Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần loài, tính gây bệnh và khả năng phòng chống nấm colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông hồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN DUY HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LỒI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN DUY HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LỒI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHỊNG CHỐNG NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật Mã số : 9620112 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hà Viết Cường TS Hoàng Chúng Lằm HÀ NỘI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố hay dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Duy Hưng i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo; giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình; tài trợ, giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần tổ chức cá nhân Nhân dịp này, cho phép bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc thầy PGS.TS Hà Viết Cường, TS Hoàng Chúng Lằm tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Bộ môn Bệnh cây, Trung tâm bệnh nhiệt đới, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Rau giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Hưng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc, tình hình sản xuất ớt giới Việt Nam 2.1.1 Lược sử ớt 2.1.2 Tình hình sản xuất ớt giới 2.1.3 Tình hình sản xuất ớt Việt Nam 2.2 Nghiên cứu bệnh thán thư hại ớt giới 2.2.1 Tầm quan trọng bệnh thán thư 2.2.2 Phân loại nấm Colletotrichum 10 2.2.3 Thành phần nấm Colletotrichum gây hại ớt 13 2.2.4 Một số lồi nấm Colletotrichum gây hại ớt 15 2.2.5 Xâm nhiễm gây bệnh nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 22 2.2.6 Khả truyền qua hạt ớt nấm Colletotrichum 24 2.2.7 Đặc điểm sinh thái nấm Colletotrichum gây bệnh ớt 25 2.3 Phòng chống nấm Colletotrichum ớt 26 2.3.1 Biện pháp canh tác 26 2.3.2 Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh 26 2.3.3 Biện pháp hóa học 27 iii 2.3.4 Biện pháp sinh học 28 2.4 Những nghiên cứu bệnh thán thư hại ớt Việt Nam 30 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 33 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 33 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 34 3.2 Nội dung nghiên cứu 35 3.2.1 Điều tra đánh giá tác hại thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 35 3.2.2 Xác định thành phần lồi nấm Colletotrichum hại ớt đồng sơng Hồng số tỉnh 3.2.3 35 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh lồi nấm Colletotrichum phát 3.2.4 35 Đánh giá hiệu lực số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng Bacillus spp dịch chiết địa y với lồi nấm Colletotrichum phát điều kiện in vitro 36 3.3 Phương pháp nghiên cứu 36 3.3.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh thán thư 36 3.3.2 Phương pháp xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt 38 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, tính gây bệnh loài Colletotrichum 3.3.4 41 Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum số loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y vi khuẩn đối kháng điều kiện 3.5 in vitro 46 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 49 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 4.1 Điều tra đánh giá tác hại thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 51 4.1.1 Mức độ phổ biến bệnh thán thư hại ớt đồng sông Hồng 51 4.1.2 Kết điều tra thực trạng bệnh thán thư hại ớt điểm thu thập mẫu 52 4.1.3 Kết thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 56 4.1.4 Đặc điểm hình thái mẫu nấm gây bệnh thán thư ớt 57 4.2 Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt đồng sông Hồng số tỉnh 4.2.1 59 Định danh nấm dựa giải trình tự gen mẫu nấm đại diện thuộc nhóm hình thái xác định 59 iv 4.2.2 Tổng kết thành phần loài Colletotricum phát ớt đồng sông Hồng số tỉnh 4.2.3 70 Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh loài nấm Colletotrichum gây hại ớt 4.2.4 72 Xác định thành phần, mức độ phân bố đa dạng loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đồng sông Hồng số tỉnh PCR 4.3 Đặc điểm sinh học, tính gây bệnh loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập 4.3.1 89 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum 4.3.2 89 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường PDA 4.3.3 93 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường PDA 4.3.4 Tính gây bệnh lồi Colletotrichum thu thập 4.3.5 Xác định khả tồn bào tử loài nấm C siamense C truncatum ớt 4.4 84 97 101 111 Đánh giá hiệu lực số loại thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng Bacillus spp dịch chiết địa y với loài nấm Colletotrichum phát điều kiện in vitro 4.4.1 114 Ảnh hưởng số thuốc hóa học đến khả sinh trưởng, phát triển loài nấm Colletotrichum phát điều kiện in vitro 4.4.2 Ảnh hưởng số mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus spp đến sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường PDA 4.4.3 115 136 Ảnh hưởng số dịch chiết địa y đến khả sinh trưởng nấm C siamense C truncatum môi trường PDA 140 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 143 5.1 Kết luận 143 5.2 Kiến nghị 145 Danh mục cơng trình cơng bố 146 Tài liệu tham khảo 147 Phụ lục 162 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ bp Base pair (Cặp bazơ) BVTV Bảo vệ thực vật C Colletotrichum CBTB Cấp bệnh trung bình CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CSB Chỉ số bệnh CT Công thức CTAB cetyltrimethylammonium bromide ĐBSH Đồng sông Hồng DNA Deoxyrobonucleic acid FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp Lương thực Liên hiệp Quốc) Hecta ITS Internal transcribed spacer kb Kilo base PCA Potato Carrot Agar PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PDA Potato Glucose Agar QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia s.l sensu lato = phức hợp loài s.s sensu stricto = loài TT Số thứ tự TLB Tỷ lệ bệnh WA Water agar µl Microliter vi DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Diện tích, suất sản lượng ớt giới (năm 2009 - 2018) 2.2 Diện tích, suất sản lượng ớt Việt Nam (năm 2009 - 2017) 2.3 Thành phần loài Colletotrichum ớt số quốc gia 14 3.1 Các mồi sử dụng định danh phân tử nấm Colletotrichum 38 4.1 Mức độ phổ biến bệnh thán thư hại ớt đồng sông Hồng vụ xuân hè từ năm 2015 - 2017 4.2 52 Mức độ phổ biến bệnh thán thư hại ớt đồng sông Hồng vụ thu đông từ năm 2015 - 2017 52 4.3 Tình hình bệnh thán thư hại ớt số tỉnh năm 2015 54 4.4 Tình hình bệnh thán thư hại ớt số tỉnh năm 2016 55 4.5 Tình hình bệnh thán thư hại ớt số tỉnh năm 2017 55 4.6 Triệu chứng mẫu bệnh thán thư thu thập địa điểm 56 4.7 Đặc điểm hình thái mẫu nấm thán thư hại ớt thu thập 58 4.8 Kết tìm kiếm Ngân hàng gen 10 mẫu nấm Colletotrichum dựa trình tự vùng ITS 4.9 60 Mức đồng trình tự vùng ITS 10 mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu Việt Nam với loài thuộc phức hợp lồi C gloeosporioides s.l lồi cơng bố gây bệnh thán thư ớt 61 4.10 Kết tìm kiếm GenBank mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt dựa trình tự vùng ApMat 65 4.11 Mức đồng trình tự vùng ApMat mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu đồng sơng Hồng số tỉnh với lồi thuộc phức hợp loài C gloeosporioides s.l 67 4.12 Vùng thiết kế mồi phát loài C truncatum dựa trình tự ITS lồi Colletotrichum cơng bố gây bệnh thán thư ớt 73 4.13 Vùng thiết kế mồi phát loài C gloeosporioides s.s dựa trình tự ApMat phức hợp lồi C gloeosporioides s.l 74 4.14 Vùng thiết kế mồi phát loài C siamense dựa trình tự ApMat phức hợp lồi C gloeosporioides s.l vii 75 4.15 Vùng thiết kế mồi phát lồi C fructicola dựa trình tự ApMat phức hợp loài C gloeosporioides s.l 76 4.16 Đặc điểm cặp mồi thiết kế nhằm phát C truncatum, C fructicola, C siamense C gloeosporioides s.s 78 4.17 Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cặp mồi thiết kế 80 4.18 Kết PCR so sánh hai phương pháp chiết DNA mẫu nấm 83 4.19 Phát loài Colletetotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập PCR 85 4.20 Phân bố mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập đồng sông Hồng số tỉnh 87 4.21 Khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường dinh dưỡng 92 4.22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng lồi Colletotrichum 96 4.23 Ảnh hưởng pH mơi trường đến sinh trưởng loài nấm Colletotrichum 100 4.24 Kết lây nhiễm nhân tạo loài nấm Colletotrichum số giống ớt 106 4.25 Kết lây nhiễm loài nấm Colletotrichum số ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư 109 4.26 Khả tồn nấm C siamense C truncatum ớt sau lây nhiễm nhân tạo phương pháp gây tổn thương 111 4.27 Ảnh hưởng thuốc Azony 25SC đến khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường PDA 118 4.28 Ảnh hưởng thuốc Azony 25SC đến khả nảy mầm bào tử loài nấm Colletotrichum 120 4.29 Ảnh hưởng thuốc Antracol 70WP đến khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường PDA 123 4.30 Ảnh hưởng thuốc Antracol 70WP đến khả nảy mầm bào tử loài nấm Colletotrichum 126 4.31 Ảnh hưởng thuốc Tiptop 250EC đến khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường PDA 128 4.32 Ảnh hưởng thuốc Tiptop 250EC đến khả nảy mầm bào tử loài nấm Colletotrichum 131 viii 4.33 Ảnh hưởng thuốc Score 250EC đến khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường PDA 133 4.34 Ảnh hưởng thuốc Score 250EC đến khả nảy mầm bào tử loài nấm Colletotrichum 135 4.35 Ảnh hưởng số mẫu vi khuẩn đối kháng đến khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường PDA 138 4.36 Ảnh hưởng số dịch chiết địa y đến khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum mơi trường PDA ix 140 DANH MỤC HÌNH TT 2.1 Tên hình Trang Cây phân loại lồi nấm Colletotrichum dựa phân tích trình tự chuỗi gen CHS-1 (251 bp), ACT (305 bp), TUB2 (545 bp) ITS (599 bp) với nhóm (clade) rõ màu khác 12 2.2 Đặc điểm hình thái nấm C truncatum 15 2.3 Phức hợp loài C gloeosporioides s.l gồm 23 loài 16 2.4 Đặc điểm hình thái nấm C siamense 18 2.5 Đặc điểm hình thái nấm C fructicola 19 2.6 Đặc điểm hình thái nấm C aeschynomenes 20 2.7 Đặc điểm hình thái nấm C acutatum s.s: mẫu chuẩn (BRIP 52652) 21 2.8 Đặc điểm hình thái nấm C acutatum s.s: mẫu chuẩn (CBS 112996) 22 2.9 Quá trình xâm nhiễm gây bệnh nấm Colletotrichum 23 2.10 Cách xâm nhiễm gây bệnh nấm Colletotrichum cách hình thành sợi nấm biểu bì 24 2.11 Nấm C capsici hình thành tiền đĩa cành 25 3.1 Kỹ thuật cấy lam để quan sát hình thái đĩa áp nấm Colletotrichum 42 4.1 Số lượng mẫu bệnh thán thư ớt thu thập địa điểm từ 2015 - 2017 56 4.2 Triệu chứng bệnh thán thư điển hình nấm Colletotrichum spp gây hại ớt 4.3 57 Đặc điểm bào tử phân sinh (a, b, c) đĩa áp (d, e, f) nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đồng sông Hồng Đại diện nhóm hình thái C4 (a,d); C29 (b,e) C25 (c,f) 4.4 59 Phân tích phả hệ dựa trình tự vùng ITS mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp lồi C gloeosporioides s.l lồi cơng bố gây bệnh thán thư ớt 4.5 Phân tích phả hệ dựa trình tự vùng ApMat mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C gloeosporioides s.l 4.6 64 69 Đặc điểm hình thái lồi Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định đồng sông Hồng số tỉnh x 72 4.7 PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho cặp mồi đặc hiệu Colletotrichum 4.8 81 Phản ứng PCR so sánh phương pháp chiết DNA (CTAB NaOH) từ nấm Colletotrichum với cặp mồi đặc hiệu 4.9 Phân bố loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt từ tất địa điểm (A) tỉnh đồng sông Hồng (B) 4.10 87 Khả sinh trưởng lồi Colletotrichum mơi trường dinh dưỡng 4.11 83 93 Khả sinh trưởng loài Colletotrichum điều kiện nhiệt độ khác 97 4.12 Khả sinh trưởng loài Colletotrichum mức pH khác 101 4.13 Lây bệnh nhân tạo loài nấm Colletotrichum số giống ớt 105 4.14 Lây bệnh nhân tạo loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt chín số loại ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư 4.15 Lây nhiễm nhân tạo bào tử nấm C siamense C truncatum ớt giống Demon phương pháp gây tổn thương 4.16 134 Khả đối kháng mẫu vi khuẩn HT1 N2 loài nấm Colletotrichum 4.22 129 Khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường dinh dưỡng chứa thuốc Score 250EC nồng độ khác 4.21 124 Khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Tiptop 250EC nồng độ khác 4.20 119 Khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường dinh dưỡng chứa thuốc Antracol 70WP nồng độ khác 4.19 114 Khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Azony 25SC nồng độ khác 4.18 112 Đặc điểm bào tử nấm C siamense C truncatum bề mặt ớt giống Demon lây nhiễm phương pháp gây tổn thương 4.17 110 139 Khả ức chế sinh trưởng dịch chiết địa y số lồi nấm Colletotrichum 141 xi TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Duy Hưng Tên Luận án: Nghiên cứu thành phần lồi, tính gây bệnh khả phòng chống nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt đồng sông Hồng Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 01 12 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định thành phần lồi, đánh giá số đặc điểm sinh học chủ yếu nấm Colletotrichum hại ớt đồng sông Hồng (ĐBSH) Phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu Luận án thực nội dung nghiên cứu: 1) Điều tra đánh giá tác hại thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 2) Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt ĐBSH số tỉnh 3) Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh lồi nấm Colletotrichum phát 4) Đánh giá hiệu lực số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng đối dịch chiết địa y với loài Colletotrichum phát điều kiện in vitro * Vật liệu Các mẫu nấm Colletotrichum thu thập đồng ruộng Các nguồn vi khuẩn đối kháng dịch chiết địa y cung cấp môn Bệnh môn Hóa (Học viện Nơng nghiệp Việt Nam) Các hóa chất sử dụng nghiên cứu phòng chống thuốc trừ nấm nằm danh mục phép sử dụng Việt Nam * Phương pháp nghiên cứu - Phân lập nấm theo qui trình Cai et al (2009) Bảo quản mẫu nấm theo phương pháp Abd-Elsalam et al (2010) - Phương pháp chiết DNA mẫu nấm thực theo Doyle & Doyle (1987) Wang et al (1993) Định danh mẫu nấm thực cặp mồi: ITS4 & ITS5 (White et al., 1990) AM-F & AM-R (Silva et al., 2012) - Mồi đặc hiệu thiết kế dựa trình tự gen cơng bố lồi chuẩn (Cannon et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012) Các trình tự lựa chọn phân tích phần mềm ClustalX 2.0 (Larkin et al., 2007) - Đặc điểm tản nấm, hình dạng bào tử, đĩa áp đánh giá theo phương pháp Cai et al (2009), Than et al (2008a) Johnston & Jones (1997) - Xác định tính gây bệnh lồi thực theo phương pháp Montri et al (2009) Than et al (2008b) Đánh giá khả tồn số loài Colletotrichum ớt thực theo phương pháp Ranathunge et al (2016) - Đánh giá ảnh hưởng số loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y vi khuẩn đối kháng đến với loài nấm Colletotrichum điều kiện invitro thực theo phương pháp Gopinath et al (2006) Kumar et al (2012) Hiệu lực ức chế tính theo cơng thức Abbott (1925) xii - Các số liệu thí nghiệm khác xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai phần mềm IRRISTAT 5.0 Kết kết luận Điều tra đồng ruộng từ 2015 đến 2017 xác định bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp bệnh phổ biến, gây hại tất thời vụ năm ớt ĐBSH Bệnh gây hại từ giai đoạn ớt thu hoạch lứa tăng nhanh lứa Tổng số 52 mẫu nấm thán thư ớt thu thập tỉnh ĐBSH tỉnh khác phân lập từ đơn bào tử Các phân tích hình thái dựa đặc điểm bào tử phân sinh đĩa áp xác định chúng thuộc nhóm hình thái Các phân tích trình tự vùng ITS 10 mẫu nấm đại diện cho nhóm hình thái xác định mẫu nấm loài C truncatum mẫu nấm thuộc phức hợp loài C gloeosporioides s.l Để định danh xác tới mức lồi mẫu nấm thuộc phức hợp lồi C gloeosporioides s.l, trình tự vùng liên gen ApMat mẫu nấm thuộc phức hợp lồi C gloeosporioides s.l phân tích Kết phân tích xác định lồi C gloeosporioides s.s, C siamense, C fructicola C aeschynomenes Tất loài loài lần phát hiện, công bố Việt Nam Dựa kết định danh, cặp mồi đặc hiệu loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt (C gloeosporioides s.s; C fructicola; C siamense; C truncatum) thiết kế Nhiệt độ gắn mồi, thông số quan trọng phản ứng PCR, cho cặp mồi tối ưu Ở điều kiện nhiệt độ gắn mồi tối ưu, cặp mồi chứng tỏ phát đặc hiệu loài tương ứng Đặc biệt phương pháp chiết nhanh DNA từ mẫu nấm dùng NaOH đệm Tris lần đầu áp dụng nấm Colletotrichum Phương pháp chứng tỏ phù hợp để chuẩn bị DNA nhóm nấm cho phản ứng PCR Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu áp dụng để định danh tất 52 mẫu nấm thu thập Kết nghiên cứu cho thấy thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt ĐBSH số tỉnh gồm lồi, C siamense loài phổ biến nhất, chiếm 51,9%, C fructicola chiếm 21,2%, C truncatum chiếm 15,4%, C gloeosporioides s.s chiếm 9,6% loài C aeschynomenes chiếm 1,9% Các đặc điểm sinh học quan trọng loài nấm đánh giá điều kiện in vitro Tính gây bệnh lồi Colletotrichum ớt số loại đánh giá lây nhiễm nhân tạo Đặc biệt, xác định bào tử phân sinh loài C siamense C truncatum có khả nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, trì trạng thái ngủ nghỉ/ nội sinh sau xâm nhập không gây triệu chứng ớt sau lây nhiễm tuần Phát giúp xác định vị trí tồn quan trọng nguồn bệnh thán thư đồng ruộng, đồng thời giải thích đồng ruộng khó quan sát thấy bệnh thán thư ớt Kết nghiên cứu luận án xác định hoạt chất Difenoconazole (Score 250EC) Propiconazole (Tiptop 250EC) có hiệu lực cao loài nấm Colletotrichum điều kiện in vitro Ở nồng độ khuyến cáo, Score 250EC ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử lồi nấm; Tiptop 250 EC có hiệu lực ức chế tản nấm đạt 82,2 - 100% nảy mầm bào tử đạt 69,1 - 100% xiii THESIS ABSTRACT Doctoral candidate: Nguyen Duy Hung Dissertation title: Species composition, pathogenicity and prevention measures of Colletotrichum spp causing anthracnose of chili peppers in the Red River Delta (RRD) Field: Plant Protection Code: 62 01 12 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: To identify species composition and to characterize important biological features of Colletotrichum spp causing anthracnose of chili peppers in the RRD Materials and Methods * Research aspects The dissertation studied four aspects as follow: 1) Investigating and evaluating damage of Colletotrichum and collecting pepper samples infected with anthracnose 2) Determining the composition of Colletotrichum in chili pepper in the RRD and other provinces 3) Studying biological characteristics, pathogenicity of detected Colletotrichum species 4) Evaluating effectiveness of some plant protection chemicals, antagonistic bacteria and lichen extracts to detected Colletotrichum species under in vitro condition * Materials Colletotrichum samples were collected in chilli fields Antagonistic bacteria and lichen extracts were provided by Departments of Plant Pathology and Chemistry (VNUA) Chemicals used in inhibition experiment were all approved by Vietnam authority * Method - Fungal isolation according to Cai et al (2009); storage of samples according to the method of Abd-Elsalam et al (2010) - DNA extraction according to Doyle & Doyle (1987) and Wang et al (1993); identification of samples was carried out with primers: ITS4 & ITS5 (White et al., 1990) and AM-F & AM-R (Silva et al., 2012) - Designation of specific primers according to published gene sequences on standard species (Cannon et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012) Analysis of selected sequences by ClustalX 2.0 software (Larkin et al., 2007) - Evaluation of fungal characteristics, spore and sporangium shapes according to Cai et al (2009), Than et al (2008b) and Johnston and Jones (1997) - Evaluation of inhibitory effect of plant protection chemicals, lichen extracts and antagonistic bacteria to Colletotrichum under in vitro conditions according to Gopinath et al (2006) and Kumar et al (2012) - Calculation of effectiveness of plant protection chemicals, antagonistic bacteria, lichen extract to Colletotrichum according to Abbott's formula (1925) - Statistically processing of other experimental data by variance analysis method and IRRISTAT 5.0 software xiv Main findings and conclusions Field surveys during period from 2015 to 2017 determined the anthracnose is the most common disease of chili, occurring in all cropping seasons in RRD The disease occurred from the first fruit harvest and rapidly expanded in the following harvests to the end of the harvest cycle Total 52 Colletotrichum isolates were collected from provinces of RRD and other provinces All isolates were single spore isolated for further studies Morphological analyses, based on conidial and appressorial characteristics grouped all isolates into morphological groups ITS sequence analyses of 10 representatives of morphological groups identified isolates belonging to C truncatum and remaining isolates belonging to C gloeosporioides s.l complex Further sequence analyses of isolates of the C gloeosporioides s.l complex using the ApMat gene identified they belong to species, C gloeosporioides (sensu stricto), C siamense, C fructicola and C aeschynomenes All of these species are firstly identified in Vietnam Based on identified species, sets of primers specific to common Colletotrichum species (C gloeosporioides s.s; C fructicola; C siamense; C truncatum) Annealing temperature, the most important PCR parameter, of all primer sets were optimized At optimal annealing temperatures, all primer sets were demonstrated to detect specifically corresponding Colletotrichum species Remarkably, DNA extraction technique using NaOH and Tris buffer was firstly applied for Colletotrichum The technique demonstrated to be very suitable to prepare DNA of Colletotrichums for PCR PCR using the specific primer pairs were used to identify all collected 52 Coletotrichum isolates PCR tests identified composition of Colletotrichum species causing anthracnose in chili peppers in RRD and other provinces encompassing species, of which C siamense was the most common species that accounted for 51.9%, followed by C fructicola (21.2%), C truncatum (15.4%), C gloeosporioides s.s (9.6%) and C aeschynomenes (1.9%) The key biological characteristics of species of Colletotrichum were evaluated under invitro condition Pathogenicity of species on chili and some fruits was evaluated by artificial inoculation Particularly, inoculation experiment showed conidia of C siamense and C truncatum were able to germinate, form appressoria, and penetrate directly through cutin layer, remain dormant state inside leaves without causing any symptoms at weeks after inoculation The results revealed an important source of the fungal pathogen in the field Active ingredients Difenoconazole (Score 250EC) and Propiconazole (Tiptop 250EC) were identified to be highly effective for Colletotrichum control under in vitro conditions At the recommended concentration, Score 250EC completely inhibited the growth and spore germination of the fungal species; Tiptop 250 EC restricted 82.2 100% fungal growth and 69.1 - 100% spore germination of the fungal species xv PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây ớt (Capsicum sp) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) có xuất xứ từ Mehico, Goatemala từ trung tâm khởi ngun Đơng Nam Á Có hai nhóm ớt phổ biến ớt cay (Capsicum frutescens L.) ớt (Capsicum annuum L.) Trong nhóm trồng thuộc họ cà (Solanaceae), ớt có tầm quan trọng thứ hai sau cà chua Ngày nay, ớt trồng rộng rãi toàn giới từ 55o vĩ độ bắc đến 55o vĩ độ nam đặc biệt nước châu Mỹ số nước châu Á Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Indonesia, Việt Nam, Malaysia Đồng sông Hồng (ĐBSH) vùng sản xuất ớt hàng hóa tập trung lớn nước ta Theo Tổng cục thống kê, đến năm 2017 diện tích trồng ớt ĐBSH đạt 5.049 sản lượng 79.640 Hiện nay, ớt xem trồng quan trọng, mang lại hiệu hiệu kinh tế cao cho người sản xuất Cũng nhiều trồng khác, ớt bị công nhiều dịch hại Trong số dịch hại ớt, nấm Colletotrichum spp (gây bệnh thán thư) xem nguy hiểm (Than et al., 2008a) Tại Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan bệnh làm giảm từ 10 - 80% suất, cá biệt bang Ohio, Mỹ bệnh làm giảm gần 100% suất ớt (Kumar, 2014; Sheu, 2013; Than et al., 2008a) Tại Việt Nam, tất vùng trồng ớt tập trung Hải Phòng, Hải Dương, Hưng n, Thái Bình, Nghệ An, Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế bị bệnh thán thư phá hại nặng Cho tới năm 2008, thành phần lồi Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt cơng bố giới đa dạng, bao gồm loài C gloeosporioides, C capsici, C acutatum, C coccodes, C dematium, C nigrum C atramentarium Thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt quốc gia, vùng khác khác Đến nay, có nhiều kết nghiên cứu lồi ghi nhận song nhiều điều cần nghiên cứu thêm trình lây bệnh mối quan hệ phức hợp loài (Than et al., 2008a) Tại Việt Nam, trước thực đề tài này, lồi C acutatum, C capsici, C gloeosporioides, C nigrum công bố gây bênh thán thư ớt (Don et al., 2007; Ngơ Bích Hảo, 1991, 1992) Việc định danh nấm Colletotrichum hại ớt (cũng loài Colletotrichum khác) dựa vào đặc điểm hình thái (màu sắc, tốc độ phát triển cấu trúc tản nấm; hình dạng, kích thước bào tử phân sinh, đĩa áp ) có nhiều nhầm lẫn Nguyên nhân đặc điểm hình thái lồi Colletotrichum có phụ thuộc cao vào điều kiện môi trường (Hyde et al., 2009a) Theo Weir et al (2012) Damm et al (2012a) C gloeosporioides C acutatum thực chất phức hợp loài, C gloeosporioides gồm 23 lồi khác C acutatum gồm 31 lồi khác Đối với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt, nghiên cứu phân loại gần đây, dựa phân tích phân tử, cho thấy có thay đổi lớn thành phần lồi so với cơng bố trước Tại Ấn Độ, định danh lại 52 mẫu nấm C gloeosporioides sensu lato (s.l) cho thấy chúng thuộc loài C fructicola C siamense (Sharma & Shenoy, 2013) Tại Thái Lan, loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định C gloeosporioides sensu stricto (s.s), C siamense, C acutatum C truncatum (Suwannarat et al., 2017) Tại Trung Quốc, phân tích trình tự mẫu nấm Colletotrichum thu 29 tỉnh xác định 15 lồi có lồi phổ biến C fioriniae, C fructicola, C gloeosporioides s.s, C scovillei C truncatum (Diao et al., 2017) Tại Úc, loài C siamense, C simmondsii, C queenslandicum, C truncatum C cairnsense xác định gây bệnh thán thư ớt (De Silva et al., 2017a) Xác định xác thành phần định danh nấm Colltetotrichum có vai trị quan trọng khơng mặt khoa học mà thực tiễn quản lý bệnh quan hệ nấm với ký chủ tính mẫn cảm với thuốc hóa học khác theo loài Kim et al (2004) cho thấy C acutatum C gloeosporioides nhiễm ớt giai đoạn phát triển thường không gây bệnh thân Trái lại C coccodes C dematium gây hại chủ yếu thân ớt, đặc biệt Các loài Colltetotrichum có tính gây bệnh khác theo giai đoạn phát triển ớt Chẳng hạn, C capsici gây hại phổ biến ớt chín đỏ, C acutatum C gloeosporioides gây hại phổ biến ớt xanh chín (Hong & Hwang, 1998; Kim et al., 1999) Các lồi Colletotrichum tồn tự nhiên dạng kiểu gây bệnh chúng có tính gây bệnh khác ớt Hiện tại, việc phòng trừ bệnh thán thư hại ớt sản xuất chủ yếu thực thuốc hóa học chưa thu hiệu mong muốn Nguyên nhân chủ yếu là: (i) thiếu thông tin đầy đủ, cập nhật xác thành phần loài Colletotrichum gây bệnh, đặc biệt tiêu chí phân loại chi nấm thay đổi nhanh chóng; (ii) thiếu thơng tin đặc điểm sinh học loài/ kiểu gây bệnh nấm Colletotrichum phổ biến nhất, quan trọng tính gây bệnh giống ớt phản ứng với thuốc trừ nấm khác Việc xác định thơng tin có vai trị quan trọng sở khoa học chủ yếu để đề xuất biện pháp kỹ thuật nhằm phòng chống hiệu bệnh thán thư hại ớt Việt Nam 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định thành phần loài đánh giá số đặc điểm sinh học chủ yếu nấm Colletotrichum hại ớt ĐBSH 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Đánh giá trạng gây hại bệnh thán thư ớt ĐBSH - Xác định thành phần, mức độ phổ biến phương pháp chẩn đốn nhanh lồi nấm Colletotrichum hại ớt ĐBSH - Xác định tính gây bệnh lồi nấm Colletotrichum phát ớt ĐBSH - Đánh giá hiệu lực số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng dịch chiết địa y loài Colletotrichum phát điều kiện in vitro 1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Bệnh thán thư gây hại ớt nấm Colletotrichum spp gây 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu thành phần lồi, số đặc tính sinh học, tính gây bệnh đánh giá hiệu lực số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng, dịch chiết địa y với lồi nấm Colletotrichum spp phát điều kiện in vitro 1.3.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu Điều tra, đánh giá tác hại, thu thập mẫu bệnh thán thư hại ớt tỉnh thuộc ĐBSH (Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam) số tỉnh khác (Sơn La, Bắc Giang, Thái Nguyên Tiền Giang) ... NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN DUY HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LỒI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Chuyên ngành : Bảo vệ thực... nhiễm gây bệnh nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 22 2.2.6 Khả truyền qua hạt ớt nấm Colletotrichum 24 2.2.7 Đặc điểm sinh thái nấm Colletotrichum gây bệnh ớt 25 2.3 Phòng chống nấm Colletotrichum. .. thực trạng bệnh thán thư hại ớt điểm thu thập mẫu 52 4.1.3 Kết thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 56 4.1.4 Đặc điểm hình thái mẫu nấm gây bệnh thán thư ớt 57 4.2 Xác định thành phần lồi nấm Colletotrichum