Tạo dòng gen mã hóa endo β 1,3 glucanase từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens vào hệ thống vector pgem® t

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA ENDO-β-1,3-GLUCANASE TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens VÀO HỆ THỐNG VECTOR PGEM®-T NGUYỄN THỊ PHƯỢNG Đà Nẵng, năm 2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA ENDO-β-1,3-GLUCANASE TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens VÀO HỆ THỐNG VECTOR PGEM®-T Ngành : Cơng nghệ sinh học Khóa : 2019-2023 Sinh viên : Nguyễn Thị Phượng Người hướng dẫn: ThS Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng, năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Người cam đoan Nguyễn Thị Phượng i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến ThS Vũ Đức Hoàng TS Nguyễn Đức Huy tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện tốt suốt trình thực hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Cử nhân Lê Thị Nhật Anh tận tình giúp đỡ truyền đạt kinh nghiệm cho tơi q trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt để thực đề tài tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tơi học tập năm đại học Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian làm khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Phượng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu .2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Bacillus amyloliquefaciens .3 1.2 Tổng quan β-1,3-glucanase 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc phân tử β-glucan 1.2.2 Hoạt tính phân giải β-1,3-glucan β-1,3-glucanase 1.2.3 Nguồn gốc phân loại endo β-1,3-glucanase 1.2.4 Ứng dụng endo β-1,3-glucanase .5 1.3 Kỹ thuật tạo dòng gen ngoại lai 1.4 Tình hình nghiên cứu nước giới 11 1.4.1 Trong nước 11 1.4.2 Trên giới 13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ B amyloliquefaciens 16 2.2.2 Phân lập giải trình tự gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase 17 iii 2.2.3 Tạo dòng gen endo-β-1,3-glucanase vào hệ thống vector pGEM®-T 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Tách chiết DNA tổng số 21 3.2 Khuếch đại PCR gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase 21 3.3 Tạo dòng gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase vào hệ thống vector pGEM®-T 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 Kết luận 30 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 37 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid GH Glycosyl hydrolase LB Luria bertani (môi trường Luria bertani) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ) PCI Phenol : chloroform : isoamylalcohol PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc phân tử β-glucan Cấu trúc glucan 1.2 Enzyme thủy phân β-1,3-glucanase 1.3 Mơ hình plasmid sử dụng cho cloning 2.1 Vector pGEM®-T 16 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số chủng B amyloliquefaciens 21 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại PCR gen mã hóa endo-β-1,3- 22 glucanase 3.3 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase 23 Trình tự amino acid suy diễn gen endo-β-1,3-glucanase chủng 24 B amyloliquefaciens 3.5 Mơ hình cấu trúc không gian chiều từ chủng B 24 amyloliquefaciens 3.6 Kết so sánh trình amino acid suy diễn gen mã hóa endo-β-1,3- 25 glucanase chủng B amyloliquefaciens với Bacillus halotolerans Y6 (mã số: MH643779.1) 3.7 Kết kiểm tra khả biến nạp chất lượng tế bào E coli 26 DH5α khả biến 3.8 Thể biến nạp mơi trường LB rắn có bổ sung ampicillin 27 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc màu trắng đĩa 27 môi trường chọn lọc 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM®-T/endo-β-1,3glucanase vi 28 TĨM TẮT Endo-β-1,3-glucanase thu hút nhiều nhà nghiên cứu nhờ ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Đặc biệt, enzyme endo-β-1,3-glucanase có khả phân giải β-1,3-glucan thành 1-3-β- d -glucan oligosaccharid với đặc tính điều hịa miễn dịch chống khối u Chính thế, enzyme ngày thu hút ý nhà khoa học Trong nghiên cứu này, gen mã hóa cho endo-β-1,3-glucanase từ chủng B amyloliquefaciens tạo dòng sử dụng cặp mồi thiết kế dựa trình tự gen endo-β-1,3-glucanase từ chủng Bacillus halotolerans Y6 (mã số: MH643779.1) Sản phẩm khuếch đại gửi xác định trình tự Kết giải trình tự gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase có kích thước 732 bp Đoạn chèn endo-β1,3-glucanase gắn vào pGEM®-T biến nạp phương pháp sốc nhiệt vào E coli DH5α Kết biến nạp kiểm tra cách PCR khuẩn lạc cặp mồi gen mục đích cắt enzyme giới hạn BstXI Kết cho thấy tạo dịng thành cơng gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase từvi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens vào hệ thống vector pGEM®-T vii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài β-1,3-glucan polysaccharide phổ biến rộng rãi vi sinh vật, nấm thực vật (Wu & cs, 2021) Do cấu trúc đặc biệt, β-1,3-glucan có nhiều chức sinh học khác Tuy nhiên, khả hòa tan β-1,3-glucan thấp có khối lượng phân tử cao dẫn tới khó hấp thu, hoạt tính sinh học thấp khó áp dụng rộng rãi quy mơ cơng nghiệp Gần đây, số nghiên cứu cho thấy β-1,3-glucan có khối lượng phân tử thấp tan nước có hoạt tính sinh học cao so với β-1,3-glucan có khối lượng phân tử cao (Byun & cs., 2008) Nhiều phương pháp lý học, hóa học sinh học áp dụng để làm ngắn mạch polymer Sử dụng enzyme đặc hiệu β-1,3-glucanase thủy phân β-1,3-glucan thành polymer ngắn oligomer phương pháp sinh học thân thiện mơi trường, an tồn, hiệu Vì enzyme β-1,3-glucanase thu hút quan tâm lớn nhà khoa học β-1,3-glucanase thuộc nhóm O-glycosyl hydrolase, enzym quan trọng q trình chuyển hóa carbohydrate Có nhiều β-1,3-glucanase tinh chế đặc trưng từ loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm Bacillus (Yamamoto & Horikoshi,1993), Paenibacillus (Hong & Meng, 2003), Micromonospora (Gacto & cs, 2000), Streptomyces (Shi & cs, 2010) Cellulosimicrobium (Tanabe & Oda, 2011) β-1,3-Glucanase thủy phân β-1,3glucans, biện pháp bảo vệ chống lại nấm bệnh thực vật, ngăn chặn phát triển nấm công nghệ lên men (Lee & cs, 2012; Jadhav & Gupta, 2016).Dựa chế thủy phân chất, β-1,3-glucanase phân loại thành hai loại: exo-1,3-β-Dglucanase (EC 3.2.1.58) endo-1,3-β-D-glucanase (EC 3.2.1.6 EC 3.2.1.39) Exo-1,3-βD-glucanase thủy phân glucan cách cắt liên tiếp dư lượng glucose đầu không khử sản phẩm thu chủ yếu glucose Trong đó, endo-1,3-β-D-glucanase xúc tác q trình thủy phân liên kết β-1,3-glucosidic bên vị trí ngẫu nhiên giải phóng oligosaccharide ngắn với đặc tính điều hịa miễn dịch chống khối u enzyme endoβ-1,3-glucanase (Hida & cs, 2009; Fu & cs, 2015) Hình 3.4 Trình tự amino acid suy diễn gen endo-β-1,3-glucanase chủng B amyloliquefaciens Tín hiệu peptide biểu diễn đen Mơ hình cấu trúc khơng gian endo-β-1,3-glucanase xây dựng dựa mơ hình cấu trúc endo-β-1,3-glucanase từ chủng B subtilis (chủng 168) Cấu trúc phiến β trình bày mũi tên dạng lát mỏng, cấu trúc cuộn xoắn α trình bằng hình lát mỏng dạng cuộn (Hình 3.17) Hình 3.5 Mơ hình cấu trúc khơng gian chiều protein từ chủng B amyloliquefaciens Thông qua phần mềm Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0 phân tích cấu trúc protein tương đồng nhận diện vùng chức cho thấy endo-β-1,3glucanase từ chủng B amyloliquefaciens có cấu trúc tương tự enzyme β-glucanase từ chủng B subtilis với độ tin cậy 100% Dựa cấu trúc protein c3o5sA từ chủng B subtilis (chủng 168) cấu trúc không gian endo-β-1,3-glucanase xây dựng trình bày Hình 3.5 Kết cho thấy cấu trúc bậc dựa đoán endo-β-1,3-glucanase có 15 vị trí gập cuộn xoắn β vị trí gập cuộn phiến α 24 Trình tự amino acid suy diễn thu từ kết giải trình tự plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase tiến hành so sánh với trình tự gen chủng B halotolerans Y6 (mã số: MH643779.1) đối tượng sử dụng để thiết kế mồi công cụ Clustal Omega Kết thể Hình 3.6 Hình 3.6 Kết so sánh trình amino acid suy diễn gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase chủng B amyloliquefaciens với Bacillus halotolerans Y6 (mã số: MH643779.1) Sự sai khác amino acid chủng biểu diễn đen Kết cho thấy, tỉ lệ tương đồng gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase từ B amyloliquefaciens với gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase từ chủng Bacillus halotolerans Y6 (mã số: MH643779.1) 88% Như vậy, hai gen có mối quan hệ chặt chẽ khơng hồn tồn giống Tuy nhiên, với mức độ tương đồng này, suy hai enzyme có chức chế hoạt động tương tự nhau, đặc biệt việc xúc tác thủy phân β-1,3-glucan 25 3.3 Tạo dịng gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase vào hệ thống vector pGEM®-T Chất lượng tế bào E coli DH5α khả biến, kiểm tra cách biến nạp vector pQE30 vào tế bào khả biến phương pháp sốc nhiệt, với nhiệt độ biến nạp 42oC thời gian biến nạp 55 giây Kết kiểm tra thể Hình 3.8 A B C Hình 3.7 Kết kiểm tra khả biến nạp chất lượng tế bào E coli DH5α khả biến; A: Đối chứng dương (tế bào khả biến cấy trải môi trường LB); B: Đối chứng âm (tế bào khả biến cấy trải môi trường LB chứa ampicillin; C: Tế bào biến nạp gen mục đích cấy trải lên mơi trường chứa Ampicillin Kết từ Hình 3.7 cho thấy tế bào E coli DH5α có khả biến nạp vector tái tổ hợp cho phép thể vector ngoại lai tồn tế bào, điều thể cấy trải dịch nuôi sau biến nạp lên mơi trường LB rắn có chứa 50 µg/ml ampicillin có xuất khuẩn lạc, đĩa đối chứng âm không xuất khuẩn lạc, đĩa đối chứng dương số lượng khuẩn lạc lớn chứng tỏ chất lượng tế bào khả biến tốt, từ kết sử dụng tế bào khả biến để thực thí nghiệm Gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase sau tinh gắn vào vector pGEM®-T tạo thành vector tái tổ hợp pGEM®-T/endo-β-1,3-glucanase biến nạp vào tế bào E coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Thể tái tố hợp E coli DH5α chọn lọc cấy chuyển đĩa mơi trường LB có chứa kháng sinh 50 µg/mL ampicillin ni cấy 37oC khoảng 16 Kết thể Hình 3.8 26 Hình 3.8 Thể biến nạp mơi trường LB rắn có bổ sung ampicillin Kết cho thấy, đĩa thạch có xuất khuẩn lạc E coli DH5α Vector pGEM®-T có chứa gen kháng ampicillin nên gắn thành cơng sản phẩm PCR vào vector PGEM®-T tự đóng vịng giúp E.coli DH5α có khả kháng phát triển môi trường chứa ampicillin Để sàng lọc thể biến nạp mang vector pGEM®-T tái tổ hợp, bắt ngẫu nhiên khuẩn lạc màu trắng kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc Kết thể Hình 3.9 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc màu trắng đĩa môi trường chọn lọc M: thang phân tử chuẩn 1kb (FastGene kb DNA Marker Plus, Nippon Genetics europe ), 1: Đối chứng âm, 2-6: sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli DH5α, 7: Đối chứng dương 27 Kết điện di cho thấy tất khuẩn lạc màu trắng kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc xuất băng với kích thước sản phẩm khuếch đại gen endo-β-1,3-glucanase từ DNA tổng số chủng B amyloliquefaciens, tất sản phẩm PCR có kích thước khoảng 700 bp Các khuẩn lạc cho kết sản phẩm PCR đặc trưng chọn nuôi cấy mL môi trường LB 37°C 16 Tế bào E Coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM®-T / endo-β-1,3-glucanase thu nhận ly với tốc độ 5.000 vòng/phút phút DNA plasmid tách chiết sử dụng kit Toppure ® Plasmid DNA extraction kit (ABT, Việt Nam) theo hướng dẫn nhà sản xuất Kiểm tra kích thước vector tái tổ thông qua phản ứng cắt hạn chế enzyme cắt giới hạn BstXI (Fermentas) Kết kiểm tra vector tái tổ hợp tách chiết từ E coli DH5α thể Hình 3.10 Hình 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM®-T/endo-β-1,3glucanase M: thang phân tử kb chuẩn (FastGene kb DNA Marker Plus, Nippon Genetics europe) 1: vector tái tổ hợp pGEM®-T / endo-β-1,3-glucanase tách chiết từ E coli DH5α; 2: sản phẩm phản ứng cắt vector tái tổ hợp pGEM®-T/endo-β-1,3-glucanase enzyme BstI 28 Vector tái tổ hợp pGEM®-T chèn thành cơng gen mã hóa endo-β-1,3glucanase có kích thước 3732 bp Kết điện di gel trình bày Hình 3.10 cho thấy vector tái tổ hợp nằm vị trí 10 kb, sai khác vector tái tổ hợp trạng thái vòng, dạng vòng làm vector tái tổ hợp di chuyển chậm gel agarose Vector pGEM®-T có vị trí nhận biết enzyme BstI, gen endo-β-1,3-glucanase chèn thành cơng vào vector pGEM®-T sử dụng enzyme BstI để cắt vector tái tổ hợp cho kết băng có kích thước khoảng ~3700bp Như vậy, từ việc kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng cắt hạn chế PCR khuẩn lạc cho kết với kích thước gen chứng tỏ việc tạo dịng gen endo-β-1,3glucanase vào vector pGEM®-T thành công 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên sở kết thu được, rút số kết luận sau đây: Phân lập thành công gen endo-β-1,3-glucanase từ DNA tổng số chủng B amyloliquefaciens cặp mồi đặc hiệu Gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase sau giải trình tự có kích thước 732bp, mã hóa dài 243 amino acid Phân tích cấu trúc dự đốn protein suy diễn từ gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase từ chủng B amyloliquefaciens cho thấy endo-β-1,3-glucanase thuộc nhóm glycosyl hydrolase 16 Cấu trúc bậc dựa đoán endo-β-1,3-glucanase có 15 vị trí gập cuộn phiến β vị trí gập cuộn xoắn α Tạo dịng thành cơng gen endo-β-1,3-glucanase vào vector pGEM®-T Kiến nghị Trong khóa luận này, bước đầu tơi tạo dịng thành cơng gen endo-β-1,3-glucanase vào vector pGEM®-T Do đó, tơi xin kiến nghị: Tạo dòng biểu biểu gen endo-β-1,3-glucanase vật chủ thích hợp Tối ưu hóa điều kiện biểu sản xuất endo-β-1,3-glucanase tái tổ hợp quy mơ phịng thí nghiệm 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2006) Danh mục thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi nhập vào Việt Nam Số 01/2006/QĐ-BNN Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang (1999) Di Truyền Phân Tử Những Nguyên Tắc Cơ Bản Trong Chọn Giống Cây Trồng Nhà xuất Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh Huỳnh Hồng Như Khánh, Cao Thị Thúy Hằng, Phạm Đức Thịnh, Bùi Minh Lý, Lê Quang Huấn, Ngơ Thị Duy Ngọc, Phan Thị Hồi Trinh, Võ Thị Diệu Trang, Lê Thị Hoa (2015) Sự phân bố điều kiện xúc tác β-1,3-glucanase động vật khơng xương sống biển Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ, 53(2), 139-146 Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu (2005) Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Hồng Lộc (2007) Giáo trình nhập mơn cơng nghệ sinh học NXB Đại học Huế Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, and Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Phan Thị Tuyết Minh, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Kim Thoa, Lê Gia Hy, Trần Đình Mấn (2016) Thiết kế hệ thống biểu ổn định gen mã hóa endoglucanase Bacillus subtilis 168M Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(2): 347-351 Phan Thị Tuyết Minh, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Kim Thoa, Lê Gia Hy, Trần Đình Mấn, (2012) Molecular cloning gene and nucleotide sequence of the gene encoding an endo-1, 4-beta-glucanase from Bacillus sp VLSH08 strain applying to biomass hydrolysis Journal of Vietnamese Environment, 3(2), 80-86 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thanh Thủy (1998) Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục 31 Hồ Sỹ Tráng (2006) Cơ sở hóa gỗ cellolose tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Tài liệu tiếng Anh Ausubel, F M., Brent, R., Kingston, R E., Moore, D D., Seidman, J G., Smith, J A., & Struhl, K (1992) Short protocols in molecular biology New York, 275, 28764-28773 Alias N., Mahadi N M., Murad A M A., Bakar F D A., Mahmood N A N., Illias R M (2009) Expression and characterization of Trichoderma virens UKM-1 endochitinasein Escherichia coli World J Microbiol Biotechnol, 25, 561–572 Baneyx F (1999) Ecombinant protein expression in Escherichia coli Current Opinion in Biotechnology, 10, 411-421 Cheryan, M., Parekh, S., Shah, M., & Witjitra, K (1997) Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum Advances in applied microbiology, 43, 1-33 De La Cruz, J., Pintor-Toro, J A., Benitez, T., Llobell, A., & Romero, L C (1995) A novel endo-beta-1, 3-glucanase, BGN13 1, involved in the mycoparasitism of Trichoderma harzianum Journal of bacteriology, 177(23), 6937-6945 Demain A L., Vaishnav P (2009) Production of recombinant proteins bymicrobes and higher organisms Biotechnol Adv, 53, 112-122 Du C and Webb C (2011) Cellular Systems Comprehensive Biotechnology, 1123 Dürre, P (1998) New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation Applied microbiology and biotechnology, 49(6), 639-648 Fu, Y., Cheng, L., Meng, Y., Li, S., Zhao, X., Du, Y., & Yin, H (2015) Cellulosimicrobium cellulans strain E4-5 enzymatic hydrolysis of curdlan for production of (1→ 3)-linked β-D-glucan oligosaccharides Carbohydrate polymers, 134, 740-744 Gacto, M., Vicente‐Soler, J., Cansado, J., & Villa, T G (2000) Characterization of an extracellular enzyme system produced by Micromonospora chalcea with lytic activity on yeast cells Journal of applied microbiology, 88(6), 961-967 32 Gao, M., Yang, G., Li, F., Wang, Z., Hu, X., Jiang, Y., & Zhan, X (2021) Efficient endo-β-1, 3-glucanase expression in Pichia pastoris for co-culture with Agrobacterium sp for direct curdlan oligosaccharide production International Journal of Biological Macromolecules, 182, 1611-1617 Gao, M J., Yan, J J., Zhao, Y., Zhu, L., Yang, G S., & Zhan, X B (2021) Expression of a thermostable β-1, 3-glucanase from Trichoderma harzianum in Pichia pastoris and use in oligoglucosides hydrolysis Process Biochemistry, 107, 74-82 Giese, E C., Dekker, R F., Scarminio, I S., Barbosa, A M., & da Silva, R (2011) Comparison of β-1, 3-glucanase production by Botryosphaeria rhodina MAMB-05 and Trichoderma harzianum Rifai and its optimization using a statistical mixturedesign Biochemical Engineering Journal, 53(2), 239-243 Hartingsveldt W., Zeijl C M., Harteeld G M., Gouka R J (1993) Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of A nige Gene, 127, 87-94 Henrissat, B (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities Biochemical journal, 280(2), 309-316 Hida, T H., Ishibashi, K., Miura, N N., Adachi, Y., Shirasu, Y., & Ohno, N (2009) Cytokine induction by a linear 1, 3-glucan, curdlan-oligo, in mouse leukocytes in vitro Inflammation Research, 58(1), 9-14 Hodgson J (1994) The changing bulk biocatalyst market Biotechnol, 12, 789-790 Hong, T Y., & Meng, M (2003) Biochemical characterization and antifungal activity of an endo-1, 3-β-glucanase of Paeni Bacillus amyloliquefaciens isolated from garden soil Applied microbiology and biotechnology, 61(5), 472-478 Howard, R L., Abotsi, E L J R., Van Rensburg, E J., & Howard, S (2003) Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production African Journal of biotechnology, 2(12), 602-619 Hsu, C K., Liao, J W., Chung, Y C., Hsieh, C P., & Chan, Y C (2004) Xylooligosaccharides and fructooligosaccharides affect the intestinal microbiota and precancerous colonic lesion development in rats The Journal of nutrition, 134(6), 15231528 33 Jadhav, S B., & Gupta, A (2016) Studies on application of β-1, glucanase in the degradation of glucans produced by Botrytis cinerea and inhibition of fungal growth Biocatalysis and agricultural biotechnology, 7, 45-47 Kelley L A., Mezulis S., Yates C M., Wass M N., and Sternberg M J E (2015) The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis Nature Protocols, 10(6): 845-858 Kuzu, S B., Güvenmez, H K., & Denizci, A A (2012) Production of a thermostable and alkaline chitinase by Bacillus thuringiensis subsp kurstaki strain HBK51 Biotechnology research international Lee, S Y., Tindwa, H., Lee, Y S., Naing, K W., Hong, S H., Nam, Y., & Kim, K Y (2012) Biocontrol of Anthracnose in Pepper Using Chitinase, beta-1, Glucanase, and 2-Furancarboxaldehyde Produced by Streptomyces cavourensis SY224 Journal of microbiology and biotechnology, 22(10), 1359-1366 Liu, B., Xue, X., Cui, S., Zhang, X., Han, Q., Zhu, L., & Kang, Z (2010) Cloning and characterization of a wheat β-1, 3-glucanase gene induced by the stripe rust pathogen Puccinia striiformis f sp tritici Molecular Biology Reports, 37(2), 1045-1052 Nakakuki, T (2003) Development of functional oligosaccharides in Japan Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 15(82), 57-64 Malherbe D F., Toit M D., Otero R R C., Rensburg P Van, Pretorius I S (2003) Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wine production Appl Microbiol Biotechnol, 61, 502–511 M.J McPherson, and S.G Moller Springer-Verlag, NY, NY 2000 ISBN 1859960170 Applied Molecular Genetics Course: ENTO 5133–Spring 2006 Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., & Erlich, H (1992) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction Biotechnology Series, 17-17 Omogbenigun, F O., Nyachoti, C M., & Slominski, B A (2004) Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs Journal of Animal Science, 82(4), 1053-1061 34 Petersen T.N., Brunak S., Heijne G.V., and Nielsen H (2011), SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions Nature Methods, 8: 785-786 Rajninec, M., Fratrikova, M., Boszoradova, E., Jopcik, M., Bauer, M., & Libantova, J (2021) Basic β-1, 3-Glucanase from Drosera binata Exhibits Antifungal Potential in Transgenic Tobacco Plants Plants, 10(8), 1747 Ribeiro, T C., Weiblen, C., de Azevedo, M I., de Avila Botton, S., Robe, L J., Pereira, D I B., & Santurio, J M (2017) Microevolutionary analyses of Pythium insidiosum isolates of Brazil and Thailand based on exo-1, 3-β-glucanase gene Infection, Genetics and Evolution, 48, 58-63 Jaafar, N R., Khoiri, N M., Ismail, N F., Mahmood, N A N., Murad, A M A., Bakar, F D A., & Illias, R M (2020) Functional characterisation and product specificity of Endo-β-1, 3-glucanase from alkalophilic bacterium, Bacillus lehensis G1 Enzyme and microbial technology, 140, 109625 Sambrook, J., Fritsch, E F., & Maniatis, T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual (No Ed 2) Cold spring harbor laboratory press Shi, P., Yao, G., Yang, P., Li, N., Luo, H., Bai, Y., & Yao, B (2010) Cloning, characterization, and antifungal activity of an endo-1, 3-β-D-glucanase from Streptomyces sp S27 Applied microbiology and biotechnology, 85(5), 1483-1490 Stroh W H (1994) Trends in the use of industrial bioprocessing mes for the 21st century Gen Eng News 14(16), 10-12 Taif, S., Zhao, Q., Pu, L., Li, X., Liu, D., & Cui, X (2020) A β‐1, 3‐glucanase gene from Panax notoginseng confers resistance in tobacco to Fusarium solani Industrial Crops and Products, 143, 111947 Tanabe, Y., & Oda, M (2011) Molecular characterization of endo-1, 3-β-glucanase from Cellulosimicrobium cellulans: effects of carbohydrate-binding module on enzymatic function and stability Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1814(12), 1713-1719 Yamamoto, M., Aono, R., & Horikoshi, K (1993) Structure of the 87-kDa β-1, 3glucanase gene of Bacillus circulans IAM1165 and properties of the enzyme accumulated 35 in the periplasm of Escherichia coli carrying the gene Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57(9), 1518-1525 Zhang, S B., Zhang, W J., Zhai, H C., Lv, Y Y., Cai, J P., Jia, F., & Hu, Y S (2019) Expression of a wheat β-1, 3-glucanase in Pichia pastoris and its inhibitory effect on fungi commonly associated with wheat kernel Protein Expression and Purification, 154, 134-139 Zhiwei Xu, Ming-Che Shih, Jonathan E Poulton (2006) An extracellular exo-β(1,3)-glucanase from Pichia pastoris: Purification, characterization, molecular cloning, and functional expression Protein Expression and Purification, 47, 118–127 36 PHỤ LỤC Phụ lục Kết giải trình tự gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase ATGTTTTATCGTATGAAACGAGTGCTGCTCATTCTTGTCACTGGATTGTTTTTG AGTTTGTGTGCGATCACTTCTGCTGCATCAGCTCAAACAGGCGGATCGTTTTTT GAACCTTTTAACAGCTATAACTCCGGTTTCTGGCAAAAAGCAAATGGTTACTC CAATGGAGATATGTTCAACTGCACTTGGCGTGCAAATAATGTATCCGTGACGT CATCAGGTGAAATGCGTTTGGCGCTGACAAGCCCGTCTTATAACAAGTTTGAC TGCGGGGAGAACCGCTCCGCTCAAACCTATGGCTATGGACTTTATGAAGTCAG AATGAAACCGGCTAAAAACACGGGGATCGTTTCATCGTTCTTCACTTATACAG GTCCAACGGATGGTACCCCTTGGGATGAGATTGATATCGAATTTTTAGGAAAA GACACGACAAAGGTTCAATTTAATTATTATACAAATGGCGCGGGAAACCATG AGAAGGTTGCGGATCTCGGATTTGACGCGGCCAATGCCTATCATACGTATGCG TTCGATTGGCAGCCGAACTCTATTAAATGGTATGTCGATGGGCAATTAAAACA TACTGCGACAAGCCAAATCCCGACAACACCGGGAAAGATCATGATGAACTTG TGGAATGGGATAGGTGTCGATGACTGGCTCGGTTCCTACAATGGTGTAAATCC GCTATACGCTCATTATGACTGGGTGCGCTATACAAAAAAATAA Phụ lục Thang phân tử chuẩn kb (HyperLadder™ DNA maker) Phụ lục Thang phân tử kb chuẩn (FastGene kb DNA Marker Plus) 37 38