Tóm tắt: Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2023 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Lan Hương TS Phạm Tuấn Anh Phản biện 1: GS TS Đặng Thị Thu Phản biện 2: PGS TS Lê Gia Hy Phản biện 3: PGS TS Dương Văn Hợp Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách khoa Hà Nội họp Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 09 giờ, ngày 11 tháng 10 năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Các bệnh tim mạch (CVD) nguyên nhân dẫn đến tử vong người Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xác định 17,9 triệu ca tử vong năm CVD, ước tính chiếm 31% số ca tử vong tồn cầu Các bệnh rối loạn tim mạch nhồi máu tim cấp tính, tắc mạch đột quỵ chủ yếu tích tụ nhiều fibrin mạch máu tạo thành huyết khối Các enzyme thủy phân fibrin thu nhận từ chủng vi sinh vật trở thành nguồn sản xuất enzyme thủy phân fibrin dễ tiếp cận hơn, rẻ thu hút ý điều trị bệnh liên quan đến huyết khối, làm tan huyết khối có máu Vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin phân lập chủ yếu từ nguồn thực phẩm lên men có nguồn thực phẩm lên men từ đậu tương, chủng vi khuẩn phân lập chủ yếu B subtilis, B amyloliquefaciens cho an toàn, sử dụng qua đường uống Trước nhu cầu sử dụng enzyme thủy phân fibrin ngày tăng lĩnh vực y dược thực phẩm bổ sung, việc mở rộng nghiên cứu tăng cường cải thiện hoạt độ enzyme nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp để tăng hiệu suất góp phần giảm chi phí sản xuất cần thiết Ngồi việc lựa chọn phương pháp lên men phù hợp tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men cho chủng cụ thể việc nghiên cứu cải thiện khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng khuẩn coi cách đem lại hiệu cao, ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp Dựa vào kết nghiên cứu công bố chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin nước, kết hợp điều kiện thực tế nghiên cứu phịng thí nghiệm, tác giả tiến hành “Nghiên cứu cải thiện khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens” phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống Việt Nam Mục tiêu luận án Tuyển chọn nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin vi khuẩn Bacillus sp phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống Nội dung luận án - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao Định danh tên chủng phương pháp giải trình tự gene - Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng phương pháp đột biến dùng tia UV kết hợp hóa chất EtBr EMS - Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Về ý nghĩa khoa học: + Phân lập tuyển chọn chủng B amyloliquefaciens HY6 từ tường Bần, Hưng Yên cải biến thành chủng đột biến ES4 có khả sinh enzyme thủy phân fibrin + Chứng minh việc nâng cao khả sinh tổng enzyme thủy phân fibrin chủng cách tạo đột biến sử dụng kết hợp tia UV với hóa chất EtBr EMS + Nâng cao khả sinh enzyme thủy phân fibrin cách thiết lập kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng hai giai đoạn chủng đột biến ES4 - Về ý nghĩa thực tiễn: + Bổ sung vào sưu tập giống chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao + Kết sở khoa học để nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất enzyme thủy phân fibrin nhằm tạo sản phẩm nhằm ứng dụng hỗ trợ phòng ngừa điều trị bệnh liên quan đến huyết khối Việt Nam Những đóng góp luận án - Là nghiên cứu có tính hệ thống phân lập, tuyển chọn, tạo chủng vi khuẩn đột biến, xác định điều kiện lên men nhằm thu enzyme thủy phân fibrin từ chủng B amyloliquefaciens HY6 có nguồn gốc từ tương Bần, Hừng Yên - Tạo chủng đột biến B amyloliquefaciens ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao so với chủng phân lập kỹ thuật sử dụng kết hợp đột biến tia UV với hóa chất EMS EtBr - Nâng cao khả sinh enzyme thủy phân cách thiết lập kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng hai giai đoạn thiết bị lên men lít Bố cục luận án Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương trình bày kiến thức tảng (1) Enzyme thủy phân fibrin bao gồm: tác dụng, chế thủy phân fibrin enzyme, nguồn thu ứng dụng enzyme, tình hình nghiên cứu ngồi nước (2) Chủng vi khuẩn Bacillus sp sinh tổng hợp enzyme, nguồn thu nhận phương pháp nâng cao hoạt tính enzyme chủng đột biến, tối ưu môi trường, điều kiện nuôi cấy kỹ thuật lên men thu nhận enzyme (3) Sản phẩm enzyme thương mại Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương trình bày đối tượng nghiên cứu, vật liệu, hóa chất phương pháp nghiên cứu: vi sinh, hóa lý, hóa sinh, sinh học phân tử, lựa chọn tối ưu thành phần, điều kiện lên men, kỹ thuật lên men cụ thể để giải nội dung đặt nghiên cứu luận án Chương 3: Kết thảo luận Chương trình bày kết đạt từ nội dung nghiên cứu qua biện luận, phân tích sở khoa học so sánh với nghiên cứu công bố (nếu có) Phần kết luận kiến nghị: nêu kết luận đạt tương ứng với nội dung nghiên cứu đặt đồng thời đề xuất kiến nghị số nội dung tiếp tục làm để hoàn thiện phát triển kết đạt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giớí thiệu enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin hay gọi enzyme tiêu sợi huyết, thuộc họ protease subtilisin sinh tổng hợp chủng vi khuẩn Bacillus sp., chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập chủ yếu từ nguồn thực phẩm lên men, có nguồn đậu tương lên men truyền thống (Hình 1.1) Hình 1.1 Nguồn phân lập vi khuẩn sinh enzyme thủy phân fibrin Hình 1.2 Cơ chế thủy phân fibrin enzyme 1.1.1 Cơ chế tiêu sợi huyết enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin hỗ trợ làm tan sợi huyết thể, giúp máu lưu thông tốt cách phá vỡ protein fibrin máu, thúc đẩy tăng cường lưu lượng máu khỏe mạnh Bên cạnh đó, enzyme thủy phân fibrin có khả cắt bỏ chất ức chế hoạt hóa plasminogen, kích hoạt pro-urokinase chất kích hoạt plasminogen mơ (t-PA), hỗ trợ hoạt động tiêu sợi huyết plasmin (Hình 1.2), góp phần trì lưu lượng máu thích hợp, ngăn ngừa cục máu đông 1.1.2 Ứng dụng enzyme thủy phân fibrin Các enzyme thủy phân fibrin có tác dụng kích hoạt chất hịa tan cục máu đơng, cho an toàn ngày quan tâm, nghiên cứu ứng dụng làm thuốc tan huyết khối lâm sàng, sử dụng phòng ngừa bệnh liên quan đến huyết khối tim mạch dạng thực phẩm chức 1.1.3 Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin thu nhận từ nhiều nguồn vi khuẩn khác nhau, chủ yếu phân lập từ nguồn đậu nành lên men như: Doenjang, Cheonggukjang, Meju, Kimchi (Hàn Quốc); Tempeh (Indonesia); Chickpeas, Douchi (Trung Quốc); Bột Dosa (Ấn Độ); Natto (Nhật Bản); Kishk (Ai Cập); mắm tôm lên men (Châu Á); nem chua, nước tương lên men (Việt Nam) Các chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme thủy phân fibrin phân lập chiếm đa số Bacillus sp có B amyloliquefaciens xem nguồn tiềm để sản xuất enzyme thủy phân fibrin ứng dụng sống 1.2 Giớí thiệu Bacillus sp 1.2.1 Đặc điểm Bacillus sp Bacillus sp trực khuẩn hình que, hiếu khí, khơng gây bệnh, hình thành nội bào tử Ở điều kiện sinh trưởng tối ưu Bacillus sp có thời gian hệ khoảng 25 phút 1.2.2 Nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân từ nguồn vi khuẩn Bacillus sp Các enzyme thủy phân fibrin thu nhận từ nguồn vi khuẩn Bacillus sp có B.amyloliquefaciens nghiên cứu nhiều số nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ Đến nhà khoa học nỗ lực tìm kiếm đa dạng chủng sản xuất enzyme cho hoạt độ cao từ nguồn phân lập khác nhau, nước khu vực Châu Á Ở Việt Nam enzyme thủy phân fibrin chưa thực quan tâm, thu nhận từ chủng vi khuẩn địa có nguồn thực phẩm lên men truyền thống để hướng tới ứng dụng 1.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin đột biến 1.3.1 Phương pháp đột biến UV 1.3.1.1 Cơ chế gây đột biến UV Chiếu tia UV dẫn đến hình thành liên kết cộng hóa trị pyrimidine dimer, liên kết làm biến dạng cấu trúc DNA, ức chế trình chép phiên mã DNA, gây đột biến 1.3.1.2 Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn Nhiều nghiên cứu công bố đem lại hiệu đáng kể cải thiện nâng cao hoạt tính enzyme chủng dại đột biến UV Kết nghiên cứu cho thấy, việc nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme chủng vi khuẩn phương pháp đột biến UV cho hoạt độ enzyme tăng từ 1,01 đến lần so với chủng ban đầu 1.3.2 Phương pháp đột biến hóa chất 1.3.2.1 Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS EtBr Tác nhân gây đột biến hóa học tạo thành chất cộng với nucleotide bắt cặp sai với bazơ bổ sung khuôn mẫu, dẫn đến thay đổi bazơ trình chép gây nên đột biến 1.3.2.2 Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS EtBr nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn Là phương pháp đột biến có độ ổn định cao, đem lại hiệu đáng kể việc cải thiện nâng cao hoạt tính enzyme chủng dại, tăng từ 1,12 đến lần Ở Việt Nam, việc cải thiện chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin phương pháp đột biến UV hóa chất chưa quan tâm khai thác sử dụng để thu nhận nguồn enzyme tiềm 1.3.3 Phương pháp gây đột biến kỹ thuật sinh học phân tử 1.3.3.1 Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp Việc tách dòng, biểu mức tạo chủng tái tổ hợp để sản xuất enzyme gồm giai đoạn: Thu nhận DNA chứa gen đích từ tế bào chủ; Tạo dịng gen sản xuất enzyme đích vector biểu hiện; Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận nuôi cấy thu nhận enzyme tái tổ hợp 1.3.3.2 Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp tăng khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng Một số nghiên cứu tối ưu hóa promoter biểu B subtilis, tối ưu peptid dẫn đường biểu B licheniformis BL10, xáo trộn DNA biểu B subtilis natto, biểu gen NAT05 mã hóa nattokinase B subtilis BD170 tạo chủng tái tổ hợp cho khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tăng 1,26 đến 10 lần 1.4 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men 1.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin Trong lên men, nguồn dinh dưỡng C (glucose, sacarose, maltose, glycerol), N (cao nấm men, cao thịt, bột đậu, peptone, tryptone), ion kim loại (Ca 2+, Mg2+, Fe2+, K+, Cu2+, Mn2+), điều kiện lên men (nhiệt độ, pH) khảo sát cho chủng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin, chủng khác có điều kiện sử dụng nguồn dinh dưỡng để sinh tổng hợp enzyme cho hiệu tốt khác 1.4.2 Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men Trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin, việc tối ưu điều kiện thành phần môi trường lên men để tăng khả sinh tổng enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn quan tâm nghiên cứu nhiều tác giả cho kết tối ưu hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng khác nhau, tăng từ 1,5 đến 6,3 lần so với hoạt độ enzyme ban đầu 1.5 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 1.5.1 Lên men theo mẻ Là phương pháp lên men mà suốt thời gian lên men không thêm dinh dưỡng không loại bỏ sản phẩm cuối, hiệu thu nhận enzyme không cao 1.5.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng Là hình thức trung gian lên men theo mẻ lên men liên tục, nâng cao hiệu thu nhận enzyme, giảm chi phí q trình sản xuất Các nghiên cứu tăng hoạt độ enzyme thủy phân fibrin từ 1,24 đến lần chủng lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên men Trong lên men, sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chủng giống, thành phần EtBr môi trường dinh dưỡng, điều kiện ni cấy (pH, nhiệt độ, cấp khí), thời gian nuôi cấy 1.6 Sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại Các chế phẩm enzyme thủy phân fibrin phổ biến dạng thực phẩm chức có nguồn gốc chủ yếu Nhật Bản, Mỹ, Canada, Việt Nam, … Các sản phẩm có giá thành dao động khác nhau, phụ thuộc vào nguồn gốc sản phẩm hoạt độ enzyme có sản phẩm Ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin nước chưa đáp ứng nhu cầu thị trường, phần lớn phải nhập nguyên liệu enzyme thương mại từ nước khác Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu tương 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập từ sản phẩm tương ở: Hải Phòng (HP), Hải Dương (HD), Yên (HY),sp Yên Bái (YB), Phú PhânHưng lập Bacillus Thọ (PT), Bắc Ninh (BN), Nghệ An (NA) Hà Nội (HN) 2.1.2 Hóa chất Các hóa chất dùng nghiên cứu có nguồn gốc từ hãng Himedia (Ấn Độ), Sigma Merck (Đức), UV(Mỹ), (5 lần) 2.1.3 Thành phần môi trường Gồm môi trường LB; môi trường GY; môi trường GYP môi trường tạo bào tử DSM EMSThiết bị EMS EtBr + EMS 2.1.4 Các trang thiết bị sử dụng phịng thí nghiệm có xuất xứ từ nhiều nước Nhật Bản, Đức, Trung Quốc Việt Nam,… 2.2 Phương pháp nghiên cứu Dòng tế bào đột biến có hoạt 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm độ enzyme thủy phân fibrin cao Kiểm tra độ ổn định hoạt độ enzyme chủng Tối ưu môi trường điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme Lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận hoạt độ enzyme cao EtBr 2.2.2 Phương pháp vi sinh 2.2.2.1 Phân lập sàng lọc chủng a Phương pháp phân lập: 10g bổ sung 90ml nước muối 0,9% nhiệt 80oC/20 phút Pha mẫu đến 10-5 10-6, trải đĩa môi trường LB agar, 37oC /24 h b Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease: khuẩn lạc cấy ria LB agar bổ sung 1% sữa gầy, 37 0C/24 h Các chủng sau sàng lọc lên men môi trường GY 370C, lắc 150 vòng/phút, 24 h đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin 2.2.2.2 Hoạt hóa chủng Chủng trước sử dụng hoạt hóa môi trường LB 37oC/12-14 h 2.2.2.3 Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào Chủng hoạt hóa ni mơi trường GY GYP (OD 0,2)/bình 250ml Ni 37oC, lắc 150 vòng/phút/ 24 h, ly tâm tách sinh khối 10.000 vòng/phút, oC/10 phút, thu dịch đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin 2.2.2.4 Kiểm tra độ ổn định chủng đột biến Chủng đột biến thu nhận đánh giá độ ổn định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin qua 10 lần cấy chuyển 2.2.2.5 Khảo sát khả tạo bào tử chủng đột biến Chủng nuôi môi trường DSM ngày nhuộm bào tử, song song dịch đun 80 oC/20 phút, sau trải đĩa thạch LB bổ sung 1% sữa gầy, nuôi 37oC/24 h đếm khuẩn lạc 2.2.3 Phương pháp hóa lý, hóa sinh 2.2.3.1 Đột biến chủng vi khuẩn a Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào cho đột biến Chủng nuôi môi trường LB 37oC/12 h, hút 10 ml dịch ly tâm 10.000 vòng/10 phút 4oC, rửa sinh khối tạo huyền phù lại mật độ tế bào xấp xỉ 1×107 CFU/ml sử dụng để đột biến b Đột biến chiếu tia UV Dịch huyền phù tế bào chuyển vào đĩa peptri vô trùng tủ cấy đột biến đèn UV (15W, 254nm), khoảng cách 20 cm (Hình 2.1), thời gian 30, 60, 90, 120, 150 180 phút Sàng lọc xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng, chọn chủng cho hoạt độ enzyme cao đột biến tiếp lần 2, trình đột biến tương tự lần trình đột biến dừng lại sau lần đột biến liên tiếp hoạt độ enzyme thủy phân thu nhận chủng không tăng Tổng số 28 mẫu tương phân lập 68 khuẩn lạc, khuẩn lạc làm môi trường LB agar bổ sung 1% sữa gầy để sàng lọc sơ cho 48 chủng có khả sinh enzyme protease, có 23 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao, chủng có đặc điểm hình thái khuẩn lạc khác nhau, đa dạng màu sắc, hình dạng Trong đó, chủng HY6 cho đường kính vịng thủy phân sữa gầy to 12 ± mm (Hình 3.1) 3.1.2 Khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng 23 chủng có hoạt tính protease cao lên men mơi trường GY/24 h, lắc 150 vòng/phút/37oC, đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin Kết 23 chủng sinh enzyme phân hủy fibrin có hoạt độ từ 11,4 ± 2,2 FU/ml đến 49,2 ± 1,2 FU/ml Chủng HY6 phân lập từ tương Bần, Hưng Yên cho hoạt độ enzyme cao đạt 49,2 ± 1,2 FU/ml chọn để tiếp tục nghiên cứu Chủng HY6 nhuộm Gram cho thấy tế bào chủng HY6 bắt màu tím vi khuẩn Gram dương, tế bào vi khuẩn hình que, có đầu tròn, tồn đơn lẻ thành đám hình chuỗi ngắn (Hình 3.2) Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc tế bào nhuộm Gram chủng HY6 soi kính hiển vi vật kính dầu 100x 3.2 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng lựa chọn phương pháp đột biến 3.2.1 Đột biến tia UV Chủng HY6 chiếu tia UV đột biến sau lần liên tiếp thu nhận chủng U5_90.5 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao đạt 114 ± FU/ml (Hình 3.3), tăng 2,3 lần so với chủng HY6 3.2.2 Đột biến hóa chất EtBr Chủng HY6 đột biến hóa chất EtBr thu nhận chủng H12 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao 180 ± FU/ml (Hình 3.4), tăng 2,2 lần so với chủng HY6 Kết so với phương pháp chiếu tia UV cho hoạt độ enzyme tăng xấp xỉ 3.2.3 Đột biến UV kết hợp hóa chất 12 3.2.3.1 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr Chủng U5_90.5 môi trường GYP có hoạt lực enzyme cao 177,8 ± 9,8 FU/ml cho đột biến với hóa chất EtBr thu 02 chủng cho hoạt độ enzyme cao E1 (452 ± FU/ml) E5 (440 ± FU/ml) Hình 3.5 Kết quả, chủng đột biến cho hoạt độ enzyme tăng 5,5 lần so với chủng gốc tăng 2,5 lần so với chủng đột biến UV hóa chất trực tiếp Hình 3.3 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến tia UV Hình 3.4 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EtBr 3.2.3.2 Đột biến chủng U5_90.5 EMS Chủng U5_90.5 cho đột biến với hóa chất EMS thu nhận chủng S33 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao 456 ± FU/ml (Hình 3.6), hoạt độ enzyme tăng 5,6 lần so với chủng HY6 3.2.3.3 Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV EtBr) EMS Chủng E1 cho đột biến hóa chất EMS thu nhận chủng E1.10 cho hoạt độ enzyme cao 320 ± 16 FU/ml (Hình 3.7), thấp chủng E1 Điều cho thấy, trình sàng lọc thu nhận chủng đột biến khơng có lợi cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin 3.2.3.4 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr kết hợp với EMS 13 Chủng U5_90.5 cho đột biến kết hợp lúc hóa chất EtBr EMS (tỉ lệ 1:1) thu chủng ES4 cho hoạt độ enzyme cao 416 ± FU/ml (Hình 3.8), tăng lần so với chủng HY6 3.2.4 Độ ổn định chủng đột biến Các chủng đột biến chủng HY6 kiểm tra tính ổn định sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin qua 10 lần cấy chuyển Kết chủng ES4 cho độ ổn định chủng đột biến, hoạt độ enzyme 404 ± FU/ml (Hình 3.9), tăng lần so với chủng HY6 Hình 3.5 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EtBr từ chủng U5_90.5 Hình 3.6 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EMS từ chủng U5_90.5 14 Hình 3.7 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EMS từ chủng E1 Hình 3.8 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EtBr kết hợp EMS Hình 3.9 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng qua 10 lần cấy chuyển 3.2.5 Bước đầu tìm hiểu hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân fibrin chủng HY6 ban đầu chủng đột biến ES4 So sánh, phân tích genome chủng HY6 ES4 thực hệ thống RAST (trang https://rast.nmpdr.org/rast.cgi) Kết thu nhận số đặc điểm hệ gen chủng thể Bảng 3.1 Bảng 3.1 Đặc điểm tổ hợp gen chủng HY6 ES4 15 Số lượng contig Kích thước hệ gen (bp) Số lượng contig (với PEGs) Tỷ lệ GC (%) Số lượng trình tự mã hóa protein Số lượng hệ thống phân loại Số lượng gen mã hóa RNAs rRNAs tRNAs TmRNAs Chủng HY6 24 3912654 24 45,78 4351 329 54 52 Chủng ES4 28 3914062 28 45,78 4101 329 54 52 Kích thước gen chủng ES4 tăng so với chủng HY6 1408 bp (Bảng 3.1) Tỷ lệ % GC chủng khơng đổi chiếm 45,78% Dự đốn chức gen tảng RAST cho thấy chủng có 54 gen mã hóa rRNA Phân tích trình tự hệ gen (whole genome sequencing): Gen giải hệ thống máy chủ RAST, số gen dự đoán chức hệ thống (subsystem) chủng đạt 28% (Hình 3.10 Hình 3.11), với gen subsystem nhỏ giống Chủng HY6 ES4 giải tồn trình tự gen, kết chủng xác định Bacillus amyloliquefaciens có ngân hàng gen GenBank Chủng HY6 ES4 xây dựng phân loài TYPE (STRAIN) GENOME SERVER (https://tygs.dsmz.de/user_requests/new) cho thấy, chủng HY6 ES4 gần giống với chủng Bacillus amyloliquefaciens DSM7 Hình 3.10 Kết chạy RAST chủng HY6 16 Hình 3.11 Kết chạy RAST chủng ES4 Các trình tự gen cho khác BLAST trang http://ncbi.nlm.nih.gov qua thu nhận số liệu gen thay đổi tổng hợp Bảng 3.2 Bảng 3.2 Các gen thay đổi chủng HY6 gốc chủng ES4 đột biến TT HY6 ES4 >CALMKEOM_00581 Sporulation kinase A >LCCANNEE_00351 Sporulation kinase A >LCCANNEE_03339 >CALMKEOM_01099 Sporulation protein YunB Sporulation protein YunB >LCCANNEE_04149 Sporulation protein YunB >CALMKEOM_02669 >LCCANNEE_02502 Protein SprT-like protein Protein SprT-like protein >CALMKEOM_02828 >LCCANNEE_02661 Ferredoxin NADP reductase Ferredoxin NADP reductase >CALMKEOM_02905 >LCCANNEE_02738 Glutaminase Glutaminase >CALMKEOM_03627 Protein UmuC >CALMKEOM_03629 DNA >LCCANNEE_03733 polymerase IV DNA polymerase IV >CALMKEOM_04093 tRNA-Tyr(gta) >LCCANNEE_02788 tRNA-Tyr(gta) Sự thay đổi protein S->A Không thay đổi I->V,S->N,Q>K,S->N Không thay đổi G->S Không thay đổi Không thay đổi Không thay đổi Đột biến nucleotid: A  G, T  G, C T Từ Bảng 3.2 cho thấy, mục số gen mã hóa tRNA(tyr) (là RNA vận chuyển đặc hiệu cho tyrosine), gen có xuất đột biến điểm A -> T, T -> G, C -> T, điểm đột biến nhỏ so 17 với kích thước hệ gen, đó, tính tốn tỉ lệ GC theo % tỉ lệ gần khơng thay đổi Kết thể Bảng 3.1 (khi phân tích so sánh genome chủng HY6 ES4 hệ thống RAST), tỉ lệ % GC chủng không thay đổi (45,78 %) Ở mục số gen có liên quan đến bào tử, gen spoA thay đổi có khả liên quan đến hình thành bào tử chủng, mục số gen mã hóa cho enzyme chuỗi vận chuyển điện tử Trên sở phân tích thay đổi gen, chủng nuôi môi trường DSM/7 ngày nuôi, kết chủng ES4 không tạo bào tử Trên môi trường GYP/24 h, chủng ES4 (3 mPas) có độ nhớt giảm so với chủng HY6 (4 mPas), sinh khối tạo thành chủng ES4 so với HY6 khơng tăng, hàm lượng protein hịa tan chủng ES4 tăng 1,2 lần so với HY6 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 tăng khoảng lần so với HY6, chủng có hoạt tính enzyme amylase enzyme cellulose Kiểm tra phản ứng sinh hoá chủng HY6 ES4 kit Api-20E 50CH cho thấy chủng có phản ứng sinh hóa giống nhau, khác 01 phản ứng sinh hóa số 24 (Arbutin), chủng ES4 có khả sinh arbutin cịn HY6 khơng 3.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 kỹ thuật lên men 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho khả sinh enzyme chủng 3.3.1.1 Nguồn carbon Kết khảo sát nguồn dinh dưỡng C cho thấy, chủng ES4 nguồn dinh dưỡng C glucose cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng cao đạt 375 ± FU/ml (Hình 3.12) chọn nguồn C cho chủng phát triển sinh enzyme thủy phân fibrin Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn C Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn N 18