Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hồng Sinh viên thực hiện: Lê Hoàng Khải MSSV: 1211100095 Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan toàn nội dung đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Nguyễn Ngọc Hồng - giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Tất số liệu, kết đề tài thu qua nghiên cứu thực nghiệm hoàn toàn trung thực Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng năm 2016 Lê Hoàng Khải LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công nghệ TP.HCM tạo điều kiện cho em học tập trường Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, người tận tình dạy, truyền đạt kiến thức quý báu cho em, cho em thỏa sức tìm tòi học hỏi điều mới, dù có đâu làm gì, em ln tự hào đứa đại gia đình Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Con xin cảm ơn cha, mẹ em trai, người cho ngày hơm Gia đình ln hỗ trợ tài chính, động viên tinh thần suốt thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Ngọc Hồng, người tận tình hướng dẫn, dạy cho em kiến thức tuyệt vời, truyền đạt kinh nghiệm quý báu kỹ sống Được làm việc nhóm nghiên cứu em niềm vinh dự hạnh phúc Xin cảm ơn bạn thể lớp 12DSH giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu động viên tinh thần thời gian qua Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng năm 2016 Lê Hồng Khải MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Tình hình nghiên cứu ngồi nước Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu ĐATN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chi Adenosma sp.và loài Adenosma bracteosum Bonati 1.1.1 Tổng quan chi Adenosma sp 1.1.2 Tổng quan Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 1.1.2.1 Tên khoa học 1.1.2.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2.3 Một số thành phần hóa học nghiên cứu 1.1.2.4 Hoạt tính sinh học 12 1.1.2.5 Một số thuốc từ Nhân trần 15 1.2 Định nghĩa gốc tự do, stress oxy hóa chất chống oxy hóa 15 1.2.1 Khái niệm gốc tự stress oxy hóa 15 1.2.2 Chất chống oxy hóa 17 1.2.3 Tác hại stress oxy hóa 18 i 1.3 1.2.3.1 Tác động lên DNA 18 1.2.3.2 Tác động lên protein 19 1.2.3.3 Tác động lên lipid 19 Hợp chất tự nhiên từ thực vật hoạt tính sinh học 20 1.3.1 Terpenoid 20 1.3.1.1 Định nghĩa, phân loại 20 1.3.1.2 Nguồn gốc ứng dụng 20 1.3.2 Steroid 22 1.3.2.1 Định nghĩa, phân loại 22 1.3.2.2 Nguồn gốc ứng dụng 23 1.3.3 Polyphenol 24 1.3.3.1 Định nghĩa, phân loại 24 1.3.3.2 Nguồn gốc, ứng dụng 25 1.3.3.3 Flavonoid 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đề tài 27 2.1.1 Địa điểm 27 2.1.2 Thời gian thực đề tài 27 2.2 Vật liệu 27 2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 27 2.2.2 Đối tượng thí nghiệm 27 2.2.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Xác định độ ẩm 30 2.3.2 Quá trình chiết thu nhận cao chiết 31 2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng cao thu 33 2.3.4 Phương pháp định tính thành phần hóa học Nhân trần tía 33 ii 2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 36 2.3.6 Phương pháp định lượng flavonoid tổng số 36 2.3.7 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa mơ hình DPPH 37 2.3.8 Phương pháp xác định lực khử 38 2.3.9 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 39 2.3.10 Xác định độc tính cấp diễn 41 2.3.11 Đánh giá hoạt tính cao chiết chuột bạch ứng dụng mơ hình ổn định lượng đường máu 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Thử độ ẩm dược liệu 45 3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết 45 3.3 Định tính thành phần hóa học có dịch chiết Nhân trần tía 47 3.4 Định lượng polyphenol tổng số dịch chiết 54 3.5 Định lượng flavonoid tổng số 56 3.6 Xác định hoạt tính kháng gốc tự DPPH 58 3.7 Xác định lực khử 60 3.8 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 62 3.8.1 Hoạt tính kháng khuẩn sơ cao cồn cao nước 62 3.8.2 Hoạt tính kháng khuẩn sơ cao phân đoạn 63 3.9 3.10 Kết thử độc tính cấp diễn 64 Ảnh hưởng dịch chiết Nhân trần tía lên lượng đường máu 65 3.10.1 Ảnh hưởng việc uống glucose liều cao đến nồng độ đường máu chuột 66 3.10.2 Ảnh hưởng loại cao chiết đến nồng độ đường máu 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1 Kết luận 69 4.2 Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic AQ: aqueous (nước) BU: n-butanol CH: chloroform db: gam dược liệu khô DMSO: Dimethyl sulfoxyde DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA: Ethyl acetate ET: ethanol (cồn) GE: Gallic acid equivalent HCTN: hợp chất tự nhiên IC50: half maximal inhibitory concentration RE: Rutin equivalent RNS: Reactive Nitrogen Species ROS: Reactive Oxygen Species TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số) TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số) TPHH: thành phần hóa học TSA: tryptone soya agar TSB: tryptone soya broth iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các thành phần hóa học có tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati 10 Bảng 1.2 Các ROS RNS thể sinh học 16 Bảng 1.3 Các bệnh liên quan đến oxy hóa DNA 18 Bảng 1.4 Các bệnh liên quan đến oxy hóa protein 19 Bảng 1.5 Các bệnh liên quan đến oxy hóa lipid 20 Bảng 2.1 Nồng độ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 41 Bảng 2.2 Bảng tra nồng độ đường huyết 44 Bảng 3.1 Độ ẩm dược liệu 45 Bảng 3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung môi 45 Bảng 3.3 Khảo sát hàm lượng thu hồi sau chiết lỏng-lỏng cao cồn 46 Bảng 3.4 Kết phân tích sơ thành phần hóa học 47 Bảng 3.5 Hình ảnh định tính thành phần hóa học 48 Bảng 3.5 Kết đường chuẩn acid gallic 54 Bảng 3.6 Kết hàm lượng polyphenol tổng số cao chiết 55 Bảng 3.7 Bảng kết đường chuẩn Rutin 56 Bảng 3.8 Kết hàm lượng Flavonoid tổng số 57 Bảng 3.9 Độ hấp thụ quang bước sóng 700 nm nồng độ 25 g/ml 61 Bảng 3.10 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ cao tổng cồn cao tổng cồn nồng độ 100 mg/ml 62 Bảng 3.11 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ cao phân đoạn 63 Bảng 3.12 Kết thử độc tính cấp diễn 65 Bảng 3.13 Kết nồng độ lượng đường máu chuột 65 Bảng 3.14 Nồng độ đường máu nhóm uống glucose liều cao 66 Bảng 3.15 Khả làm giảm đường huyết dịch chiết Nhân trần tía lên đường huyết nhóm chuột uống đường glucose liều cao 67 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati Hình 2.1 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 29 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết cao chiết Nhân trần tía 31 Hình 2.3 Phản ứng quét gốc tự DPPH 37 Hình 2.4 Phản ứng xác định lực khử 39 Hình 2.5 Chuột bạch dùng cho thí nghiệm 42 Hình 3.1 Dung dịch dựng đường chuẩn acid gallic 54 Hình 3.2 Đường chuẩn acid gallic 54 Hình 3.3 Dung dịch Rutin chuẩn 56 Hình 3.4 Đường chuẩn Rutin 57 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 cao chiết thí nghiệm quét gốc tự DPPH 59 Hình 3.7 Biểu đồ thể lực khử cao chiết 61 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Gốc tự tạo trình trao đổi chất thể tác nhân oxy hóa gây nhiều bệnh nguy hiểm bệnh đường tim mạch, viêm gan, đục thủy tinh thể, lão hóa, đột biến gen gây ung thư Về mặt hóa học, gốc tự bền nên dễ dàng công đại phân tử sinh học protein, lipid, carbohydrate, DNA Điều dẫn đến rối loạn cân q trình sinh hóa ngun nhân gây nhiều loại bệnh tật Do đó, việc tìm hợp chất chống oxy hóa có khả ức chế gốc tự trình gián tiếp sinh gốc tự điều cần thiết Chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thiên nhiên tổng hợp hóa học Tuy nhiên, hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có nhiều lợi so với hợp chất tổng hợp hợp chất tổng hợp gây phản ứng phụ viêm gan ung thư Bên cạnh đó, hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên tác dụng dược lý tốt Ngồi vấn đề liên quan đến đường huyết ln người quan tâm đến lượng đường máu dù tăng hay giảm so với mức bình thường tác động khơng tốt đến sức khỏe Chứng tăng đường huyết ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh đái tháo đường, bệnh trước dân gian thường gọi “bệnh người giàu” Tăng đường huyết biểu triệu chứng lâm sàng vấn đề đường huyết nghiêm trọng Các thói quen ăn uống khơng điều độ, chế độ dinh dưỡng nhiều đồ ngọt, đồ béo uống loại thức uống có cồn rượu, bia hoạt động thể chất hay hoạt động lựa chọn ảnh hưởng đến lượng đường máu hình thành bệnh tiểu đường Cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati từ lâu dân gian sử dụng vị thuốc với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da Ngồi có chứa nhiều hợp flavonoid 73,16 Bảng 5.5 Cao phân đoạn Ethyl acetate Nồng độ Mẫu cao ban đầu (mg/ml) Nồng độ sau (g/ml) 0 0,5 12,20 Khả bắt gốc Trung bình (%) (%) - - 29,09 27,29 28,19  0,90 28,19 37,18 24,39 36,28 Cao phân đoạn 36,78  0,46 36,88 Ethyl acetate EA 1,5 45,88 36,59 43,48 44,88  1,25 45,28 59,37 48,78 60,87 59,82  0,91 59,22 84,41 73,17 84,26 84,31  0,09 84,26 Bảng 5.6 Cao phân đoạn n-butanol Nồng độ Mẫu cao ban đầu (mg/ml) Nồng độ sau (g/ml) Khả bắt gốc (%) 15 Trung bình (%) 0 - 0,5 12,20 13,97 14,52 15,00  1,34 16,52 26,32 24,39 29,04 Cao phân đoạn n-butanol BU 27,16  1,63 26,13 1,5 42,47 36,59 46,64 44,34  2,12 43,92 56,44 48,78 53,90 55,90  1,79 57,35 2,5 70,60 60,97 68,78 69,57  0,93 69,33 Bảng 5.7 Cao phân đoạn nước Nồng độ Mẫu cao ban đầu (mg/ml) Cao phân đoạn nước Nồng độ sau (g/ml) Khả bắt gốc Trung bình (%) (%) - - 16,64 24,39 13,79 15,44  1,48 15,89 31,78 47,78 27,14 29,39 16 29,44  2,32 43,03 73,17 41,38 Cao phân đoạn nước 42,83  1,36 44,08 68,52 95,24 66,27 66,72  1,62 65,37 85,16 121,95 85,76 85,46 17 85,46  0,30 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ KHẢO SÁT NĂNG LỰC KHỬ Nồng độ Mẫu (g/ml) Trung bình 0,184  0,003 0,319  0,004 10 0,433  0,002 15 0,671  0,003 20 0,751  0,004 25 0,806  0,003 0,249  0,003 0,273  0,004 10 0,287  0,002 15 0,295  0,003 20 0,314  0,004 25 0,336  0,003 0,171  0,001 0,196  0,002 10 0,209  0,003 15 0,214  0,002 20 0,219  0,002 25 0,231  0,003 0,199  0,004 0,212  0,006 10 0,231  0,006 15 0,236  0,007 Vitamin C ET AQ CH 18 20 0,238  0,008 25 0,245  0,009 0,237  0,008 0,249  0,007 10 0,267  0,009 15 0,275  0,006 20 0,293  0,003 25 0,359  0,004 0,172  0,002 0,178  0,003 10 0,185  0,002 15 0,215  0,002 20 0,253  0,003 25 0,268  0,004 50 0,325  0,001 0,225  0,004 0,230  0,005 10 0,237  0,005 15 0,268  0,005 20 0,281  0,007 25 0,315  0,006 EA BU W 19 PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Bảng 7.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao tổng Cao cồn (100 mg/ml) Cao n (100 mg/ml) Chủng Lần Lần Lần Trung bình (mm) E coli 10 10,5 10 10,17  0,29 ETEC 17 16 16,5 16,50  0,50 ETEC 14 14 13,5 13,83  0,29 Bảng 7.2 Hoạt tính kháng khuẩn cao phân đoạn Chủng Cao Lần Lần Lần Trung bình (mm) S aureus BU 50 mg/ml 8 8,33  0,58 CH 50 mg/ml 7,5 7,50  0,50 EA 50 mg/ml 7,5 8 7,83  0,29 BU 50 mg/ml 7,5 7,50  0,50 W 100 mg/ml 8 7,5 7,83  0,29 CH 50 mg/ml 8,5 7,5 8,00  0,50 EA 50 mg/ml 7,5 8,5 8,33  0,76 ETEC E coli Bảng 6.3 Hoạt tính kháng khuẩn ciprofloxacin 500 g/ml Chủng Escherichia coli Enterotoxigenic E.coli - ETEC Listeria monocytogenes Salmonella typhii Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Lần 15 30 33 30 14 14 20 Lần 14,5 30 33,5 31 15 14,5 Lần Trung bình (mm) 15 14,83  0,29 30,5 30,17  0,29 33 33,17  0,29 32 31,00  1,00 15 14,67  0,58 15 14,50  0,50 PHỤ LỤC 8: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ BẰNG SAS 9.4 Hàm lượng polyphenol tổng (TPC) ‘TPC’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: HAMLUONG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 353908.9331 Error 12 217.0913 Corrected Total 17 354126.0244 70781.7866 3912.55 F 353908.9331 70781.7866 3912.55 F Model 34930.62964 Error 12 65.03827 Corrected Total 17 34995.66791 6986.12593 1288.99 F 34930.62964 6986.12593 1288.99