 7

Hình 2.3: Vết bệnh thán thư trên các bộ phận của cây dưa leo 8

Hình 2.4: Hoạt động kích kháng theo cơ chế SAR và ISR ở cây trồng 12

Hình 4.1: Tỷ lệ diện tích lá dưa leo bệnh ở 4 NSCB khi xử lý chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 28

Hình 4.2: Tỷ lệ diện tích lá dưa leo bệnh ở 5 NSCB khi xử lý chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 29

Hình 4.3: Tỷ lệ diện tích lá dưa leo bệnh ở 6 NSCB khi xử lý chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 30

Hình 4.4: Lá dưa leo với các vết bệnh thán thư 30

Hình 4.5: Sự thay đổi hoạt tính peroxidase trong mô lá dưa leo khi được xử lý phun lá với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 34

Hình 4.6: Sự thay đổi hoạt tính peroxidase trong mô lá dưa leo khi được xử lý kết hợp tưới đất – phun lá với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 35

Hình 4.7: Sự thay đổi hoạt tính catalase trong mô lá dưa leo khi được xử lý phun lá với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 39

Hình 4.8: Sự thay đổi hoạt tính catalase trong mô lá dưa leo khi được xử lý kết hợp tưới đất – phun lá với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 40

Hình 4.9: Sự thay đổi hoạt tính polyphenol oxidase trong mô lá dưa leo khi được xử lý phun lá với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 44

Hình 4.10: Sự thay đổi hoạt tính polyphenol oxidase trong mô lá dưa leo khi được xử lý kết hợp phun lá – tưới đất với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 45

Hình 4.11: Sự thay đổi hoạt tính phenylalanine ammonia-lyase trong mô lá dưa leo khi được xử lý phun lá với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 48

Hình 4.12: Sự thay đổi hoạt tính phenylalanine ammonia-lyase trong mô lá dưa leo khi được xử lý kết hợp phun lá-tưới đất với vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 49

viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A Absorbance (Quang phổ hấp thụ)

AHL N-acyl-homoserine lactones

APX Ascorbate peroxidase

OD Optical density (Độ truyền quang phổ)

PAL Phenylalanine ammonia lyase

PDA Potato Dextrose Agar (Thạch khoai tây dextrose)

PGPR Plant-growth promoting rhizobacteria (Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng

cây trồng)POX Peroxidase

PPO Polyphenol oxidase

RL Rhamnolipid

ROS Phần tử oxy phản ứng

SAR Systemic acquired resistance (Hệ thống kích kháng tập nhiễm) SC-EP

Exopolysaccharide từ Schizophyllum commune HNU-12 SOD Superoxide

effutase

VOC Volatile organic compound (Hợp chất hữu cơ dễ bay hơi)

Trong quá trình canh tác, cây dưa leo có thể bị tấn công bởi nhiều mầm bệnh khác nhau

như bệnh sương mai (Pseudoperonospora cubensis), bệnh phấn trắng (Erysiphe

cichoracearum), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh thối rễ (Phomopsis sclerotioides), bệnh mốc trắng (Sclerotinia sclerotiorum), nứt thân chảy nhựa

(Didymella bryoniae), bệnh thán thư (Colletotrichum orbiculare) và bệnh héo Fusarium (Fusarium oxysporum) (Din et al., 2020) Trong đó, bệnh thán thư do C lagenarium

làm thoái hoá mô cây, giảm diện tích bề mặt quang hợp và có thể gây chết cây (Matsuo

et al., 2022), gây nhiều thiệt hại cho người trồng.

Nhằm mục đích tăng sản lượng, các loại hóa chất nông nghiệp khác nhau đã trở

thành bắt buộc để bảo vệ cây trồng khỏi mầm bệnh thực vật (Gurikar et al., 2022) Việc

sử dụng hóa chất nông nghiệp không khoa học đã gây ra nhiều vấn đề cho môi trường

và mầm bệnh phát triển khả năng kháng lại các hóa chất đó, đây là trở ngại lớn trong

việc quản lý dịch bệnh (Gurikar et al., 2022) Vì việc sử dụng thuốc trừ sâu có liên

quan đến ô nhiễm môi trường, suy thoái đất và mất độ phì nhiêu của đất nên các nhàkhoa học đã chuyển trọng tâm sang các giải pháp thay thế thân thiện với môi trường

hơn, chẳng hạn như sử dụng vi khuẩn vùng rễ cây trồng (Chakraborty et al., 2024) Vi

khuẩn vùng rễ được xem là công cụ ngăn chặn bệnh hại cây trồng bằng cách kích hoạtcác con đường phòng vệ, tăng sản xuất phytohormone và cạnh tranh loại trừ mầmbệnh Các hormone sản xuất, enzyme, các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi và siderophores

hỗ trợ thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Chakraborty et al., 2024).

Bacillus amyloliquefaciens có thể ức chế các mầm bệnh gây hại cây trồng bởi

nhiều hợp chất kháng khuẩn, các hợp chất chống nấm như lipopeptide, siderophores và

kích thích sinh trưởng cây trồng (Pinto et al., 2018) B amyloliquefaciens có thể kích

thích các enzyme phòng vệ liên quan đến kích thích tính kháng của cây trồng, chẳnghạn như phenylalanine ammonia-lyase (PAL), peroxidase (POX), polyphenol oxidase

và β-1,3- glucanase (Gowtham et al., 2018) Cơ chế tạo ra các enzyme PAL, POX và sự

tích tụ

các phenolic như lignin có thể xảy ra để phản ứng với sự tấn công của côn trùng và

mầm bệnh cũng như tiếp xúc với các chất oxy hoá (Gurikar et al., 2022).

Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 phân lập từ mẫu đất vùng rễ cây dưa leo cho thấy hoạt tính kháng nấm cao chống lại C lagenarium trong điều kiện phòng thí

nghiệm (Lê Thị Mỹ Nhân, 2018) Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quảgiảm bệnh thán thư trên dưa leo và đánh giá sự thay đổi hoạt tính của các enzyme

1catalase, peroxidase, polyphenol oxidase và phenylalanine ammonia-lyase, dưới tác

động của chủng B amyloliquefaciens VL4.6 trong điều kiện nhà lưới.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện với hai mục tiêu chính: đánh giá được hiệu quả giảm

bệnh thán thư trên dưa leo khi xử lý chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6; và

chứng minh được sự liên quan giữa sự thay đổi hoạt tính enzyme (catalase, peroxidase,polyphenol oxidase và phenylalanine ammonia-lyase) và hiệu quả giảm bệnh thán thưtrên dưa leo dưới tác động của chủng VL4.6

1.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát hiệu quả giảm bệnh thán thư trên dưa leo trong điều kiện nhà lưới với bamật số vi khuẩn VL4.6 (104, 106và 108tế bào/mL) và 3 biện pháp xử lý (tưới đất, phun

lá và kết hợp tưới đất – phun lá)

Khảo sát sự thay đổi hoạt tính catalase, peroxidase, polyphenol oxidase và

phenylalanine ammonia-lyase trong mô lá dưa leo

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Bệnh thán thư trên dưa leo

2.1.1 Đặc điểm thực vật học của dưa leo

Dưa leo, còn gọi là dưa chuột ở miền Bắc, có tên khoa học là Cucumis sativus Đây là một loại cây thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae), rất phổ biến và được trồng rộng

rãi ở Việt Nam cũng như trên toàn thế giới Dưa leo phát triển mạnh mẽ ở vùng nhiệtđới và ôn đới

Dưa leo có nguồn gốc từ Ấn Độ hơn 3000 năm trước và đã lan truyền khắp cácchâu lục Trong các nền văn minh cổ đại như Ai Cập, Hy Lạp và Roma, dưa leo khôngchỉ được tiêu thụ như một loại thực phẩm mà còn được sử dụng vì đặc tính chữa lành

da Hiện nay, dưa leo được trồng ở nhiều quốc gia như Mỹ, Nhật Bản, Hà Lan, Nga, BaLan, Trung Quốc và Việt Nam

Theo thống kê, diện tích, sản lượng và năng suất của dưa leo liên tục tăng qua các

năm Năm 2016, diện tích trồng dưa leo trên toàn cầu đạt gần 2,2 triệu ha với sản lượnghơn 80 triệu tấn Đến năm 2020, diện tích này tăng lên gần 2,3 triệu ha và sản lượng đạthơn 91 triệu tấn (FAOSTAT, 2022) Ở Việt Nam, dưa leo được trồng khắp cả nước, cáctỉnh trồng nhiều như: Tây Ninh, Đồng Nai, Tiền Giang, Cần Thơ, An Giang, NamĐịnh, Thanh Hóa,… có diện tích trồng dưa leo là 31.570 ha/năm và sản lượng đạt577.218 tấn/năm (năm 2009).

Theo Trần Thị Ba và ctv (1999) dưa leo là loại cây thân thảo Bộ rễ phát triển yếu

nhất so với các cây trong họ bầu bí, rễ chỉ phân bố ở tầng đất mặt 30-40 cm Thân dàitrung bình 1-3 m, có nhiều tua cuốn để bám khi bò Thân tròn hay có góc cạnh, có lông

ít hay nhiều tùy giống Lá đơn to, mọc cách trên thân, dạng lá hơi tam giác với cuốn lárất dài 5 -15 cm, rìa lá nguyên hay có răng cưa Lá trên cùng cũng có kích thước vàhình dáng thay đổi Hoa đơn tính đồng chu hay biệt chu Hoa cái mọc ở nách lá thànhđôi hay riêng biệt, hoa đực mọc thành cụm từ 5–7 hoa, dưa leo cũng có hoa lưỡng tính.Hoa có màu vàng, thụ phấn nhờ côn trùng, bầu noãn của hoa cái phát triển rất nhanhngay trước khi hoa nở Trái lúc còn non có gai xù xì, khi trái lớn gai từ từ mất đi Hạt

có màu trắng ngà, trọng lượng 1000 hạt từ 20-30 g, trung bình có từ 200-500 hạt trên

trái (Trần Thị Ba và ctv., 1999).

Dưa leo là một loại rau ăn quả được sử dụng rộng rãi trong bữa ăn hàng ngày vàtrong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới Dưa leođược đánh giá cao nhờ những lợi ích sức khỏe mà nó mang lại, chủ yếu do giá trị dinhdưỡng cao Với hàm lượng nước chiếm khoảng 96%, dưa leo cung cấp một loại nước

“siêu cất” quý giá hơn nhiều so với nước uống thông thường Vỏ dưa leo chứa nhiềuvitamin A Quả dưa leo chứa nhiều khoáng chất tạo kiềm, giúp trung hòa acid trong cơthể, chứa hàm lượng vitamin C cao là một chất chống oxy hóa nổi tiếng, cùng vớifolate,

3

manganese, molybdenum, potassium, silica, sulphur, calcium, phosphorus và các

vitamin nhóm B

Vì vậy, dưa leo có nhiều lợi ích cho sức khỏe Dịch ép dưa leo giúp điều hòa nhiệt

độ cơ thể, rất hiệu quả trong việc hạ sốt Ngoài ra, dưa leo còn có tác dụng kháng viêm,giúp giảm đau khớp và hỗ trợ điều trị hen suyễn, bệnh gút nhờ khả năng loại bỏ uricacid Chất silicon và sulphur trong dưa leo giúp tóc mọc nhanh hơn, đặc biệt khi kếthợp với cà rốt và xà lách Đắp lát dưa leo lên mắt có thể giảm sưng mắt vào buổi sáng.Với hàm lượng cao vitamin C và các chất chống oxy hóa, dưa leo giúp làm đẹp da vàđiều trị các bệnh về da như chàm, vảy nến, mụn Khi da bị phỏng nắng, dịch ép dưa leo

có thể làm dịu và phục hồi da nhanh chóng

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram phần ăn được của trái dưa

leo Thành phần Hàm lượng

Nước 96,4%

Protein 0,6 gChất béo 0,2 gTổng carbohydrate 2,4 g

Xơ 0,5 gTro 0,4 gCalcium 19 mgPhosphorus 12 mgKali 122 mgSắt 0,4 mgNatri 5 mgVitamin A

Thiamine 0,02 mgRiboflavin 0,02 mgNiacin 0,1 mgAscorbic acid 10 mg

(Department of Agriculture - Regional Field Office No 02, 2017)

2.1.2 Colletotrichum và bệnh thán thư do C lagenarium

a Vòng đời của Colletotrichum

Nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây trồng, ban đầu được gọi là

Vermicularia bởi Tode vào năm 1790, sau đó được Corda đổi tên thành Colletotrichum

vào năm 1837 Chi nấm này có đặc điểm là bào tử đính trong suốt, thẳng hoặc hình

liềm

4

và đĩa dài có lông cứng Mặc dù đã được mô tả rõ ràng, chi nấm này vẫn được gọi bằng

nhiều tên khác nhau như Vermicularia và Gloeosporium trong thế kỷ 19 và đầu thế kỷ

20

Bệnh thán thư (Anthracnose), còn gọi là bệnh đốm trái, là một bệnh phổ biến vànguy hiểm cho nhiều loại cây trồng như rau xanh, cây ăn quả và cây cảnh Bệnh nàygây hại trên nhiều bộ phận của cây và có nguồn gốc từ Hy Lạp, với tên gọi “coal” dođặc điểm tổn thương tối màu và lõm xuống chứa các khối bào tử

Các loài Colletotrichum có các hình thái vô tính và hữu tính trong vòng đời của

chúng, hình thành trực tiếp trên cây chủ hoặc các mảnh vụn thực vật Hình thái vô tính

của Colletotrichum thường liên quan đến các quá trình xâm nhiễm, gây bệnh, do đó

được nghiên cứu kỹ lưỡng so với các hình thái hữu tính Glomerella tương ứng của

chúng

(Jayawardena et al., 2016).

Để hoàn thành vòng đời, hình thái vô tính sẽ tạo ra acervulus, một cấu trúc đượchình thành bên trong mô cây chủ (Khan & Hsiang, 2003) Khi sợi nấm phát triển giữalớp biểu bì thực vật và lớp biểu bì thì sức căng trên lớp biểu bì tăng lên, dẫn đến sự phá

vỡ lớp biểu bì Sau đó, bào tử đính được tạo ra trên chất nền trong acervulus (Curry et

al., 2002) và được bọc trong một chất nhầy hòa tan trong nước Khi tiếp xúc với nước

(sương, nước tưới và hạt mưa) và gió, bào tử được phát tán đến các vị trí mới, vật chủ

mới hoặc cùng một cây ký chủ và bắt đầu chu kỳ lây nhiễm mới (Ntahimpera et al.,

1997)

Hình 2.1: Mô hình chu kỳ sống của Colletotrichum higginsianum trên Arabidopsis thaliana

(Jayawardena et al., 2016)

5

b Quá trình xâm nhiễm của Colletotrichum

Chu kỳ lây nhiễm của loài Colletotrichum có thể được xem xét chủ yếu ở hai

phần: trước xâm nhiễm và sau xâm nhiễm

Trước xâm nhiễm

Sự xâm nhập và xâm chiếm của các loài Colletotrichum thường bắt đầu bằng sự

nảy mầm của bào tử đính (conidia) và hình thành các cấu trúc lây nhiễm chuyên biệtgọi là đĩa áp (appressoria) Những cấu trúc này tạo điều kiện cho nấm xâm nhập qualớp biểu bì và thành tế bào biểu bì của vật chủ thông qua sự phá vỡ tế bào cây chủ

Các loài Colletotrichum có khả năng xâm nhập mạnh mẽ khi xâm nhập trực tiếp

vào bề mặt vật chủ Mặc dù độ bám dính bào tử và đĩa áp rất quan trọng trong việc xâmnhập vật chủ bằng các áp lực vật lý; melanin và chất thẩm thấu cũng cần thiết cho quátrình xâm nhiễm (Latunde-Dada, 2001)

Giai đoạn xâm nhiễm và hoại tử

Khi bào tử nấm Colletotrichum đáp xuống bề mặt vật chủ và gặp điều kiện thuận

lợi như độ ẩm cao hoặc bề mặt có nhiều vết thương cơ học, chúng sẽ nảy mầm, tạo đĩa

bám và xâm nhập sâu vào mô thực vật qua các tổn thương này Nấm Colletotrichum có

thể xâm nhập vào mô ký chủ theo hai cách: chủ động và thụ động (Phạm Văn Kim,2000)

Xâm nhập chủ động: Nấm bệnh tự tìm cách xâm nhập vào mô cây qua bề mặtnguyên vẹn (lá, quả,…) nhờ lực cơ học hoặc enzyme

Xâm nhập thụ động: Nấm bệnh xâm nhập qua các lỗ hở tự nhiên hoặc vết thươngtrên cây, do côn trùng, sâu bọ, tuyến trùng, động vật lớn (trâu, bò, chó, mèo,…) hoặcnông cụ gây ra Vết thương cũng có thể do giông bão, lũ lụt hoặc sự tích tụ muối độctrong đất ẩm gây ra tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh xâm nhập

Trong giai đoạn đầu sau khi xâm nhiễm, nấm bệnh xâm nhập vào các tế bào biểu bì vàsợi nấm sơ cấp tạo ra các túi nhiễm trùng mở rộng bên trong tế bào biểu bì và tế bàotrung mô Tiếp theo là giai đoạn hoại tử, trong đó sợi nấm thứ cấp tiết ra các enzyme

phân hủy thành tế bào, phát triển nội bào và giết chết tế bào chủ (O'Connell et al.,

2012)

c Bệnh thán thư dưa leo do C lagenarium

Theo Damm et al (2013), C lagenarium (còn được gọi là C orbiculare) thuộc

vào phức hợp orbiculare, chỉ giới hạn ở các giống hoặc loài vật chủ thân thảo cụ thể vớilối sống bán ký sinh bắt buộc Các thành viên của phức hợp loài orbiculare hình thànhbào tử thẳng, tương đối rộng và ngắn Đĩa áp của những loài này có hình dáng nhỏ và

đơn giản (Damm et al., 2013) (Hình 2.2).

6

Theo Li (2014), C lagenarium có thể tấn công trên nhiều bộ phận của cây dưa

leo Các đốm trên lá là triệu chứng có thể dễ dàng quan sát trên đồng ruộng, các đốmban đầu là những vùng sũng nước, sau đó chuyển thành các đốm tròn có màu vàng.Vết bệnh có thể lan rộng trên bề mặt lá và hoá nâu Trên thân và cuống lá, vết bệnh cóthể có dạng vệt kéo dài, hình oval đến hình kim cương với màu nâu đen, trong điềukiện ẩm ướt có thể xuất hiện các khối bào tử màu hồng Trái dưa leo cũng có thể bị tấncông bởi nấm bệnh ở giai đoạn trưởng thành Vết bệnh trên trái ban đầu là những điểm

tròn sũng nước, sau đó hoá nâu và lõm xuống Trong điều kiện ẩm ướt, các khối bào tửmàu cá hồi có thể xuất hiện trên các vết bệnh (Li, 2014) Nấm bệnh có thể tồn tại trênhạt giống từ trái nhiễm bệnh, xác bã cây trồng và các cây ký chủ khác Bào tử nấmbệnh lây lan theo mưa, nước tưới (Li, 2014).

Hình 2.2: Các cấu trúc của C lagenarium (Damm et al., 2013)

a–b acervuli; c đầu seta; d gốc của seta; e–f cọng mang bào tử; g seta; h–j cọng mang bào tử; k–p đĩa áp; q–r.

bào tử.

7

Hình 2.3: Vết bệnh thán thư trên các bộ phận của cây dưa leo

(Li et al., 2014)

2.2 Các biện pháp quản lý bệnh hại cây trồng

Biện pháp ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh

Các biện pháp nhằm ngăn chặn sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh (mầm bệnh)vào khu vực trồng trọt có thể được áp dụng để quản lý bệnh hại Các biện pháp ngănchặn thường chỉ làm chậm lại sự xâm nhập của mầm bệnh, từ đó có thể có thời gian đểlập kế hoạch quản lý mầm bệnh khi chúng xuất hiện (Maloy, 2005)

Sản xuất hạt giống hoặc cây trồng sạch bệnh là một biện pháp quan trọng và thiếtthực trong ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh vào khu vực sản xuất Cách ly khuvực sản xuất, kiểm tra đồng ruộng và loại bỏ những cây nghi ngờ nhiễm bệnh là nhữngbiện pháp giúp sản xuất và duy trì nguồn giống sạch bệnh Kỹ thuật nuôi cấy mô và vinhân giống có thể được sử dụng để tăng số lượng cây trồng sạch bệnh Một số biệnpháp

8đơn giản như làm sạch thiết bị nông nghiệp cũng có thể giúp ngăn chặn sự xâm nhậpcủa mầm bệnh (Maloy, 2005).

Biện pháp diệt trừ mầm bệnh

Các biện pháp diệt trừ được thực hiện khi phát hiện sớm sự xâm nhập của mầmbệnh, nhằm mục đích tiêu diệt mầm bệnh trước khi chúng lây lan rộng trong khu vựccanh tác Biện pháp diệt trừ có thể được áp dụng cho các khu vực nhỏ như cho từng câytrồng, lô hạt giống, cánh đồng hoặc vùng (Maloy, 2005)

Đối với cây giống: phân loại và loại bỏ các hoa, thân hoặc rễ bị bệnh, xử lý hạtgiống bằng nước nóng Ký chủ của mầm bệnh: tiêu diệt cỏ dại là ổ chứa các mầm bệnhkhác nhau hoặc côn trùng truyền bệnh cho cây Khử trùng đất: là một biện pháp được

sử dụng rộng rãi để tiêu diệt các mầm bệnh có trong đất canh tác Tuy nhiên, biện phápnày có nhược điểm như tiêu diệt các sinh vật có ích, các hoá chất khử trùng có thể cóđộc tính cao và gây ô nhiễm nguồn nước ngầm Luân canh cây trồng: biện pháp luâncanh có thể giúp giảm số lượng mầm bệnh (thường là các sinh vật gây bệnh trong đất)trong khu vực canh tác do không có sự hiện diện của ký chủ của các mầm bệnh (Maloy,2005)

Các biện pháp bảo vệ cây trồng

Các biện pháp bảo vệ nhằm thiết lập rào cản giữa mầm bệnh và cây ký chủ hoặc

bộ phận dễ bị tổn thương của cây ký chủ có thể giúp ngăn chặn sự xâm nhiễm của mầmbệnh vào cây trồng Các biện pháp bảo vệ thường được áp dụng ở dạng như rào cản hóahọc, ví dụ như thuốc diệt nấm hoặc thuốc diệt khuẩn (Maloy, 2005)

Thuốc diệt nấm có thể được áp dụng bằng nhiều phương pháp như: máy phun,máy bay hoặc thông qua hệ thống tưới tiêu, nhưng để sử dụng hiệu quả phải được thựchiện đúng cách Thuốc diệt nấm phải được đăng ký hợp pháp để sử dụng trên cây trồng

và chống lại bệnh mục tiêu Nếu các loại thuốc diệt nấm khác nhau có hiệu quả, chiphí, tính dễ sử dụng và độ an toàn tương tự nhau thì thời điểm sử dụng sẽ đưa đến hiệuquả

bảo vệ cây trồng của biện pháp xử lý thuốc hoá học (Maloy, 2005)

Biện pháp bảo vệ cây trồng có thể gồm một số kỹ thuật canh tác chẳng hạn nhưlàm đất, tưới tiêu hoặc thay đổi độ pH của đất Biện pháp này cũng có thể áp dụng ở cácphương thức như thay đổi thời điểm gieo trồng hoặc độ sâu gieo hạt, khoảng cách giữacác cây, cắt tỉa và tỉa thưa hoặc các biện pháp khác giúp cây trồng thoát khỏi sự tấncông của mầm bệnh hoặc giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh (Maloy, 2005)

Nhiều tập quán canh tác có thể được sửa đổi để quản lý sự xuất hiện, cường độ hoặcmức độ nghiêm trọng của bệnh trên cây trồng Các biện pháp có thể thực hiện bao gồmlựa chọn địa điểm trồng trọt thích hợp cho cây trồng, làm đất để chôn vùi tàn dư thực

vật bị nhiễm mầm bệnh, luân canh sang các loại cây trồng không mẫn cảm với mầmbệnh, chọn giống cây trồng sạch bệnh, định hướng trồng để cải thiện khả năng tiếp xúcvới ánh nắng mặt trời và các luồng không khí, cắt tỉa và tỉa thưa để loại bỏ nguồn

9lây nhiễm và cải thiện khả năng thông khí xung quanh cây, quản lý độ ẩm không khí vàlượng nước trong đất, cung cấp chất dinh dưỡng đầy đủ, canh tác thích hợp để cải thiện

sự phát triển của rễ và tránh tổn thương cây, thực hiện đúng các quy trình vệ sinh đểloại bỏ nguồn bệnh Biện pháp sử dụng các tác nhân kiểm soát sinh học để kiểm soátbệnh hại cây trồng cũng là một biện pháp bảo vệ cây trồng hiệu quả (Maloy, 2005)

Tính kháng bệnh của cây trồng

Sử dụng cây trồng kháng bệnh là phương pháp lý tưởng để quản lý bệnh câytrồng, nếu có sẵn cây trồng có chất lượng đạt yêu cầu và thích nghi với vùng trồng trọtvới mức độ kháng bệnh bền vững Cây kháng bệnh thường được tạo ra bằng các quytrình nhân giống tiêu chuẩn như chọn lọc và lai tạo Lai tạo là một kỹ thuật tạo ra giốngcây có các đặc tính nông học mong muốn như có khả năng kháng bệnh, kích thước,năng suất, hương vị, tính thẩm mỹ cao Một số giống kháng bệnh đã được tạo ra bằngcách gây đột biến với tác nhân tia X hoặc hóa chất (Maloy, 2005)

Một vấn đề lớn đối với cây trồng kháng bệnh về mặt di truyền là mầm bệnh có thểphát triển nhiều dòng khác nhau và cây giống kháng bệnh trở nên mẫn cảm với cácdòng mới của mầm bệnh Khả năng kháng bệnh do một gen chính duy nhất đôi khiđược gọi là kháng đặc hiệu hoặc kháng định tính và mang tính đặc trưng của loài Loạikháng bệnh này thường không ổn định vì sự xuất hiện của chủng gây bệnh có thể tấncông kiểu gen đó có thể làm mất hoàn toàn khả năng kháng bệnh Tính kháng số lượnghay tính kháng chung bắt nguồn từ nhiều gen kháng khác nhau có tác dụng bổ sungmang lại khả

năng kháng ổn định hơn và bền vững hơn đối với mầm bệnh (Maloy, 2005)

2.2 Lợi ích của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens là một loài thuộc chi Bacillus, có liên quan về mặt di

truyền và kiểu hình với B subtilis, B vallismortis, B mojavensis, B atrophaeus, B.

methylotrophicus, B siamensis, B velezensis, B licheniformis và B pumilus, tạo thành

nhóm B subtilis (Pinto et al., 2018) B amyloliquefaciens có thể phân bố khắp nơi, vi

khuẩn Gram dương, hình que, hiếu khí và hình thành nội bào tử Cùng với các loài

Bacillus khác thuộc nhóm Bacillus subtilis, B amyloliquefaciens đã được báo cáo là

phát triển mối quan hệ có thực vật lợi bằng cách kích thích sinh trưởng, cải thiện khả

năng chịu đựng với áp lực môi trường hoặc kiểm soát bệnh hại cây trồng (Pinto et al.,

2018)

Bacillus amyloliquefaciens (BA) là một trong những vi khuẩn hứa hẹn nhất trong

việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật mà không có tác dụng phụ có hại (Luo et al., 2022).

Đầu tiên, BA có thể cải thiện khả năng cung cấp dinh dưỡng của đất, bao gồm cảithiện nguồn cung cấp nitơ, hòa tan phốt phát và kali cũng như sản xuất siderophores

(Luo et al., 2022).

Thứ hai, BA có thể thay đổi quần thể vi sinh vật trong đất và cải thiện sự sẵn có

của khoáng chất cũng như điều kiện sinh trưởng của thực vật (Luo et al., 2022).

10Thứ ba, BA có thể tiết ra các hormone và các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC)liên quan đến sự phát triển của tế bào và rễ thực vật, đồng thời cải thiện hơn nữa sự hấp

thu chất dinh dưỡng của thực vật (Luo et al., 2022).

Thứ tư, BA có thể tăng cường sức đề kháng của cây trồng chống lại các stresssinh học từ mầm bệnh trong đất thông qua sự cạnh tranh của các hốc và chất dinhdưỡng, tạo ra các chất như lipopeptide mạch vòng, polyketide và VOC để đối khángtrực tiếp với mầm bệnh và tạo ra tính kháng hệ thống của cây Tương tự như vậy, việc

xử lý BA có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật bằng cách tạo ra khả năng chống chịu có

hệ thống đối với các stress phi sinh học bằng cách dẫn đến những thay đổi về mặt di

truyền, hóa học và vật lý ở cây chủ (Luo et al., 2022).

2.3 Cơ chế kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng

2.3.1 Tổng quan về hệ thống kích kháng lưu dẫn (induced systemic

resistance – ISR)

Stress sinh học do mầm bệnh, côn trùng và cỏ dại gây ra là nguyên nhân gây racác biển đổi về sự hấp thu chất dinh dưỡng, rối loạn sinh lý và tăng tính nhạy cảm với

bệnh ở cây trồng (Chakraborty et al., 2024) Thực vật sở hữu một hệ thống miễn dịch

giúp chống lại các mầm bệnh như vi sinh vật và ký sinh trùng; hệ thống này được điều

phối bởi một mạng lưới tín hiệu phức tạp (Jain et al., 2014) Những con đường này

được tạo ra bởi một phân tử tín hiệu cụ thể hoặc chất kích thích, kích hoạt các phân tửtrung gian khác nhau theo hệ thống tạo thành một mạng lưới các con đường truyền tínhiệu liên kết với nhau để điều chỉnh khả năng phòng vệ của thực vật chống lại mầm

bệnh (Jain et al., 2014).

Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (plant-growth promoting

rhizobacteria – PGPR) được chứng minh giúp ngăn ngừa bệnh hại ở cây trồng bằngcách kích thích hệ thống kích kháng lưu dẫn (induced systemic resistance - ISR)

(Zehra et al., 2021) Sự tấn công của các mầm bệnh cũng có thể đưa đến kích thích hệ

thống kích kháng tập nhiễm ở cây trồng (systemic acquired resistance - SAR)

(Chakraborty et al., 2024) Tuy nhiên ISR yêu cầu các đường truyền tín hiệu thông qua

jasmonic acid và ethylene, còn SAR được tạo ra thông qua salicylic acid Cả ISR quatrung gian vi khuẩn vùng rễ và SAR do mầm bệnh gây ra đều làm tăng sức đề khángcủa các bộ phận thực vật không bị nhiễm bệnh đối với các mầm bệnh thực vật khác

nhau (Chakraborty et al., 2024) Sau khi được vi khuẩn vùng rễ cảm ứng, quá trình

tổng hợp jasmonic acid (JA) và ethylene (ET) diễn ra trong cây và sau khi mầm bệnhtấn công, các phản ứng JA và ET kích hoạt biểu hiện gen npr-1, mã hóa protein NPR-1,

sau đó kích hoạt các gen liên quan đến phòng vệ (Jain et al., 2014).

Sự tương tác giữa vi khuẩn và cây trồng có tính đặc hiệu trong việc kích khánglưu dẫn ở thực vật Một số vật chủ có thể không thể đạt được ISR vì vi khuẩn vùng rễkhông tạo ra bất kỳ thành phần cảm ứng nào hoặc do các loài thực vật cụ thể không thểphát

11

hiện ra các nhân tố này (Chakraborty et al., 2024) Ví dụ, P putida WCS358r cảm ứng ISR ở cây Arabidopsis nhưng không cảm ứng được ở cây củ cải hoặc cây cẩm chướng Cây củ cải phản ứng với P fluorescens WCS374r, trong khi cây Arabidopsis thì không (Van Wees et al., 1997).

Hình 2.4: Hoạt động kích kháng theo cơ chế SAR và ISR ở cây trồng

(Khoshru et al., 2023)

2.3.2 Cơ chế ISR qua trung gian PGPR

PGPR có thể ức chế mầm bệnh gây hại cây trồng với các cơ chế như cạnh tranhnguồn dinh dưỡng và không gian sống, sản sinh bacteriocin, enzyme thuỷ phân,

siderophore và kháng sinh (Tariq et al., 2017) Nhiều hợp chất từ PGPR như

pyoluteorin, phenazine, 2,4-diacetylphloroglucinol, tensin và viscosinamide được

chứng minh về hiệu quả giảm bệnh trên cây trồng (Khoshru et al., 2023) Pseudomonas,

Azotobacter, Paenibacillus, Azospirillum, Enterobacter, Streptomyces và Bacillus là

những PGPR quan trọng được nghiên cứu trong nhiều năm qua (Bharti & Tewari,2021)

Sự xâm nhập của vi sinh vật có lợi làm cho vật chủ thực vật bước vào trạng tháisinh lý được gọi là “mồi” Dưới tác động “mồi” của vi khuẩn có lợi, thực vật có thểbiểu hiện sự đáp ứng mạnh và nhanh chóng khi xảy ra sự tấn công của mầm bệnh

(Conrath et al., 2015) Một số hoạt động của PGPR có thể tăng hiệu quả ISR của

nước và chất dinh dưỡng sẵn có trong vùng rễ (Santoyo et al., 2021).

Bacillus amyloliquefaciens FZB42 tăng cường đáng kể sự tăng trưởng và khả

năng chịu hạn của cây Arabidopsis bằng cách tăng tỷ lệ sống, trọng lượng chồi tươi và

khô, chiều dài rễ sơ cấp, trọng lượng khô của rễ, số lượng rễ bên và tổng chiều dài rễbên Những thay đổi phối hợp cũng được quan sát thấy trong các phản ứng bảo vệ tếbào, bao gồm nồng độ proline tăng cao và hoạt động của superoxide effutase vàperoxidase, nồng độ malondialdehyd giảm và sự tích tụ hydro peroxide trong thực vậtđược xử lý bằng FZB42 Tuy nhiên, ở nghiệm thức cây được xử lý với chủng FZB42

mang đột biến epsC có khả năng chống chịu hạn hán kém hơn, cho thấy rằng epsC là

quan trọng trong việc đưa đến các lợi ích của chủng FZB42 Hơn nữa, chủng đột biến

ít có khả năng hỗ trợ sự hình thành màng sinh học và xâm chiếm rễ A thaliana (Lu et

al., 2018).

Sản sinh các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi

PGPR có thể sản sinh các hormone thực vật, hợp chất dễ bay hơi tác động trựctiếp hoặc gián tiếp để kích hoạt khả năng miễn dịch thực vật hoặc điều chỉnh hình thái

và tăng trưởng của thực vật Vi khuẩn tạo ra nhiều loại hóa chất đóng vai trò thông tin,

chất chuyển hóa thứ cấp, hầu hết đều hòa tan và dễ bay hơi (Khoshru et al., 2023) Các

hợp chất hữu cơ dễ bay hơi là một phần quan trọng trong giao tiếp thực vật, VOC đóngvai trò trong tương tác trên và dưới mặt đất, giữa thực vật với vi sinh vật và động vật

(Effah et al., 2019).

Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi thường có áp suất hơi cao và trọng lượng phân tửthấp Chúng hoạt động ở nồng độ rất nhỏ và phù hợp với nhiều nhóm hóa học, chẳnghạn như aldehyde, rượu, este, xeton, terpen, lactone và các hợp chất lưu huỳnh

(Wheatley, 2002) Do tính dễ bay hơi của chúng, các hợp chất này có thể di chuyển quakhoảng cách lớn trong môi trường không đồng nhất bao gồm chất lỏng, chất rắn và khí(Wheatley, 2002)

Hoạt động chống oxy hóa của PGPR

Quá trình sản xuất và tích luỹ các phần tử oxy phản ứng (ROS) như superoxide(O2−), oxy nhóm đơn (O2), hydroxyl (OH−) và hydro peroxide (H2O2) gây ra các stresslên sinh vật sống Quá trình này có thể có tác động phá hủy các phân tử sinh học quantrọng như như protein, nucleic acid và lipid Để ngăn ngừa tổn hại do oxy hóa, thực vật

bị stress sẽ sản sinh ra các enzyme ức chế ROS, bao gồm superoxide effutase,

peroxidase, glutathione reductase, catalase và ascorbate peroxidase (Khoshru et al.,

2023)

2.3.3 Các hợp chất từ PGPR có khả năng kích thích tính kháng của cây trồng

Kháng sinh: vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật tạo ra một số loại kháng sinh

hỗ trợ kiểm soát sinh học các mầm bệnh khác nhau Một số loại kháng sinh giúp kích

13thích tính kháng hệ thống ở cây, giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát sinh học chống lại

các loại mầm bệnh khác nhau (Kenawy et al., 2019).

Siderophores: PGPR có khả năng sản sinh siderophore giúp hấp thu sắt trong môitrường, từ đó bảo vệ cây khỏi sự tấn công của các mầm bệnh phụ thuộc sắt

(Egamberdieva et al., 2023) Các siderophores có sự đa dạng hóa học rất lớn như loại

carboxylate, hydroxamate, catecholate, phenolate và siderophores loại hỗn hợp Một sốsiderophores cũng thể hiện tác dụng của chúng như là chất kích thích ISR ở thực vật

(Kour et al., 2024).

Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi: hệ vi sinh vật trong thực vật và đất cũng tạo racác hợp chất hữu cơ dễ bay hơi giúp thúc đẩy sự phát triển của thực vật cũng như đóng

vai trò trong ISR (Kai et al., 2016) Các chất kích thích miễn dịch VOC này có nhiều

loại khác nhau và một số loại phổ biến là 2,3-butanediol, 3-pentanol, tridecane,

hexadecane và acetoin (Kour et al., 2024).

Lipopolysaccharide: lipopolysaccharide là thành phần thiết yếu giúp chống lại các tácnhân gây stress từ môi trường và là yếu tố thiết yếu cho sự xâm nhập vào vật chủ(Kagan, 2017) Nhiều tác động của LPS đến sự phát triển các phản ứng miễn dịch ởthực vật đã được ghi nhận, bao gồm sự bùng nổ oxy hóa, tạo NO, dòng chảy calciumvào tế bào, kích thích biểu hiện gen liên quan đến mầm bệnh và những thay đổi trongthành tế bào, chẳng hạn như sự tích tụ của phenolics và callose (Erbs & Newman,

2012)

Lipopeptide: nhiều lipopeptide mạch vòng như iturin, surfactin, lichenysin,fengycin, viscosin, amphisin và putisolvin được sản sinh bởi các PGPR để hạn chế sựphát triển của nấm bệnh Surfactin là lớp quan trọng của heptapeptide lipopeptide vòng,với nhiều hợp chất trong nhóm khác nhau ở độ dài chuỗi chất béo Bacillus được biếtđến là một ứng cử viên quan trọng để tạo ra surfactin, được biết là có khả năng gây ratình trạng kháng thuốc toàn thân khi áp dụng vào rễ ngay cả với lượng micromol (Kour

et al., 2023)

Salicylic acid: salicylic acid đóng vai trò trong nhiều quá trình bao gồm nảy mầmcủa hạt, chuyển động của khí khổng, sinh nhiệt, hoạt động của enzyme, tích lũy sắc tố,quang hợp, sinh tổng hợp ethylene, chức năng màng, thay đổi quá trình cắt bỏ, hấp thụchất dinh dưỡng, cảm ứng ra hoa và sự sinh trưởng và phát triển tổng thể của cây trồng(Ali, 2021)

Exopolysaccharides: exopolysaccharides là các polyme carbohydrate được tạo ra

bởi vi khuẩn trong quá trình phát triển và trao đổi chất của chúng (Kour et al., 2024) Exopolysaccharide từ Schizophyllum commune HNU-12 (SC-EP) được báo cáo về hiệu quả giảm bệnh trên ớt do Phytophthora Kết quả real-time PCR định lượng cho thấy sự

gia tăng đáng kể về biểu hiện của các gen phòng vệ CaBPR1, CaBGLU và CaPR-4trong lá ớt khi xử lý với SC-EP Hơn nữa, thành phần phenolic, hoạt tính phenylalanine

14ammonia lyase và hàm lượng salicylic acid tăng lên đáng kể ở cây được xử lý SC-EP

(Yu et al., 2022).

Rhamnolipids: rhamnolipids (RL) là chất hoạt động bề mặt sinh học glycolipidđược giải phóng bởi nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau, mono- và di-RL đóng vai trò là

tác nhân kích thích phản ứng bảo vệ thực vật (Kour et al., 2024).

N-acyl homoserine lacton: N-acyl-homoserine lactones (AHL) được sử dụng đểgiao tiếp trong quần thể, cảm biến đại số (quorum sensing - QS) Một số AHL có chuỗi

acyl dài có thể kích thích tính kháng ở cây trồng (Kour et al., 2024).

2.4 Vai trò của một số enzyme tham gia trong cơ chế kích kháng ở cây trồng 2.4.1 Vai trò của catalase

Catalase là một enzyme tetrameric có chứa heme với chức năng chống oxy hóa

phổ biến phổ biến, có tốc độ luân chuyển cao nhất (Suman et al., 2021; Mahomoodally

et al., 2022) Nó hiện diện trong các mô sống và là một enzyme quan trọng liên quan

đến sự phân hủy hydroperoxide thành nước và oxy phân tử (Mahomoodally et al.,

2022) Nó có hoạt tính enzyme rất cao và CAT có thể phân hủy khoảng 6×106phân tử

H2O2mỗi phút (Suman et al., 2021).

Catalase chủ yếu được tìm thấy trong peroxisome vì đây là trung tâm sản xuất

H2O2do quá trình oxy hóa β của acid béo, quang hô hấp, stress oxy hóa và dị hóa

purine (Suman et al., 2021) Bên cạnh đó, catalase có ở các bào quan khác như ty thể,

cytosol và lục lạp ở thực vật bậc cao Nhiều dạng phân tử của isozyme catalase chothấy vai trò linh hoạt của nó trong hệ thống thực vật (Sharma & Ahmad, 2014)

Theo cấu trúc và trình tự, catalase có thể được chia thành ba loại là catalase đơnchức năng hoặc catalase điển hình, catalase-peroxidase và pseudocatalase hoặc Mn

catalase (Mahomoodally et al., 2022) Trong thực vật hạt kín tồn tại ba gen CAT: CAT

loại I (trong mô quang hợp), CAT loại II (trong mô mạch) và CAT loại III (trong hạt và

cây con) (Suman et al., 2021) Các isozyme Catalase CAT-1, CAT-2, CAT-3 được mã

hóa lần lượt bởi các gen cấu trúc Cat1, Cat2 và Cat3 Sự biểu hiện gen CAT cho thấytính đặc hiệu của thời gian, loài và stress (Sharma & Ahmad, 2014)

2.4.2 Vai trò của peroxidase

Peroxidase là enzyme có khả năng khử hydrogen peroxide và các hydroperoxidekhác thành nước (Bindoli & Rigobello, 2013) Cơ chế phản ứng enzyme cho quá trìnhperoxide hóa được mô tả rất rõ ràng và bao gồm ba giai đoạn oxy hóa khử enzyme liêntiếp, dẫn đến tiêu thụ một đương lượng H2O2và oxy hóa hai đương lượng cơ chất khử(AH) (H2O2+ 2 AH → 2 H2O + 2A) (Christensen et al., 2001).

Nhiều dạng isoperoxidase được tìm thấy trong cùng một nguồn thực vật có thể khácnhau về khối lượng phân tử, điểm đẳng điện, độ pH và nhiệt độ tối ưu, tính đặc hiệu

của cơ chất, thành phần acid amin và đường cũng như độ ổn định nhiệt (Saraiva et

15

al., 2010) Peroxidase được phân biệt thành peroxidase heme và nonheme, tùy theo tính

chất hóa học của vị trí hoạt động tương tác với peroxide Peroxidase heme chứa trungtâm xúc tác heme; peroxidase nonheme có selenol hoặc thiol phản ứng tại vị trí hoạtđộng của chúng (Bindoli & Rigobello, 2013)

Peroxidase (POX) là các glycoprotein phân bố khắp nơi trong giới thực vật, nhìnchung có một số dạng isoenzyme, khả năng chịu nhiệt cao và khả năng tái tạo hoạtđộng sau khi bất hoạt nhiệt Các chức năng sinh lý của POX bao gồm tạo lớp, phân hủy

và chữa lành vết thương, phản ứng stress sinh học nói chung và bảo vệ chống lại sự tấn

công của mầm bệnh (Saraiva et al., 2010) Peroxidase, vừa oxy hóa phenol thành

quinone và tạo ra hydro peroxide Bản thân peroxidase không chỉ có tác dụng khángkhuẩn mà còn giải phóng các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và do đó làm tăngthêm tốc độ trùng hợp các hợp chất phenolic thành các chất giống như lignin (Agrios,2005) Những chất này sau đó được lắng đọng trong thành tế bào và nhú và cản trở sựtăng trưởng và lan rộng của mầm bệnh (Agrios, 2005)

2.4.3 Vai trò của polyphenol oxidase

Polyphenol oxydase (PPO), xuất hiện ở nhiều loại thực vật cùng với phenolics,xúc tác quá trình oxy hóa các phenol mono-, di- và polyhydric thành quinone (Yamane

et al., 2010) Hoạt động của nhiều enzyme oxy hóa phenol (polyphenol oxidase) nhìn

chung cao hơn ở mô bị nhiễm bệnh của các giống kháng bệnh so với mô nhạy cảm bịnhiễm bệnh hoặc ở cây khỏe mạnh không bị nhiễm bệnh (Agrios, 2005) Tất cả cácPPO thực vật được biểu hiện in vivo dưới dạng protein tiềm ẩn, không hoạt động,trước khi được kích hoạt bằng phương pháp phân giải protein bằng cách loại bỏ vùng

đầu C (Kaintz et al., 2014).

Quinone được hình thành bởi các phản ứng này hoạt động và liên kết cộng hóa trịvới chuỗi bên nucleophilic (–SH, –NH2, liên kết đôi NH) của protein và kết quả làlysine, histidine, cysteine và methionine bị mất khỏi protein và giá trị dinh dưỡng của

protein bị giảm đáng kể (Yamane et al., 2010) Tầm quan trọng của hoạt động của

polyphenol oxidase trong khả năng kháng bệnh có lẽ bắt nguồn từ đặc tính oxy hóa cáchợp chất phenolic thành quinone, thường gây độc cho vi sinh vật hơn so với phenolban đầu (Agrios, 2005)

2.4.4 Vai trò của phenylalanine ammonia-lyase

Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) bao gồm một tetramer với các tiểu đơn vị77– 83 kDa PAL xúc tác quá trình khử phenylalanine: liên kết đôi carbon-carbon đượchình thành trong quá trình giải phóng NH3, tạo ra acid trans-cinnamic Ở một số loại

cỏ, tyrosine được chuyển đổi thành acid 4-hydroxycinnamic trong phản ứng tương tựbởi tyrosine ammonia-lyase NH3được giải phóng có thể được tái cố định bằng phảnứng tổng hợp glutamine (Heldt & Piechulla, 2021)

16

Sự hình thành phytolalexins phenylpropanoid sau khi nhiễm nấm cho thấy sự cảmứng PAL rất nhanh (Heldt & Piechulla, 2021) Phenylalanine ammonia-lyase là enzymechủ chốt giúp tạo ra sự tổng hợp salicylic acid (SA), đưa đến tính kháng ở nhiều loạithực vật PAL đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các phenolic và

phytoalexin (Gurikar et al., 2022).

2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước

Rosellinia necatrix, Pyricularia oryzae, Agrobacteria tumefaciens và Xanthomonas campestris pv campestris.

Cây dưa leo được xử lý với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B579 ở mật số 108

CFU/mL giúp giảm tỷ lệ bệnh héo Fusarium đến 73,6% Hiệu quả giảm bệnh héo

Fusarium ở cây dưa leo được chứng minh do sự gia tăng hoạt động của các enzyme liên

quan đến phòng vệ ở thực vật là peroxidase, polyphenol oxidase và phenylalanineammonia-lyase khi xử lý với chủng vi khuẩn B579 (Chen et al., 2010)

Li et al (2015) đã báo cáo dịch nuôi cấy của chủng Bacillus amyloliquefaciens LJ02

(LJ02FB) có thể làm giảm hiệu quả sự xuất hiện của bệnh phấn trắng trên bầu bí Khiđược xử lý bằng LJ02FB, hàm lượng superoxide effutase, peroxidase, polyphenoloxidase và phenylalanine amoniac lyase trong mô cây tăng đáng kể so với đối chứng

Chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens S13-3 có thể làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh thán thư dâu tây do Colletotrichum gloeosporioides gây ra.

Biện pháp xử lý phun huyền phù chủng S13-3 lên lá đã kích hoạt sự biểu hiện của cácprotein liên quan đến sinh bệnh học, chitinase và β-1,3-glucanase trong lá dâu tây.Iturin A và surfactin được xác định kích hoạt tính kháng toàn thân trên cây dâu tây, dẫnđến giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh thán thư do nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây ra Hoạt động nhị chức năng của S13-3, bao gồm tác dụng đối

kháng và kích thích phản ứng bảo vệ thực vật bằng kháng sinh do nó tạo ra, có thể làmcho S13-3 trở thành tác nhân kiểm soát sinh học sáng tạo chống lại mầm bệnh thực vật

ở dâu tây (Yamamoto et al., 2015).

Kết quả nghiên cứu của Minaeva et al (2018) cho thấy quá trình vi khuẩn hóa cây lúa mì với vi khuẩn Pseudomonas làm tăng hoạt động của peroxidase trong lá và rễ cây.

17

Khi cây lúa mì chịu sự tấn công của Bipolaris sorokiniana, sẽ thiếu sự tương quan giữa

hoạt động của peroxidase trong rễ và lá lúa mì, đồng thời có sự thay đổi hoạt động theohướng tăng lên ở rễ, điều này đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển sức đề khángtoàn thân chống lại bệnh thối rễ

Bacillus amyloliquefaciens HG01 được báo cáo giúp kiểm soát bệnh thán thư do Colletotrichum acutatum trên sơn trà (loquat) (Eriobotrya japonica) Các nghiệm thức

xử lý với HG01 đã tăng cường đáng kể hoạt động của hai enzyme liên quan đến phòngthủ, đó là chitinase và β-1,3-glucanase Ngoài ra, sau khi xử lý bằng HG01, mức độbiểu hiện tương đối của các gen sau đã tăng lên đáng kể: phenylalanine amoniac lyase

2, peroxidase, ethylene-insensitive 3 và mandelonitrile lyase 1 (Wang et al., 2020) Bhattacharyya et al (2020) ghi nhận được việc xử lý vi khuẩn vùng rễ cây trà cho thấy hiệu quả bảo vệ cây lúa chống lại Rhizoctonia solani AG1-IA Biện pháp xử lý vi

khuẩn được chứng minh giúp kích hoạt các phản ứng bảo vệ chống oxy hóa bằngenzyme (ascorbate peroxidase, catalase, chitinase và phenylalanine ammonia-lyase) vàcác phản ứng bảo vệ chống oxy hóa không liên kết enzyme (proline và polyphenolics)

(Bhattacharyya et al., 2020).

Bacillus amyloliquefaciens LYZ69 được phân lập từ rễ cỏ linh lăng khỏe mạnh,

cho thấy hoạt tính kháng nấm in vitro mạnh chống lại Colletotrichum truncatum.

Chủng LYZ69 cho thấy hiệu quả giảm bệnh thán thư trên cỏ linh lăng khi thử nghiệmtrong điều kiện nhà lưới, với hiệu quả giảm bệnh đạt 82,6% Dịch nổi vô bào thu nhận

từ chủng LYZ69 (nồng độ 20%) lần lượt gây ra sự ức chế 60 và 100% sự phát triển của

sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao song songkhối phổ đã phân tách và xác định các lipopeptide như bacillomycin D và fengycin

trong dịch nổi vô bào của chủng LYZ69 (Hu et al., 2021).

Gowtham et al (2018) đã báo cáo cây ớt xử lý với B amyloliquefaciens giúp giảm tỷ lệ bệnh thán thư đến 71% trên ớt, theo sau là B cepacia và P rettgeri, trong

điều kiện nhà kính Sự gia tăng hoạt tính của các enzyme phòng vệ (phenylalanineamoniac lyase, peroxidase, polyphenol oxidase và β-1,3-glucanase) có sự liên quan đến

sự giảm bệnh ở những cây được xử lý PGPR Hoạt động của enzyme tăng gần gấp mộtđến hai lần ở cây con được xử lý PGPR so với đối chứng

Bacillus amyloliquefaciens L1-7 và B velezensis L3-5 nội sinh lá ớt cho thấy tỷ lệ

ức chế tăng trưởng lần lượt là 79 và 80% đối với sợi nấm Colletotrichum scovillei Hai chủng L1-7 và L3-5 cho thấy tỷ lệ kiểm soát C scovillei trên ớt trong điều kiện nhà lưới lần lượt là 80,64 và 73,39% (Wei et al., 2023).

Bacillus amyloliquefaciens PKM16 được báo cáo có khả năng ức chế Sclerotinia sclerotiorum gây hại trên cà chua, với dịch nuôi cấy có tế bào sống và dịch nuôi cấy đã

xử lý nhiệt ở 121°C Các nghiệm thức được xử lý vi khuẩn ghi nhận được sự gia tănghoạt động của các enzyme phòng thủ (peroxidase, catalase, polyphenol oxyase,

18phenylalanine amoniac-lyase và β-1,3-glucanase) ở giống cà chua Micro-Tom (Mattos

et al., 2023).

Chủng Bacillus velezensis ZN-S10 được báo cáo có khả năng làm giảm diện tích đốm lá do mầm bệnh Colletotrichum changpingense ZAFU0163-1 gây ra trên lá dâu

tây Chủng ZN-S10 tác động đến sự sản sinh và nảy mầm của bào tử nấm bệnh, ức chế

sự phát triển của sợi nấm và gây biến dạng sợi nấm Cao chiết thô thu nhận từ chủngZN-S10 gây ra sự chậm trễ trong chu kỳ tế bào của bào tử, có thể chịu trách nhiệm cho

sự ức chế nảy mầm của bào tử Trong số các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh họcđược phát hiện thông qua phân tích LC-MS và GC-MS tích hợp, 7-O-Succinylmacrolactin A, telocinobufagin và surfactin A có thể là các chất chuyển hóa chống nấmchính của chủng ZN-S10 Sự hiện diện của 7-O-Succinyl macrolactin A có thể giải

thích tổn thương tế bào ở ống sinh sản (Ye et al., 2023).

Magallón-Andalón et al (2024) đã nghiên cứu khả năng kiểm soát nấm C.

gloeosporioides gây hại trên bơ Hass của vi khuẩn Bacillus bBốn mươi ba chủng vi

khuẩn Bacillus được phân lập từ quả bơ 'Hass' Các chủng cho thấy khả năng đối kháng cao nhất chống lại C gloeosporioides là Bacillus pumilus AB31, B thuringiensis AB30, B thuringiensis AB7 và B thuringiensis AB21 Các chủng này có thể sản xuất

các enzyme ngoại bào, chẳng hạn như phosphatase, protease và β

glucosidase, cũng như đồng hóa D-ribose và trehalose Các cơ chế trên có thể giúp cácchủng vi khuẩn chống lại nấm bệnh

2.5.2 Trong nước

Công thức ngâm hạt và phun dịch trích lá sống đời (Kalanchoe pinnata) tươi hoặc héo; lá cỏ hôi (Eupatorium odoratum) héo hoặc lá cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides)

tươi có khả năng giúp giảm bệnh cháy lá lúa và ức chế sự hình thành bào tử của nấm

Pyricularia grisea Bên cạnh đó, nghiệm thức lá sống đời tươi hoặc héo còn giúp cho

phản ứng kháng bệnh của cây xuất hiện nhanh và nhiều hơn các nghiệm thức còn lại

(Trần Thị Thu Thuỷ và ctv., 2015)

Theo kết quả nghiên cứu của Trần Thị Thu Thủy et al (2010) tác nhân kích kháng

là calcium chloride không chỉ cho hiệu quả kích kháng tốt và bền trong điều kiện ngoàiđồng mà còn giúp gia tăng hoạt tính enzyme chitinase sớm và đạt đỉnh cao vào 144 giờsau khi phun nấm gây bệnh Đối với bệnh thán thư trên cà chua, chitosan có khả nănglàm giảm kích thước vết bệnh cấp 1, 2 và 3, giảm sự hình thành bào tử và gia tăng sựtích tụ polyphenol Đối với bệnh thán thư trên ớt, salicylic acid có khả năng giúp giảm

sự tấn công của bệnh thông qua làm giảm sự mọc mầm của bào tử nấm gây bệnh, ứcchế sự hình thành đĩa áp, kích thước đĩa áp, cho phản ứng tế bào thể hiện sớm và giatăng sự tích tụ polyphenol và callose

Trần Vũ Phến et al (2016) đã nghiên cứu khả năng kích kháng lưu dẫn của vi khuẩn Bacillus sp đối với bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra trong

điều

19kiện nhà lưới thông qua sự thay đổi hoạt tính của enzyme β-1,3- glucanase và chitinase

Kết quả đã ghi nhận các chủng Bacillus P78, P81, P84 và B amyloliquefaciens là tác

nhân kích kháng lưu dẫn triển vọng đối với bệnh cháy lá lúa, giúp cây lúa có mức độnhiễm bệnh thấp hơn so với đối chứng không xử lý, với hiệu quả giảm bệnh khoảng

90% Trong cây lúa được kích kháng, các chủng Bacillus P84, P81 và B.

amyloliquefaciens có sự gia tăng hoạt tính β-1,3- glucanase và chitinase, tương ứng

theo thứ tự về hiệu quả giảm bệnh Sự gia tăng hoạt tính của các enzyme này có thể

liên quan tới khả năng kích kháng lưu dẫn của vi khuẩn Bacillus đối với bệnh cháy lá

lúa

Lê Thanh Toàn và Văng Viết Bình (2021) đã sử dụng dịch trích củ tỏi, lá mù u và

lá dừa cạn dưới dạng dịch trích đơn thuần và dịch trích kết hợp với dung dịch kẽmacetate 1 mM Trong điều kiện in vitro, dịch trích lá dừa cạn và dịch trích lá dừa cạn kết

hợp kẽm acetate cho hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn lạc Xanthomonas oryzae pv.

oryzae lần lượt là 24,32 và 100% Ở điều kiện nhà lưới, xử lý dịch trích lá dừa cạn

thông qua áo hạt và phun lên tán lá lúa ở 15, 30 và 45 ngày sau gieo giúp kích thích tếbào cây lúa tổng hợp polyphenol kháng khuẩn sớm và kéo dài đến 96 h sau lây bệnh.Thời gian giảm bệnh trên lá lúa sau khi xử lý dịch trích kéo dài đến 14 ngày sau lâybệnh Ở thời điểm này, mật số vi khuẩn gây bệnh trong lá lúa xử lý bằng dịch trích thấp

hơn so với đối chứng không xử lý.

Chủng vi khuẩn nội sinh lúa Bacillus velezensis VY03 có hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây bệnh bạc lá lúa Điều kiện nuôi

cấy tối ưu để chủng VY03 sinh trưởng và sinh hoạt chất đối kháng Xoo là môi trường

có pH 7, NaCl 10 g/L, sucrose là nguồn carbon và năng lượng, cao thịt là nguồn nitơ,nhiệt độ nuôi cấy là 37°C, thời gian nuôi cấy 40 giờ Thí nghiệm nhà lưới đánh giá hiệuquả phòng chống bệnh bạc lá trên giống lúa Bắc ơm số 7 cho thấy hiệu quả kiểm soátbệnh cao (71,6%) khi sử dụng dịch nuôi chủng VY03 theo chế độ phòng-chống (phuntrước và sau khi nhiễm Xoo) Bước đầu đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh bạc lá cũngtrên giống lúa Bắc ơm số 7 trong điều kiện tự nhiên cho thấy, chủng VY03 có hiệu quảkiểm soát bệnh tốt khi được áp dụng kết hợp xử lý đất ươm mạ và phun khi xuất hiện

bệnh, hiệu quả đạt 75 - 85% (Nguyễn Thị Hiếu và ctv., 2021).

Ngô Thành Trí và Phạm Văn Kim (2022) đã báo cáo clorua đồng (0,05 mM) vàoxalic acid (0,5 mM) cho thấy hiệu quả cao nhất trong việc làm giảm bệnh vàng lùntrên cây lúa Kết quả ELISA cho thấy nồng độ Rice grassy stunt virus trong cây lúa xử

lý với clorua đồng (0,05 mM) hoặc oxalic acid (0,5 mM) giảm có ý nghĩa so với đốichứng (đối chứng nhiễm bệnh) Ngoài ra, xử lý clorua đồng (0,05 mM) và oxalic acid(0,5 mM) cho thấy gia tăng có ý nghĩa về tỷ lệ chồi hữu hiệu, tỷ lệ bông trỗ thoát,chiều dài bông lúa, tỷ lệ hạt chắc và trọng lượng hạt chắc so với đối chứng nhiễmbệnh, đồng thời tương đương so với đối chứng khỏe Ảnh hưởng nồng độ khác nhaucủa clorua đồng (0,025; 0,05 và 0,1 mM) và oxalic acid (0,25; 0,5 và 1 mM) cho thấyclorua đồng (0,05; 0,1 mM) và oxalic acid (0,5; 1 mM) đều tạo nên kích kháng chốnglại bệnh vàng lùn tương

20đương nhau Do đó, clorua đồng (0,05 mM) và oxalic acid (0,5 mM) cần được chọn đểcung cấp nguồn chất kích kháng tốt cho việc quản lý bệnh vàng lùn bằng biện phápkích kháng trên cây lúa

Nguyễn Thị Thuý Ngân và ctv (2024) đã báo cáo biện pháp hun dịch trích lá cây

hoa ngũ sắc 3 và 5% lên lá lúa kết hợp cả hai thời điểm 14 và 7 ngày trước chủng bệnhgiúp giảm chiều dài vết bệnh tương đương với sử dụng thuốc hóa học Starner 20 WPđến 21 ngày sau chủng bệnh (NSCB) Hoạt tính của ba enzyme liên quan đến cơ chếkháng bệnh bạc lá gồm peroxidase, catalase và polyphenol oxidase tăng khi cây lúađược phun dịch trích cây hoa ngũ sắc và tăng cao hơn khi có sự hiện diện của cả dịchtrích cây hoa ngũ sắc và mầm bệnh

Nguyễn Thị Diệu Hạnh và ctv (2023) đã báo cáo chủng vi khuẩn B.

amyloliquefaciens D19 có khả năng ức chế mạnh Colletotrichum siamensis Chủng D19

sinh tổng hợp các enzyme như chitinase, protease, cellulase và dịch nuôi cấy của chủng

này đã tác động lên vách tế bào của hệ sợi tơ nấm C siamense với các biểu hiện như

trương phình, đứt gãy, gấp khúc, phân hủy tế bào của hệ sợi tơ nấm Thử nghiệm khả

năng đối kháng trên quả xoài cho thấy dịch nổi vô bào của vi khuẩn B.

amyloliquefaciens D19 làm giảm hơn 98,7% mức độ biểu hiện bệnh gây ra bởi C siamense.

Phạm Thiết Trình và ctv (2024) ghi nhận được biện pháp phun cao chiết lá sốngđời với nồng độ 1% lên lá lúa ở thời điểm 7 ngày trước chủng bệnh giúp giảm chiều dàivết bệnh tương đương với thuốc hóa học Starner 20 WP ở 7, 14 và 21 ngày sau chủngbệnh Kết quả khảo sát hoạt tính của bốn enzyme liên quan đến cơ chế kháng bệnh gồmperoxidase, catalase, polyphenol oxidase và phenylalanine ammonia-lyase cho thấy khảnăng giúp giảm bệnh bạc lá của cao chiết lá sống đời có liên quan đến cơ chế kíchkháng Hoạt tính của POX, PPO và PAL giảm trong khi hoạt tính của CAT tăng khi câylúa được chủng bệnh Khi được phun cao chiết, hoạt tính của bốn enzyme đều tăngnhưng POX và PPO tăng sớm hơn Hoạt tính của các enzyme này tăng cao hơn khi câylúa được chủng bệnh và được xử lý với cao chiết

21

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh và nhà lưới thuộc Khoa Môitrường và Tài nguyên thiên nhiên, Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 02/2022 đến tháng08/2022

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

3.1.2.1 Thiết bị

Tủ cấy vô trùng (ESCO, Singapore), cân điện tử (Đài Loan), tủ lạnh trữ mẫu(Sanyo, Nhật Bản), nồi khử trùng nhiệt ướt (Sturdy, Đài Loan), lò vi sóng (Sanyo, NhậtBản), tủ ủ vi sinh vật (Binder, Đức), máy vortex (IKA MS 3 Digital, Malaysia), máykhuấy từ (HB50 BIBBY, Anh), máy đo quang phổ Genesys UV/Vis 10S (Thermo

Scientific, Hoa Kỳ).

3.2.2.2 Dụng cụ

Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, ống falcon 50 mL, eppendorf 1,5 và 2 mL, bìnhErlenmeyer 250 – 500 mL, que cấy, kim mũi giáo, đèn cồn , bộ micropipette BioRadP10, P20, P50, P200, P1000, đầu cone xanh, đầu cone vàng, cá từ, cuvette nhựa,cuvette thạch anh

3.1.3 Tên hoá chất

- Môi trường nuôi cấy nấm thán thư

Thành phần môi trường Luria-Bertani Agar (Miller et al., 1972): peptone 10 g/L,

yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L, agar 20 g/L, pH= 7,0±0,2

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn VL4.6

Thành phần môi trường potato dextrose agar (PDA) (U.S Food and Drug, 2001):khoai tây 200 g/L, D-Glucose 20 g/L, agar 20 g/L, pH = 5,6±0,2

- Hóa chất để trích ly và khảo sát hoạt tính enzyme: nitơ lỏng, sodium acetate(Merck, Đức), acetic acid (Merck, Đức), H2O2(Merck, Đức), guaicol (HiMedia, ẤnĐộ), L-phenylalanine (HiMedia, Ấn Độ), sodium borate (Merck, Đức), boric acid(Merck, Đức), HCl (Merck, Đức), KH2PO4(Merck, Đức), Na2HPO4.2H2O (Merck,Đức), EDTA (Sigma, Hoa Kỳ), bren catechol (HiMedia, Ấn Độ)

3.1.4 Vật liệu

Chủng nấm C lagenarium AG1 được phân lập từ lá dưa leo nhiễm bệnh thán thư,

được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

22

Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens VL4.6 được phân lập từ đất vùng rễ cây dưa

leo (Lê Thị Mỹ Nhân, 2018), được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh, Viện Côngnghệ Sinh học và Thực phẩm

Hạt giống dưa leo TN123 được cung cấp bởi Công ty TNHH Trang Nông

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Khảo sát hiệu quả giảm bệnh thán thư của chủng vi khuẩn B.

amyloliquefaciens VL4.6 trong điều kiện nhà lưới

Mục tiêu

Đánh giá được hiệu quả giảm bệnh thán thư trên dưa leo của chủng VL4.6 trongđiều kiện nhà lưới Đồng thời, xác định được mật số vi khuẩn và biện pháp xử lý giúpđạt được hiệu quả giảm bệnh cao

Nhân tố 1: gồm 3 mật số vi khuẩn 104, 106và 108tế bào/mL.

Nhân tố 2: gồm 3 biện pháp xử lý (phun lá, tưới đất và kết hợp phun lá – tưới đất).Hai nghiệm thức đối chứng (đối chứng âm – phun nước sạch, đối chứng dương –phun thuốc hoá học) được bố trí giống như trên

Trồng và chăm sóc cây dưa leo trong điều kiện nhà lưới

Chuẩn bị đất: đất được phơi khô trong khoảng 2 tuần, làm nhuyễn và xử lý bằngvôi Sau đó, đất được cho vào chậu có kích thước khoảng 30×25 cm, mỗi chậu chứakhoảng 3 kg đất

Xử lý nảy mầm: hạt giống dưa leo giống được ngâm với nước ấm (45-55°C) trongkhoảng 6 giờ Hạt giống sau khi ngâm được ủ qua đêm với khăn bông ẩm vô trùng chohạt nảy nầm Hạt giống nảy mầm được gieo trực tiếp vào chậu

Chăm sóc và bón phân: cây được tưới nước mỗi ngày một lần Mỗi cây được bón

1 g phân bón tan chậm hoàn chỉnh (16:16:8) (Descalzo et al., 1990).

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn: chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens VL4.6

được nuôi cấy trên môi trường NA trong 24 giờ Sinh khối của vi khuẩn được huyềnphù trong nước muối sinh lý vô trùng, vortex cho tan đều và đo độ truyền quang(optical density - OD) ở bước sóng 600 nm Điều chỉnh dịch huyền phù vi khuẩn để đạtgiá trị

23

OD600= 0,1 mật số vi khuẩn đạt tương đương 108tế bào/mL Huyền phù vi khuẩn đượcchuẩn bị khoảng một giờ trước khi xử lý

Xử lý huyền phù vi khuẩn và xử lý đối chứng

Phun huyền phù vi khuẩn qua lá: phun 1 mL huyền phù vi khuẩn đều hai mặt mỗi

lá ở mỗi cây ở thời điểm 25 ngày sau gieo (tương ứng 5 NTCB) Vi khuẩn được phunvào buổi chiều mát nhằm tránh ảnh hưởng đến vi khuẩn

Tưới huyền phù vi khuẩn vào đất: tưới đều khoảng 5 mL huyền phù vi khuẩn vàomỗi gốc dưa leo sau khi gieo hạt 1 ngày

Kết hợp phun lá và tưới đất: tưới đất với 5 mL huyền phù vi khuẩn 1 ngày sau

gieo và phun lá ở thời điểm 25 ngày sau gieo.

Đối chứng âm: phun 1 mL nước cất vô trùng đều hai mặt mỗi lá dưa leo

Đối chứng dương: phun đều 5 mL Antracol 70WP (liều lượng 50 g/8 L nước) lêncác lá của dưa leo

Chủng bệnh

Chủng nấm Colletotrichum lagenarium được nuôi cấy trên môi trường PDA trong

7 ngày trong điều kiện che tối liên tục Dịch huyền phù bào tử nấm được chuẩn bị bằngcách dàn trải đều khuẩn lạc nấm với nước cất vô trùng bằng kim mũi giáo vô trùng.Hỗn hợp thu được được lọc qua giấy lọc để loại bỏ đi khuẩn ty Mật độ bào tử đượcxác định bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu và điều chỉnh về mật số 105bào

tử/mL bằng nước cất vô trùng (Descalzo et al., 1990) Huyền phù bào tử nấm bệnh (1

mL) được phun lên mỗi lá ở thời điểm 30 ngày sau gieo Quá trình chủng bệnh đượcthực hiện vào buổi chiều mát

Ghi nhận và xử lý số liệu

Xác định tỷ lệ diện tích lá bệnh: các lá bệnh ở mỗi nghiệm thức được chụp ảnh lại

Lá bệnh được phân tích bằng phần mềm ImageJ nhằm xác định tỷ lệ diện tích lá bệnh.Các ảnh chụp lá bệnh được xoá nền trước khi xử lý bằng phần mềm ImageJ Hìnhảnh lá bệnh được thêm vào phần mềm và sử dụng lệnh Polygon Selection để khoanhvùng lá dưa leo Sau đó, lệnh Edit-Clear outside được sử dụng để xoá nền xung quanh

lá Lệnh Image – Adjust – Color Threshold được sử dụng để chuyển màu sang dạng bit Thông số Brightness được điều chỉnh về khoảng 1-254

8-Tổng diện tích lá: thông số Saturation trong thang màu xanh lá được điều chỉnhsao cho toàn bộ lá được tô đỏ Sau đó, lệnh Analyze – Analyze Particles – Summarize –

OK được thực hiện để xác định diện tích lá

Diện tích vết bệnh: thông số Saturation trong thang màu xanh lá được điều chỉnhsao cho toàn bộ vết bệnh thán thư có đặc điểm như đã mô tả bên trên được tô đỏ Sau

phenylalanine ammonia-lyase trong mô lá dưa leo dưới tác động của chủng VL4.6 vớimật số và biện pháp có hiệu quả giảm bệnh cao nhất từ thí nghiệm mô tả ở mục 3.2.1

Nghiệm thức 5: xử lý nước cất vô trùng, có chủng bệnh

Nghiệm thức 6: xử lý nước cất vô trùng, không chủng bệnh

Trồng và chăm sóc cây dưa leo: cây dưa leo được trồng và chăm sóc như đã mô

tả ở mục 3.2.1

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn: như đã mô tả ở mục 3.2.1.

Xử lý huyền phù vi khuẩn: như đã mô tả ở mục 3.2.1.

Chủng bệnh: như đã mô tả ở mục 3.2.1.

Thu mẫu lá

Lá dưa leo được thu sau mỗi 24 giờ ở thời điểm từ 0 đến 7 ngày sau khi chủng

bệnh Lá thật thứ hai được sử dụng cho thí nghiệm (Descalzo et al., 1990) Lá được gói

trong giấy bạc và trữ ở -20°C để ly trích enzyme

25

Ly trích enzyme

Một gram (1 g) mô lá tươi được xử lý bằng nitơ lỏng và đồng nhất với 10 mLdung dịch đệm Na-acetate 0,1 M (pH 5,2) Thu lấy 2 mL phần dịch của hỗn hợp tiến

hành ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°C (Mohamed et al., 2020) Hoạt tính

của enzyme được xác định trong phần dịch nổi

Khảo sát hoạt tính peroxidase

Trong phản ứng này, POX đóng vai trò xúc tác phản ứng oxy hóa-khử giữa phân