KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA,KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA POLYPHENOL CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CÂY RAU SAM

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG ĐỀ CƯƠNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA, KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA POLYPHENOL CĨ TRONG DỊCH CHIẾT CÂY RAU SAM (Portulaca oleracea) Ngành : Công nghệ sinh học SV : Trần Nguyễn Hương Trang Lớp : 10060301 GVHD : TS.Trần Thị Dung Thành phố Hồ Chí Minh tháng 09 năm 2014 MỤC LỤC CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích phạm vi đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu rau sam 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Thành phần hóa học 2.1.5 Công dụng 2.1.6 Dược tính 2.2 Quá trình oxy hóa thể chất chống oxy hóa 2.2.1 Q trình oxy hóa thể sống .2 2.2.2 Gốc tự trình chống oxy hóa thể sống 2.3 Chất chống oxy hóa .2 2.3.1 Khái quát chất chống oxy hóa 2.3.2 Một số chất chống oxy hóa phổ biến 2.3.3 Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa 2.4 Phương pháp trích ly polyphenol 2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly polyphenol 2.4.2 Các phương pháp trích ly polyphenol sản xuất cao chiết thô 2.5 Giới thiệu nấm, vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 2.5.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm Aspergillus niger (A.niger) 2.5.2 Phân loại khoa học đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) 2.5.3 Phân loại khoa học đặc điểm sinh học vi khuẩn Staphylococus Aureus (S.Aureus) CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm .3 3.1.2 Thời gian .3 3.2 Nội dung nghiên cứu 3.3 Vật liệu thí nghiệm 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm .3 3.3.3 Hóa chất mơi trường thí nghiệm 3.4 Phương pháp thí nghiệm 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Định tính thành phần bột rau sam khô 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxy hóa rau sam 3.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cao chiết polyphenol từ rau sam .8 3.4.4 Khảo sát độc tính tế bào rau sam ấu trùng tôm Atermia salina .10 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 11 PHỤ LỤC 11 TÀI LIỆU THAM KHẢO .11 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Dược thảo nguồn nguyên liệu quý giá thiên nhiên ban tặng cho người Ngày có nhiều nghiên cứu hợp chất thứ cấp thực vật có hoạt tính có ích chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, có khả điều trị bệnh người Đóng góp vào kho nguyên liệu dược thảo đa dạng ấy, rau sam (Portulaca oleracea) lồi có nhiều dược tính, sử dụng nhiều đời sống Ngoài P oleracea cịn có khả kháng nấm, kháng khuẩn, ngăn chặn nhiễm độc gan, chống lại tế bào ung thư… Trong đời sống ngày, cây rau sam mang lại nhiều công dụng hữu ích Trong đề tài này, thực trích ly khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn khảo sát độc tố polyphenol có dịch chiết rau sam 1.2 Mục đích phạm vi đề tài - Trích ly hợp chất polyphenol từ rau sam - Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến q trình trích ly hợp chất polyphenol từ rau sam - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết rau sam - Khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn dịch chiết rau sam - Khảo sát độc tính tế bào dịch chiết rau sam 2 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu rau sam 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Thành phần hóa học 2.1.5 Cơng dụng 2.1.6 Dược tính 2.2 Q trình oxy hóa thể chất chống oxy hóa 2.2.1 Q trình oxy hóa thể sống 2.2.2 Gốc tự trình chống oxy hóa thể sống 2.3 Chất chống oxy hóa 2.3.1 Khái quát chất chống oxy hóa 2.3.2 Một số chất chống oxy hóa phổ biến 2.3.3 Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa 2.4 Phương pháp trích ly polyphenol 2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly polyphenol 2.4.2 Các phương pháp trích ly polyphenol sản xuất cao chiết thô 2.5 Giới thiệu nấm, vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 2.5.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm Aspergillus niger (A.niger) 2.5.1.1 Phân loại khoa học 2.5.1.2 Đặc điểm sinh học 2.5.2 Phân loại khoa học đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) 2.5.2.1 Phân loại khoa học 2.5.2.2 Đặc điểm sinh học 2.5.3 Phân loại khoa học đặc điểm sinh học vi khuẩn Staphylococus Aureus (S.Aureus) 2.5.3.1 Phân loại khoa học 2.5.3.2 Đặc điểm sinh học CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm Phịng Cơng Nghệ Sinh Học – Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học – Khoa Khoa Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Tơn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh 4 3.1.2 Thời gian Đề tài thực từ tháng 3.2 /201 đến tháng /201 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát thành phần hóa học rau sam - Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxy hóa rau sam - Nghiên cứu tách chiết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa kháng nấm, kháng khuẩn dịch chiết polyphenol từ rau sam - Thử nghiệm độc tính tế bào dịch chiết rau sam ấu trùng tơm 3.3 Vật liệu thí nghiệm 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu Lá thân rau sam (Portulaca oleracea) 3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm 3.3.3 Hóa chất mơi trường thí nghiệm 3.4 Phương pháp thí nghiệm 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Định tính thành phần bột rau sam khơ  Thí nghiệm 1: Khảo sát diện thành phần hợp chất hữu bột rau sam khô phương pháp hóa học Mục đích: Định tính số loại hợp chất hữu cớ có bột rau sam khô như: flavonoid, tannin, saponin, alkaloid, steroid terpenoid, glycoside Phương pháp thực hiện: 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxy hóa rau sam 3.4.2.1 Xác định thành phần khối lượng rau sam 3.4.2.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu - Nguyên tắc: Mẫu cân sấy 105oC, nước bốc hơi, làm giảm khối lượng Cân suy độ ẩm - Tiến hành: Sấy chén sứ đến khối lượng khơng đổi, Cân xác 10g mẫu sấy 105oC 2h, sau lấy để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút Sau cân thu khối lượng cịn lại tính độ ẩm theo công thức: Độ ẩm = (10-a) x 100 3.4.2.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số rau sam điều kiện ảnh hưởng đến trình tách chiết  Xác định hàm lượng PP tổng số rau sam  Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng PP tổng số hoạt tính chống oxy hóa Thí nghiệm gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần Nghiệm thức 1: Dung môi ethanol 96% Nghiệm thức 2: Dung môi methanol 50% Nghiệm thức 3: Dung môi aceton 50% Nghiệm thức 4: Nước Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột rau sam ngâm 200ml dung môi theo nghiệm thức Sau 60 phút, đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman Dịch lọc ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút Đun cách thủy sau ly tâm nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu Dịch chiết pha lỗng với nước cất thể tích dung môi chiết ban đầu, ta dịch chiết thô Chỉ tiêu: Xác định dung mơi thích hợp để trích ly lượng PP cao Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang dịch trích ly  Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng PP tổng số hoạt tính chống oxy hóa Thí nghiệm gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần Nghiệm thức 1: 60 phút Nghiệm thức 2: 120 phút Nghiệm thức 3: 180 phút Nghiệm thức 4: 240 phút Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột rau sam ngâm 200ml dung môi tối ưu vừa xác định Sau khoảng thời gian theo nghiệm thức, đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman Dịch lọc ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút Đun cách thủy sau ly tâm nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu Dịch chiết pha loãng với nước cất thể tích dung mơi chiết ban đầu, ta dịch chiết thô Chỉ tiêu: Xác định thời gian chiết tốt cho hàm lượng PP cao Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang dịch trích ly  Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng PP tổng số hoạt tính chống oxy hóa Thí nghiệm gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần Nghiệm thức 1: Nhiệt độ 20oC 7 Nghiệm thức 2: Nhiệt độ 30oC Nghiệm thức 3: Nhiệt độ 40oC Nghiệm thức 4: Nhiệt độ 50oC Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột rau sam ngâm 200ml dung môi thời gian tối ưu vừa xác định Đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman Dịch lọc ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút Đun cách thủy sau ly tâm nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu Dịch chiết pha loãng với nước cất thể tích dung mơi chiết ban đầu, ta dịch chiết thô Chỉ tiêu: Xác định nhiệt độ chiết tốt cho hàm lượng PP cao Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang dịch trích ly  Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết đến hàm lượng PP tổng số hoạt tính chống oxy hóa Thí nghiệm gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần Nghiệm thức 1: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/5 Nghiệm thức 2: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 Nghiệm thức 3: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 Nghiệm thức 4: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/30 Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột rau sam ngâm tỉ lệ nguyên liệu/dung môi theo nghiệm thức với loại dung môi, thời gian tối ưu nhiệt độ vừa xác định Đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman Dịch lọc ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút Đun cách thủy sau ly tâm nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu Dịch chiết pha loãng với nước cất thể tích dung mơi chiết ban đầu, ta dịch chiết thô Chỉ tiêu: Xác định tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết tốt cho hàm lượng PP cao Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang dịch trích ly 3.4.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết điều kiện tối ưu  Thí nghiệm 6: Xác định hoạt tính chống oxy hóa – khả quét gốc tự 2,2 – diphenyl – 1- picrylhydrazyl (DPPH) Phương pháp tiến hành: Lấy 50 l mẫu trộn với 1.95 ml thuốc thử DPPH Lắc mạnh hỗ hợp để yên tối nhiệt độ phòng Phương pháp theo dõi: Sau 45 phút đo độ hấp thu bước sóng 515 nm Kết báo cáo giá trị IC50 nồng độ dịch chiết khử 50% gốc tự DPPH điều kiện Chỉ tiêu: Giá trị IC50 thấp hoạt tính khử gốc tự DPPH cao Mẫu đối chứng: làm tương tự mẫu thí nghiệm, thay mẫu nước cất Hoạt tính chống oxy hóa, đo % quét gốc tự DPPH tính theo cơng thức sau [4], [24]: % qt DPPH = 100% Trong đó: A0 : độ hấp thụ mẫu đối chứng Ax : độ hấp thụ mẫu thí nghiệm  Thí nghiệm 7: Xác định tổng lực khử Nghiệm thức 1: 0.05 ml Nghiệm thức 2: 0.15 ml Nghiệm thức 3: 0.1 ml Nghiệm thức 4: 0.2 ml 9 Phương pháp tiến hành: Cho vào ống nghiệm, ống với thể tích khác dịch chiết rau sam đệm pH 6.6 để đạt thể tích 1.5 ml trước thêm 0.5 ml K3[Fe(CN)6] 1% Lắc hỗn hợp ủ 50oC 20 phút Sau thêm 0.5 ml TCA 10% ml nước cất, cuối cùng, 0.4 ml AlCl3 0.1% thêm vào Lắc Mẫu đối chứng: Cho vào ống nghiệm 0.5 ml K3[Fe(CN)6] 1%, 0.2 ml nước cất, 0.8 ml dung dịch đệm phosphate 6.6 Lắc ủ ấm 50oC 20 phút Lấy ra, cho 0.5 ml TCA 10%, ml nước cất 0.4 ml AlCL3 0.1% Lắc Phương pháp theo dõi: Sau 45 phút, đem mẫu đo bước song 700nm Chỉ tiêu: Độ hấp thụ cao tổng lực khử mạnh Kết tính tốn qua giá trị IC50  Thí nghiệm 8: Xác định khả hạn chế oxy hóa chất béo mơ hình -carotene – linoleic Phương pháp tiến hành: -carotene hòa tan 10 ml CHCl3 Loại bỏ phần dung dịch Thêm vào 40 mg acid linoleic 400 mg Tween 40 Cho bốc Chloroform nhiệt độ 40oC phút Rửa cặn nước cất 30 phút Thêm từ từ 50 ml nước cất vào, lắc tạo hệ nhũ tương, đem ủ 50 oC 120 phút Phương pháp theo dõi: Đo quang phổ 470 nm 15 phút vịng 1h  Thí nghiệm 9: Xác định khả hạn chế hình thành hydroperoxide (HPO) mơ hình dầu – nước Phương pháp tiến hành: 2ml dịch chiết trộn với 10 ml hệ nhũ tương dầu – nước chứa ống nhựa 50 ml có nắp đậy, đặt tủ ổn nhiệt 50oC Phương pháp theo dõi: Hàm lượng HPO xác định theo phương pháp Mark Herbert (2002) 3.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cao chiết polyphenol từ rau sam 10 3.4.3.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Escheria coli Staphilocuccus aureus cao chiết rau sam  Thí nghiệm 10: Khảo sát hoạt tính khuẩn cao chiết PP rau sam Escheria coli Staphilocuccus aureus Phương pháp tiến hành: Môi trường: Môi trường cao thịt - pepton sau khử trùng, cho vào đĩa petri có đáy phằng, đặt bề mặt phẳng để có bề dày đồng (khoảng 4mm), để nguội nhiệt độ phòng Dịch chuẩn: Lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml muối sinh lý hấp khử trùng, lắc đều, đem so độ đục với ống Mc.Farland ( có độ đục tương đương 108 CFU/ml) Trải vi khuẩn lên mặt thạch: Dùng que cấy tam giác trang huyền phù dịch vi khuẩn lên đĩa petri, đợi mặt thạch khô Cao PP: Cân 0.363g cao PP cho vào ml nước cất dung dịch PP gốc có nồng độ 80 mg/ml Sau lọc vơ trùng Thử nghiệm khả kháng khuẩn: Dùng kẹp gắp giấy lọc hình trịn đường kính 5mm (được gọi đĩa kháng sinh) hấp khử trùng đặt lên bề mặt đĩa petri trải khuẩn, cách thành đĩa petri 1cm Nhỏ trực tiếp 30 l dịch chiết lên đĩa kháng sinh Đem ủ đĩa petri 28 – 30oC, sau 24h tiến hành thu nhận kết Phương pháp theo dõi: Theo dõi đường kính vịng kháng sinh (Ampicillin Amoxcillin) sau ngày ủ  Thí nghiệm 11: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MCI) cao PP Nghiệm thức 1: Nồng độ 40 mg/ml Nghiệm thức 2: Nồng độ 20 mg/ml 11 Nghiệm thức 3: Nồng độ 10 mg/ml Nghiệm thức 4: Nồng độ mg/ml Nghiệm thức 5: Nồng độ 2.5mg/ml Nghiệm thức 6: Nồng độ 1.25 mg/ml Nghiệm thức 7: Nồng độ 0.65 mg/ml Phương pháp tiến hành: Pha dung dịch gốc có nồng độ 80 mg/ml Pha loãng dung dịch gốc thành nồng độ theo nghiệm thức Thực tương tự thí nghiệm 10 Phương pháp theo dõi: Theo dõi đường kính vịng kháng sinh sau ngày 3.4.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm Aspergiluss niger cao chiết PP từ rau sam  Thí nghiệm 12: Khảo sát hoạt tính kháng nấm Aspergiluss niger cao chiết PP từ rau sam Thí nghiệm gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần Nghiệm thức 1: Dung môi ethanol 70% (đối chứng) Nghiệm thức 2: Dịch cao PP 10 mg/ml Nghiệm thức 3: Dịch cao PP 20 mg/ml Nghiệm thức 4: Dịch cao PP 30 mg/ml Nghiệm thức 5: Dịch cao PP 40 mg/ml Nghiệm thức 6: Dịch cao PP 50 mg/ml Phương pháp thực hiện: Cấy tơ nấm đĩa thạch môi trường (PGA), để nhiệt độ phòng cho tơ nấm lan tỏa Phương pháp theo dõi: Theo dõi đường kính tơ nấm lan tỏa sau -3 ngày cấy 12 3.4.4 Khảo sát độc tính tế bào rau sam ấu trùng tôm Atermia salina  Thí nghiệm 13: Khảo sát độc tính tế bào rau sam ấu trùng tôm (Atermia salina) Nghiệm thức 1: 10 g/ml Nghiệm thức 2: 100 g/ml Nghiệm thức 3: 1000 g/ml Phương pháp thực hiện: chuẩn bị môi trường nước biển nhân tạo nuôi cấy ấu trùng tôm Ấu trùng sử dụng sau - ngày nở Thêm vào 10 ml nước biển có chứa ấu trùng tôm vào lọ khác Bổ sung dung môi theo nghiệm thức vào lọ Ủ 37 oC 24h Phương pháp theo dõi: Dùng kính lúp quan sát sống sót ấu trùng tôm lọ CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 ... loại khoa học 2.5.1.2 Đặc điểm sinh học 2.5.2 Phân loại khoa học đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) 2.5.2.1 Phân loại khoa học 2.5.2.2 Đặc điểm sinh học 2.5.3 Phân loại khoa. .. loại khoa học 2.5.3.2 Đặc điểm sinh học CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm Phịng Cơng Nghệ Sinh Học – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Khoa Khoa... sinh học nấm Aspergillus niger (A.niger) 2.5.2 Phân loại khoa học đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) 2.5.3 Phân loại khoa học đặc điểm sinh học vi khuẩn Staphylococus Aureus