Phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư và bệnh thối cuống ở quả bơ và bước đầu nghiên cứu khả năng bảo quản quả bơ bằng dịch chiết lá trầu
PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có điều kiện khí hậu thổ nhưỡng thuận lợi cho việc trồng loại rau kể loại rau thuộc vùng khí hậu ơn đới vậy, nước ta nước có sản phẩm rau phong phú đa dạng giới Các sản phẩm rau nước ta không phục vụ nhu cầu tiêu dùng nước mà trở thành mặt hàng xuất vào thị trường giới Cây bơ (Persea americana) loại ăn có khả xuất mang lại giá trị kinh tế cao Các sản phẩm từ bơ sử dụng đa dạng Nó khơng nguồn thực phẩm giàu giá trị dinh dưỡng, mang lại giá trị cảm quan, giá trị kinh tế cao cịn có tác dụng việc chữa trị bệnh Đặc biệt, tinh dầu chiết xuất từ bơ có tác dụng việc tái tạo giữ ẩm da, góp phần vào việc chăm sóc sắc đẹp sức khỏe Mặc dù, đất đai, thời tiết khí hậu số vùng nước ta thuận lợi cho phát triển bơ, song sản suất bơ nước ta gặp nhiều khó khăn Năng suất phẩm chất bơ thấp so với tiềm Nguyên nhân chủ yếu tình trạng tổn thất sau thu hoạch nấm bệnh gây ra, bệnh thán thư bệnh thối cuống bệnh thường gặp gây hại nghiêm trọng bơ, làm giá trị thẩm mỹ đồng thời làm giảm phẩm chất bơ gây tổn thất cho người trồng, ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng Để hạn chế nấm bệnh gây hư hỏng sau thu hoạch nhằm bảo quản rau nói chung, bơ nói riêng việc sử dụng hóa chất phổ biến Tuy nhiên, xã hội ngày phát triển đại xu người hướng đến việc sử dụng hợp chất tự nhiên, hạn chế tối đa việc đưa nguồn độc hại vào thể qua đường ăn uống thể rõ Các loại sản phẩm bảo quản chế phẩm sinh học thật an tồn hơn, khơng độc hại đến sức khỏe người sử dụng cịn thân thiện với mơi trường Lá trầu không chứa 0,8-1,8% tinh dầu thơm gồm chủ yếu hai phenol: betel- phenol đồng phân của eugenol chavicol kèm theo nhiều hợp chất phenolic khác, có nhiều đặc tính sinh học quan trọng như: kháng khuẩn, kháng nấm, [4] Theo phát triển khoa học người ta bắt đầu nghiên cứu tính chất trầu khơng để ứng dụng y học, kháng khuẩn kháng nấm… Một phương pháp bảo quản nông sản sau thu hoạch tạo màng bao để bảo quản chitosan có khả tạo màng bám dính cao Chitosan điều chế từ chitin hợp chất polymer sinh học ngồi cịn có nhiều ưu điểm khác như: không độc hại, dễ dàng bị phân hủy nên không gây dị ứng phản ứng phụ, đồng thời thân thiện với mơi trường lại có tính kháng nấm kháng khuẩn tốt [1] Nhờ đặc tính mà chitosan ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực đặc biệt lĩnh vực nông nghiệp: kháng khuẩn, kháng nấm, màng bao bảo quản (xoài, đu đủ, mận, ) Việc nghiên cứu sử dụng kết hợp dịch chiết trầu không màng bao chitosan bảo quản bơ hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Từ vấn đề nêu thực đề tài: “Phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư bệnh thối cuống bơ bước đầu nghiên cứu khả bảo quản bơ dịch chiết trầu’’ 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư bệnh thối cuống bơ khả bảo quản bơ dịch chiết trầu PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Quả bơ nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư thối cuống bơ - Dịch chiết trầu 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập làm nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư bơ - Xác định hình thái định danh loài phương pháp sinh học phân tử - Xác định thời gian nảy nầm bào tử - Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết trầu đến khả ức chế bệnh điều kiện invitro - Xác định số thành phần hóa học bơ trước bảo quản - Nghiên cứu khả bảo quản bơ dịch chiết từ trầu: + Tỷ lệ hư hỏng (thối cuống hay thán thư) + Thời gian bảo quản + Sự thay đổi tính chất lý hóa q trình bảo quản: cường độ hơ hấp, hàm lượng chất khơ hịa tan, hàm lượng đường tổng số, hàm lượng axit, tổn thất khối lượng, độ cứng, hàm lượng Vitamin C, hàm lượng lipit + Chất lượng bơ sau bảo quản: tiêu giá trị cảm quan 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập đinh danh loài 2.3.1.1 Phương pháp thu mẫu bệnh - Mẫu bệnh thu từ bơ có triệu chứng vết bệnh ban đầu đến điển hình rửa nước để loại tạp chất Tiếp theo khử trùng cồn 70°C sau rửa lại nước cất vô trùng - Mẫu bệnh ủ hộp bọc túi PE ghi thông tin cần thiết (địa điểm, tên giống, ngày tháng thu mẫu…) 2.3.1.2 Phương pháp phân lập định danh loài Phân lập nấm phương pháp Koch môi trường PDA làm gởi định danh loài phương pháp sinh học phân tử 2.3.2 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ trầu [2] - Cân 100g bột vào 300ml dung môi methanol: cho 100g bột vào bình tam giác có chứa 300ml methanol, đậy kín miệng giấy bạc tránh nhiễm vi sinh vật - Ngâm lắc: Tiến hành ngâm lắc dung dịch máy lắc 250 vòng/phút 24 để dung môi ngấm kiệt vào - Ly tâm thu dịch chiết : để tách cặn, thu dịch chiết ta đem li tâm lạnh 4000 vòng/ phút 40 phút Sau li tâm thu dịch chiết chiết xuất dung môi methanol Dịch chiết thu được chứa bình tam giác vô trùng - Dịch chiết đem cô quay chân không nhiệt độ 40°C khối lượng khơng đổi Thu dịch chiết chứa bình vơ trùng - Bảo quản nhiệt độ 4°C 2.3.3 Xác định thời gian nảy mầm bào tử Trên đĩa môi trường cấy nấm C gloeosporioides đặt tủ ấm 28°C, sau ngày ta tiến hành thu bào tử vào eppendorf, nuôi giữ bào tử tủ ấm Cứ sau 1h lấy μl bào tử từ eppendorf làm tiêu quan sát kính hiển vi để xác định thời gian nảy mầm bào tử 2.3.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng dịch chiết từ trầu đến đường kính tản nấm 2.3.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng dịch chiết từ trầu kết hợp với chitosan bảo quản bơ 2.3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm bảo quản bơ sau thu hoạch bơ Qủa Rửa (cồn 70°, nước cất) Tạo màng bao chitosan 0,5% kết hợp dịch chiết trầu nồng độ 0,00 g/ml Tạo màng bao chitosan 0,5% kết hợp dịch chiết trầu nồng độ 0,04 g/ml Tạo màng bao chitosan 0,5% kết hợp dịch chiết trầu nồng độ 0,16 g/ml Tạo màng bao chitosan 0,5% kết hợp dịch chiết trầu nồng độ 0,08 g/ml Bảo quản (25°C) Các công thức bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với lần lặp ngày phân tích chải tiêu lần 2.3.4.2 Phương pháp phân tích tiêu sinh lý, sinh hóa Cứ ngày phân tích tiêu lần, lần lặp lại cho tiêu để quan sát thay đổi tính chất lý hóa q trình bảo quản * Xác định độ cứng Nguyên lý: Dưới tác dụng lực không đổi đơn vị thời gian xuất phản lực phản lực trở lại giá trị lực ghi nhận hình hiển thị độ cứng Thiết bị: Thiết bị đo độ cứng Shimpo Đơn vị đo Newton (N) Tiến hành: - Bật nút khởi động “On” - Thiết lập đơn vị đo (N) - Thiết lập máy N - Cho mẫu bơ cần đo vào phía đầu mũi đâm dũng lực định ấn cần gạt xuống xuyên vào thịt - Đọc kết hiển thị máy - Tiến hành đo lần, đo vị trí khác lấy kết trung bình *Xác định cường độ hô hấp Nguyên lý: Cường độ hơ hấp số mg khí CO2 tạo hô hấp đơn vị thời gian đoen vị khối lượng Khi đặt mẫu hộp kín khoảng thời gian định tích tụ lượng CO hơ hấp tạo Thiết bị: ICA -250/153 Tiến hành: Mẫu bơ chọn ngẫu nhiên tù mẫu thí nghiệm Cân khối lượng cho vào hộp kín có thể tích định Trên nắp hộp có nút cao su để hút khí tạo thành qua trình hơ hấp, sau chuyển tồn lượng khí tạo thành vào thiết bị đo nhờ hệ thống bơm có thiết bị Các hộp đặt điều kiện bảo quản sau nhiệt độ phòng 25°C tiến hành đo hơ hấp Cách đo sau: - Khởi động thiết bị - Điều chỉnh trị số máy tiêu chuẩn khơng khí (21% O2, 0% CO2) - Khởi động hệ thống bơm cắm đường ống dẫn khí qua nút cao su nắp hộp Bấm nút cho bơm hút khơng khí từ hộp - Kết đo cường độ hô hấp hiển thị nồng độ CO (%) màng hình thiết bị (đọc ghi giá trị lớn nhất) Tính kết quả: Trong đó: R: Cường độ hơ hấp (mg CO2/kg.h) Vtd: Thể tích tự hộp (ml) (Vtd= Vhộp – Vquả) mq: khối lượng công thức đem đo % CO2: nồng độ phần trăm CO2 đo máy T: thời gian từ lúc đậy hộp chứa mẫu đến lúc đo (h) *Xác định hàm lượng ethylene Nguyên lý: Ethylen loại hormone thực vật tạo thành giai đoạn phát triển trồng đặc biệt giai đoạn chín Khi đặt mẫu hộp kín khoảng trời gian tích tụ lượng ethylen tạo Thiết bị: ICA -56 Tiến hành: Mẫu bơ chọn ngẫu nhiên từ mẫu thí nghiệm Cân khối lượng cho vào hộp kín có thể tích định Trên nắp hộp có nút cao su để hút khí (C2H2 ) thành q trình chin quả, sau chuyển tồn lượng khí tạo thành vào thiết bị đo nhờ hệ thống bơm có thiết bị Các hộp đặt điều kiện bảo quản sau nhiệt độ phịng 25°C tiến hành đo đọ chín Cách đo sau: - Khởi động thiết bị - Điều chỉnh trị số máy - Khởi động hệ thống bơm cắm đường ống dẫn khí qua nút cao su nắp hộp Bấm nút cho bơm hút khí từ hộp - Kết đo hiển thị nồng độ C 2H4 (ppm) màng hình thiết bị (đọc ghi giá trị lớn nhất) Tính kết quả: Trong đó: E: Cường độ sản sinh ethylene (µC2H4/kg.h) e: nồng độ ppm C2H4 Vtd: Thể tích tự hộp (ml) (Vtd= Vhộp – Vquả) mq: khối lượng công thức đem đo T: thời gian từ lúc đậy hộp chứa mẫu đến lúc đo (h) *Xác định hàm lượng chất khơ hịa tan Sử dụng chiết quang kế cầm tay để xác định hàm lượng chất khơ hịa tan, biểu thị độ Brix (°Bx) giới hạn 0-32°Bx Nguyên lý: Chất khơ hịa tan dịch có khả khúc xạ ánh sáng Thông qua việc xác định hệ số ánh sáng dịch ép tính nồng độ chất rắn hòa tan nguyên liệu Tiến hành: Nghiền nhỏ mẫu Lấy phần hỗn hợp cho vào miếng vải mịn, ép lấy 1-2 giọt lên lăng kính Kết quả: Là số quan sát ống kính, cộng thêm sai số nhiệt độ lúc tiến hành đo.Hàm lượng chất khơ hịa tan giá trị trung bình lần lặp lại nồng độ theo dõi *Xác định số Vitamin C phương pháp chuẩn độ Iốt [3] Nguyên lý: Vitamin C có khả khử dung dịch Iốt Từ lượng Iốt bị khử Vitamin C có mẫu suy hàm lượng Vitamin C Tiến hành: Cân xác 5g mẫu bơ, nghiền nhỏ cối sứ với 5ml HCl 5%, cho vào bình định mức dẫn đến vạch 100ml nước cất, khuấy đều, tiến hành lọc mẫu Lấy 20ml dich lọc cho vào bình tam giác, cho thêm 2-3 giọt tinh bột 1% tiến hành chuẩn độ Iốt 0,01N đến dung dịch có màu xanh nhạt dừng lại Tính tốn kết quả: Trong đó: V: số ml dung dịch iod 0,01N dùng chuẩn độ V1: thể tích dịch mẫu thí nghiệm (100 ml) V2: thể tích dịch mẫu lấy để xác định (10 ml) m: khối lượng mẫu (g) 0,00088: số gam Vitamin C tương ứng với ml dung dịch Iốt 0,01N *Xác định hàm lượng axit tổng số [3] Nguyên lý: Axit hữu dễ hòa tan nước Nước chiết rút chuẩn độ NaOH hay KOH 0,1N để trung hòa hết axit thị phenolphthalein 1% Tiến hành: - Cân xác 15g mẫu bơ, nghiền nhỏ cối sứ với cho vào bình tam giác 250 ml, thêm nước cất đến vạch 150ml, khuấy đều, đun cách thủy 80°C 15 phút, sau làm nguội - Chuyển tồn dich mẫu vào bình định mức 250ml, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ, để lắng sau lọc mẫu giấy lọc - Lấy 25 ml dịch lọc vịa bình tam giác 100ml, thêm giọt phenolphthalein 1%, chuẩn độ NaOH 0,1N đến xuất màu hồng nhạt bền 15 giây - Ghi lại số ml NaOH 0,1N dung để chuẩn độ - Lặp lại chuẩn độ lần, lấy kết trung bình ta V (ml) dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ axit Tính tốn kết quả: Trong đó: V: số ml dung dịch NaOH 0,01N dùng chuẩn độ (ml) V1: thể tích dịch mẫu thí nghiệm (ml) V2: dung tích bình định mức (ml) m: khối lượng mẫu (g) K: hệ số axit tương ứng *Xác định tỉ lệ tổn thất Tỉ lệ tổn thất tổng tỉ lệ hao hụt khối lượng tỉ lệ hư hỏng Tiến hành: Dùng cân kỹ thuật để xác định khối lượng mẫu lần đo, từ tính tỉ lệ hao hụt khối lượng so với ban đầu Tính tốn kết quả: Trong đó: X: Tỉ lệ hao hụt trọng lượng theo thời giam bảo quản (%) M1: Khối lượng trước xử lý (g) M2: Khối lượng ngày phân tích (g) *Xác định hàm lượng đường tống số phương pháp Bertrand [3] Nguyên lý: Dựa vào phản ứng oxy hóa khử đường khử với ion kim loại để xác định hàm lượng đường glucose có nguyên liệu Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch glucose -Lấy mẫu bơ nghiền cối chày sứ -Cho gam mẫu nghiền vào bình tam giác 250ml, sau thêm 50ml nước cất 5ml HCl tinh khiết thực thủy phân nồi cách thủy nhiệt độ 70°C phút -Sau thủy phân cần làm lạnh vòi nước chảy -Trung hòa lại NaOH 0,1N 10 Định lượng đường khử - Cho vào bình nón dung tích 250ml: dung dịch Felling A 25 ml, dung dịch Felling B 20ml đun sôi -Cho vào tiếp tục 10 ml dung dịch glucose chuẩn bị 20 ml nước cất, tiếp tục đun sơi, giữ phút - Lấy bình nghiêng cho Cu2O lắng xuống Dung dịch bên lớp cặ phải có màu xanh Cu(OH)2 Nếu dung dịch bên có màu lục, màu vàng nâu nghĩa không đủ lượng đồng cần thiết, phải làm lại lấy lượng dung dịch glucose hơn, cuối thêm nước cất vào để thu khoảng 50 ml dung dịch - Khi kết tủa Cu2O thực trình rửa kết tủa phễu Bucne có gắn với máy lọc hút chân khơng sau: + Chắc từ từ dung dịch Felling qua phễu Bucne, cẩn thận giữ tủa Cu 2O bình nón ngập dung dịch để Cu2O không bị tiếp xúc với oxy khơng khí tạo thành CuO + Bật máy lọc chân không để dung dịch Felling hút nhanh Trong q trình lọc ln giữ lớp dung dịch giấy lọc để bỏa vệ kết tủa Cu 2O bề mặt giấy + Sau từ từ khoảng 20ml nước cất vào bình nón, lắc nhẹ chắt nước rửa tủa tương tự Quá trình rửa tủa lặp lại lần - Sau rửa tủa thực q trình hịa tan tủa sau: + Thay bình hút lọc cũ bình + Đổ dung dịch Fe2(SO4)2 hòa tan kết tủa Cu2O bình nón lên lớp cặn cịn lại phễu + Tráng bình nón rửa phễu dung dịch Fe2(SO4)2 khơng cịn kết tủa bình nón phễu + Hút xuống bình lọc tráng rửa lại nước cất đun sôi, hút xuống bình lọc - Lấy bình lọc chuẩn độ dung dịch sắt II hình thành dung dịch KMnO4 0,1N xuất màu hồng nhạt bền 15 giây - Đọc số ml KMnO4 0,1 N dùng đem tra bảng để có lượng đường glucose Tính kết quả: 11 Hàm lương đường tồn phần biểu thị đường glucose tính cơng thức: Trong đó: M1 : Khối lượng đường glucose(mg) tương ứng với số ml KMnO 0,1N đọc bảng M2 : Khối lượng thực phẩm cân lúc đầu (g) *Xác định hàm lượng lipit tự phương pháp Soxlhet [3] Nguyên lý: Dùng ete nóng để hòa tan chất béo tự thực phẩm Sau để bay hết ete, cân chất béo cịn lại tính lượng lipit 100 g thực phẩm Tiến hành: - Cân bình cầu sấy khơ đến khối lượng khơng đổi - Cân xác g mẫu thử nghiền nhỏ đồng đều, trộn với 40 g Na2SO4 CaSO4 khan, cho vào giấy gói vào giấy lọc - Dùng miếng bơng hút ẩm có thấm ete để lau cối sứ gói miếng bơng vào chất thử - Cho gói thử vào ống chiết máy - Cho ete vào bình cầu khoảng 2/3 thể tích - Lắp soxlhet - Cho nước chảy qua ống sinh hàn - Bật điện để máy hoạt động - Chiết hết hoàn toàn lipit Thử cách hứng vài giọt ete lên mảnh giấy lọc, sau để bay hết ete mà giấy lọc khơng có vết loang chứng tỏ chiết hết lipit mẫu thử - Khi ete chảy hết xuống bình, rút bình để bay hết ete nhiệt độ thường cho vào tủ sấy 100-150°C 90 phút Để nguội bình hút ẩm 30-35 phút cân Tính kết quả: 12 Hàm lượng lipit 100 g thực phẩm tính sau: Trong đó: P : Khối lượng bình cầu chứa chất béo (g) P’: Khối lượng bình cầu (g) G: khối lượng thực phẩm cân để xác định hàm lượng chất béo (g) 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu Kết thí nghiệm phân tích phương sai nhân tố ANOVA (Anova single factor) so sánh giá trị trung bình phương pháp DUNCAN (Duncan’s Multiple Range Test) phần mềm thống kê SAS, phiên 9.1 chạy môi trường Windows PHẦN III KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 13 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Allan et al., The fungicidal effect of chitosan on fungi of vary cell wall composition, Experimental Mycology, 3, tr 285- 287, 1979 [2] Huỳnh Thị Kim Diệu, Nguyễn Văn Thành, Sự chủng hoạt tính kháng khuẩn trầu không (Piper betle L) lốt (Piper LoLot ) đồng sông Cửu Long, Tạp chí khoa học,17, tr 282-288, 2011 [3] Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 2011 [4] G.E Stovold, Senior research scientist agricultural research centre wollongbar, Plant pathologist and J.F Dirou, tr 5-6, 2004 KẾ HOẠCH THỰC HIỆN 14 ST T Dự kiến công việc Ngày tiến hành Phân lập nấm gây bệnh thán thư thối cuống 25/7/2015- 25/8/2015 Gởi định danh 25/8/2015- 01/9/2015 Xác định thời gian nảy mầm bào tử 25/8/2015- 01/9/2015 Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết trầu đến khả ức chế bệnh điều kiện invitro 03/9/2015- 15/9/2015 Đánh giá ảnh hưởng dịch chiết từ trầu kết hợp với chitosan bảo quản bơ 1/10/2015- 15/11/2015 Viết báo cáo 15/11/2015- 15/12/2015 Huế, ngày tháng Ghi năm 2015 Sinh viên thực Trưởng môn (QLCLTP) Giáo viên hướng dẫn 15 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HUẾ KHOA CƠ KHÍ – CƠNG NGHỆ ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: Phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư bệnh thối cuống bơ bước đầu nghiên cứu khả bảo quản bơ dịch chiết trầu Sinh viên thực hiện: Lê Thị Thùy Linh Lớp: CNTP45 Giáo viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thỵ Đan Huyền Bộ môn: Quản lý chất lượng thực phẩm Huế, 2015 16 ... ml dung d? ??ch iod 0,01N d? ?ng chuẩn độ V1: thể tích d? ??ch mẫu thí nghiệm (100 ml) V2: thể tích d? ??ch mẫu lấy để xác định (10 ml) m: khối lượng mẫu (g) 0,00088: số gam Vitamin C tương ứng với ml dung... NaOH 0,1N dung để chuẩn độ - Lặp lại chuẩn độ lần, lấy kết trung bình ta V (ml) dung d? ??ch NaOH 0,1N d? ?ng để chuẩn độ axit Tính tốn kết quả: Trong đó: V: số ml dung d? ??ch NaOH 0,01N d? ?ng chuẩn... 10 Định lượng đường khử - Cho vào bình nón dung tích 250ml: dung d? ??ch Felling A 25 ml, dung d? ??ch Felling B 20ml đun sôi -Cho vào tiếp tục 10 ml dung d? ??ch glucose chuẩn bị 20 ml nước cất, tiếp