Nghiên cứu phân lập và tạo dòng gene mã hóa chitinase từ bacillus sp tb1 vào vector pgem – t

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG QUÁCH THỊ THU THỂ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TẠO DỊNG GENE MÃ HĨA CHITINASE TỪ BACILLUS SP TB1 VÀO VECTOR pGEM – T KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng – 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG QUÁCH THỊ THU THỂ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TẠO DỊNG GENE MÃ HĨA CHITINASE TỪ BACILLUS SP TB1 VÀO VECTOR pGEM – T Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn: ThS Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày đề tài trung thực, khách quan nghiêm túc Những tài liệu tham khảo cho đề tài có nguồn gốc rõ ràng Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Quách Thị Thu Thể i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khố luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình tơi thực đề tài khố luận Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS Vũ Đức Hồng – giảng viên tận tình hướng dẫn, giúp đỡ việc trau dồi kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm suốt q trình tơi thực đề tài Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Quách Thị Thu Thể ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii TÓM TẮT viii MỞ DẦU 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 3.Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 3.1.Ý nghĩa khoa học 3.2.Ý nghĩa thực tiễn 4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1.Giới thiệu chitinase 1.1.2.Phân loại chitinase 1.1.3.Cấu trúc chitinase 1.1.4.Cơ chế thủy phân chitin 1.1.5.Nguồn gốc chitinase 1.1.6.Ứng dụng chitinase 1.2.TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 11 1.2.1.Giới thiệu chung 11 1.2.2.Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp sản xuất enzyme 11 1.3.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI 12 1.3.1 Một số nghiên cứu nước 12 1.3.2 Một số nghiên cứu giới 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1.Đối tượng phạm vi nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 iii 2.3.1 Phân lập gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp TB1 đọc trình tự gene 18 2.3.2 Thiết kế mồi với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế 20 2.3.3 Tạo dòng gene mã hóa chitinase với hai đầu hạn chế vào vector pGEM – T 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Phân lập gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp TB1 đọc trình tự gene 23 3.2.Thiết kế mồi với hai đầu chứa trình tự chứa trình tự enzyme cắt hạn chế 26 3.3.Tạo dịng gene mã hóa chitinase vào vector pGRM – T 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 1.KẾT LUẬN 32 2.KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 40 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp Cs Base pair Cộng DNA EDTA Deoxyribonucleic acid Ethylene diamine tetra-acetic acid LB Kb NCBI Môi trường Luria bertani Kilobase National Center for Biotechnology Information PCI PCR TBE TE Phenol : chloroform : isoamylalcohol Polymerase chain reaction Tris-Borate-EDTA Tris-EDTA v DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tiêu đề hình Trang 1.1 Vị trí cắt chitinase 2.1 Vector pGEM – T 18 2.2 Chuẩn bị tế bào E.Coli TOP10 khả biến 21 3.1 DNA tổng số chủng Bacillus sp TB1 23 3.2 Sản phẩm khuếch đại PCR gene chitinase 24 3.3 Sản phẩm tinh gene mã hóa chitinase gửi đọc trình tự 24 3.4 Khung đọc mở 25 3.5 Trình tự amino acid suy diễn gene mã hóa chitinase chủng Bacillus sp TB1 25 3.6 Mơ hình cấu trúc khơng gian chiều gene chitinase 26 3.7 Bản đồ enzyme cắt hạn chế gene mã hóa chitinase 26 3.8 Vector pQE30 27 3.9 Khuếch đại PCR gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế 28 3.10 Tinh gene chitinase 29 3.11 Kiểm tra tế bào E.Coli TOP10 khả biến 30 3.12 Tạo dịng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T 31 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Tiêu đề bảng Trang 2.1 Trình tự mồi dùng để khuếch đại gene chitinase 19 3.1 Trình tự mồi dùng để khuếch đại gene chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế 27 vii TĨM TẮT Chitinase thu nhận từ nhiều nguồn, có vi khuẩn, đặc biệt Bacillus sp quan tâm nghiên cứu nhiều chitinase từ Bacillus sp có hoạt tính cao Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc chọn lọc gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp để tạo dịng biểu vật chủ thích hợp nhằm tạo lượng lớn chitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao coi phương thức có triển vọng khả thi Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng chủng Bacillus sp TB1 có hoạt tính phân hủy chitin cao cung cấp từ phịng thí nghiệm Sinh học phân tử Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng Chúng tơi dựa vào trình tự mồi đặc hiệu để tiến hành phân lập gene mã hóa chitinase Sau xác định trình tự gene mã hóa chitinase (gửi đọc trình tự cơng ty Fist base Malaysia), thực thiết kế lại mồi sử dụng trình tự enzyme cắt hạn chế (BamHI HindIII) hai đầu làm nguồn nguyên liệu để sử dụng gắn vào vector pGEM – T, định hướng cho tạo dịng biểu gene mã hóa chitinase Kết giải trình tự gene mã hóa chitinase cho thấy gene có chiều dài 1083 nucleotide, mã hóa protein dài 360 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 37 kDa Từ khóa: Bacillus sp TB1, tạo dịng, vector pGEM – T viii Và vector lựa chọn biểu gene (vector pQE30) Hình 3.8 Vector pQE30 Từ kết đồ enzyme cắt hạn chế gene enzyme cắt hạn chế vector pQE30, mồi thiết kế dựa trình tự gene chitinase vi khuẩn Bacillus subtilis HDZK-BYSB7 (mã số: CP026608) với hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế lựa chọn BamHI HindIII Trình tự mồi trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Trình tự mồi dùng để khuếch đại gene chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế Mồi Trình tự FChi1Kb2 5’-GGATCCGC AAACAATTTAGGATCAAA-3’ RChi1Kb2 5’-AAGCTTTTATTTTTGCAAGGGGATCG-3’ GGATCC: BamHI AAGCTT: HindIII 27 Hầu hết plasmid vector mang hai nhiều vị trí nhận biết enzyme hạn chế, ví dụ: vector pBR 322 chứa vị trí nhận biết đơn HindIII BamHI sau cắt hai enzyme hạn chế tương ứng, đoạn DNA plasmid lớn tinh điện di agarose gel gắn với đoạn DNA ngoại lai mang đầu kết dính tương đồng với cắt HindIII BamHI Kết quả, thể tái tổ hợp dạng vịng mang tính kháng Amp sau dùng để biến nạp vào E.Coli Do thiếu bổ trợ đầu lồi HindIII BamHI nên đoạn vector lớn khơng thể tái tạo vịng cách hiệu biến nạp vào E.Coli (Nguyễn Hoàng Lộc cs, 2007) 3.3 Tạo dịng gene mã hóa chitinase vào vector pGRM – T 3.3.1 Phân lập gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự cắt hạn chế Kết khuếch đại PCR thành cơng gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự hạn chế (Hình 3.9.) Hình 3.9 Khuếch đại PCR gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế L: HyperLadder 1kb, 1: sản phẩm PCR gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế Tiến hành tinh sản phẩm PCR kít GeneJET Gel Extraction Kit hãng Thermo Scientific theo hướng dẫn nhà sản xuất Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh gene mã hóa chitinase gel agarose 1% trình bày Hình 3.10 28 Hình 3.10 Tinh gene chitinase L: HyperLadder 1kb, 1: gene mã hóa chitinase tinh Kết điện di cho thấy q trình tinh thực thành cơng, băng rõ, bẩn, nồng độ ước tính khoảng 50ng/µL, kích thước band khoảng Kb Gene mã hóa chitinase sau tinh sử dụng để thực phản ứng gắn vào vector pGEM – T 3.3.2 Kết kiểm tra tế bào khả biến Các tế bào E.Coli TOP10 phát triển nhanh chóng có sức sống khỏe mạnh chuyển hóa tích cực tạo tế bào khả biến dễ dàng giai đoạn tăng trưởng khác Vì cần thiết đưa vào giai đoạn phát triển nhanh trước bắt đầu Plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy/Chitinase (gene mã hóa chitinase có kích thước 2025bp) biến nạp vào tế bào E Coli TOP10 phương pháp sốc nhiệt 42℃ 55 giây (Sambrook and Russell, 2003) Kết thể hình 3.11 29 Hình 3.11 Kiểm tra tế bào E.Coli TOP10 khả biến A: LB + tế bào khả biến + H2O, B: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến + H2O, C: LB + tế bào khả biến + pGEM – T Easy/Chitinase, D: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến + pGEM – T Easy/Chitinase Kết kiểm tra tế bào khả biến cho thấy, đĩa thạch môi trường LB có bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 50μg/mL, có xuất khuẩn lạc E Coli TOP10 Các khuẩn lạc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pGEM – T Easy/Chitinase Tế bào khả biến có chất lượng tốt, sử dụng cho nghiên cứu 3.3.3 Tạo dịng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T hóa biến nạp vào E.Coli TOP10 Gene mã hóa chitinase sau tinh gắn vào vector pGEM – T tạo thành vector tái tổ hợp pGEM – T/chitinase biến nạp vào tế bào E Coli TOP10 phương pháp sốc nhiệt Kết thể hình 3.12 30 Hình 3.12 Tạo dịng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T A: LB + tế bào khả biến + H2O, B: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến + H2O, C: LB + tế bào khả biến + Ligation mixture, D: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến + Ligation mixture Kết cho thấy, đĩa thạch mơi trường LB có bổ sung ampicillin nồng độ cuối 50μg/mL, không xuất khuẩn lạc E Coli TOP10 cho thấy khơng biến nạp mang vector pGEM – T tái tổ hợp 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trên sở kết thu được, rút số kết luận sau đây: Khuếch đại thành cơng gene chitinase có kích thước khoảng 1kb từ DNA tổng số chủng Bacillus sp TB1 Chiều dài gene chitinase 1083 nucleotide, mã hóa protein dài 360 amino acid Thiết kế mồi với hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế (BamHI HindIII) Phân lập thành công gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế (BamHI HindIII) Tạo dịng chưa thành cơng gene chitinase vào vector pGEM – T KIẾN NGHỊ Việc tạo dịng gene mã hóa chitinase sở cho việc biểu gene tối ưu điều kiện biểu Do đó, tơi xin kiến nghị: Tiếp tục tạo dịng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T làm sở cho việc tạo dòng biểu vào vector pQE30 Biểu gene mã hóa chitinase vật chủ E.Coli M15 Tối ưu hóa điều kiện biểu sản xuất chitinsae tái tổ hợp quy mơ phịng thí nghiệm 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alias, N., Mahadi, N.M., Murad, A.M.A., Bakar, F.D.A., Mahmood, N.A.N., Illias, R.M., 2009 Expression and characterization of Trichoderma virens UKM-1 endochitinase in Escherichia coli World J Microbiol Biotechnol 25, 561–572 https://doi.org/10.1007/s11274-008-9924-y Al-Rashed, S.A.A., Bakar, F.D.A., Said, M., Hassan, O., Rabu, A., Illias, R.M., Murad, A.M.A., n.d Expression and characterization of the recombinant Trichoderma virens endochitinase Cht2 10 A.T, N., Rasoul-Amini, S., Morowvat, M.H., Younes, G., 2011 Single Cell Protein: Production and Process Am J Food Technol https://doi.org/10.3923/ajft.2011.103.116 Baneyx, F., 1999 Recombinant protein expression in Escherichia coli Curr Opin Biotechnol 10, 411–421 https://doi.org/10.1016/s0958-1669(99)00003-8 Bhattacharya, D., Nagpure, Dr.A., Gupta, R., 2007 Bacterial Chitinases: Properties and Potential Crit Rev Biotechnol 27, 21–8 https://doi.org/10.1080/07388550601168223 Bhushan, B., Hoondal, G.S., 1998 Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp BG-11 Biotechnol Lett 20, 157– 159 https://doi.org/10.1023/A:1005328508227 Breman, J., Brandling-Bennett, A., 2012 The challenge of malaria eradication in the twenty-first century: Research linked to operations is the key Vaccine 29 Suppl 4, D97-103 https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.12.003 Bussink, A.P., van Eijk, M., Renkema, G.H., Aerts, J.M., Boot, R.G., 2006 The Biology of the Gaucher Cell: The Cradle of Human Chitinases, in: International Review of Cytology, A Survey of Cell Biology Academic Press, pp 71–128 https://doi.org/10.1016/S0074-7696(06)52001-7 C, S.D., V., M., Archana, B., Roy, S., Naine, J., 2015 Production and partial purification of antifungal chitinase from Bacillus cereus VITSD3 Biosci J 31, 960–968 https://doi.org/10.14393/BJ-v31n3a2015-26263 Cai, Y., Yan, J., Hu, X., Han, B., Yuan, Z., 2007 Improving the Insecticidal Activity against Resistant Culex quinquefasciatus Mosquitoes by Expression of Chitinase Gene chiAC in Bacillus sphaericus Appl Environ Microbiol 73, 7744–7746 https://doi.org/10.1128/AEM.01510-07 Castillo, B.M., Dunn, M.F., Navarro, K.G., Meléndez, F.H., Ortiz, M.H., Guevara, S.E., Palacios, G.H., 2016 Antifungal performance of extracellular chitinases and culture 33 supernatants of Streptomyces galilaeus CFFSUR-B12 against Mycosphaerella fijiensis Morelet World J Microbiol Biotechnol 32, 44 https://doi.org/10.1007/s11274-015-1993-0 Chen, W.-M., Chen, G.-H., Chen, C.-S., Jiang, S.-T., 2009 Cloning, Expression and Purification of Bacillus cereus Endochitinase in the Escherichia coli AD494(DE3)pLysS Expression System Biosci Biotechnol Biochem advpub, 0904081425–0904081425 https://doi.org/10.1271/bbb.80618 Chil – Min Wen, Chien – Sheng Tseng, Chil – Yu Cheng, Yaw – Kuen Li (2010); Purification, characterization and cloning of a chitinase from Bacillus sp NCTU2; Department of Applied Chemistry, The National Chiao Tung University Chu Thị Hoa (2012), Tách dịng biểu gene mã hóa chitinase B licheniformis KNUC213 Pichia pastoris, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam – Viện Sinhh thái Tài nguyên sinh vật Collinge, D.B., Kragh, K.M., Mikkelsen, J.D., Nielsen, K.K., Rasmussen, U., Vad1, K., 1993 Plant chitinases Plant J 3, 31–40 https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.1993.t011-00999.x Corona, J.E., Nieto-Mazzocco, E., Velázquez-Robledo, R., Salcedo-Hernández, R., Bautista, M., Jiménez, B., Ibarra, J., 2003 Cloning, Sequencing, and Expression of the Chitinase Gene chiA74 from Bacillus thuringiensis Appl Environ Microbiol 69, 1023–9 https://doi.org/10.1128/AEM.69.2.1023-1029.2003 Dahiya, N., Tewari, R., Tiwari, R.P., Hoondal, G.S., 2005 Production of an Antifungal Chitinase from Enterobacter sp NRG4 and its Application in Protoplast Production World J Microbiol Biotechnol 21, 1611–1616 https://doi.org/10.1007/s11274-005-8343-6 Demain, A.L., Vaishnav, P., 2009 Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms Biotechnol Adv 27, 297–306 https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2009.01.008 Deng, J.-J., Shi, D., Mao, H., Li, Z., Liang, S., Ke, Y., Luo, X., 2019 Heterologous expression and characterization of an antifungal chitinase (Chit46) from Trichoderma harzianum GIM 3.442 and its application in colloidal chitin conversion Int J Biol Macromol 134, 113–121 https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.04.177 Driss, F., Kallassy‐Awad, M., Zouari, N., Jaoua, S., 2005 Molecular characterization of a novel chitinase from Bacillus thuringiensis subsp kurstaki J Appl Microbiol 99, 945– 953 https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2005.02639.x Flach, J., Pilet, P.-E., Jollès, P., 1992 What’s new in chitinase research? Experientia 48, 701–716 https://doi.org/10.1007/BF02124285 34 Giáo trình Cơng Nghệ Sinh Học Môi Trường Tập - Nguyễn Đức Lượng, 2016 Công Nghệ Môi Trường URL http://congnghemoitruong.com.vn/giao-trinh-cong-nghesinh-hoc-moi-truong-tap-2/ (accessed 5.6.21) Hamid, R., Khan, M., Ahmad, M., Ahmad, M.M., Abdin, M., Musarrat, J., Javed, S., 2013 Chitinases: An update J Pharm Bioallied Sci 5, 21–9 https://doi.org/10.4103/09757406.106559 Haran, S., 1996 Differential Expression of Trichoderma harzianum Chitinases During Mycoparasitism Phytopathology 86, 980 https://doi.org/10.1094/Phyto-86-980 Harman, G., 2000 Myths and Dogmas of Biocontrol Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzinum T-22 Plant Dis - PLANT DIS 84, 377–393 https://doi.org/10.1094/PDIS.2000.84.4.377 Hoàng V.Đ., Huy N.Đ., Thảo T.T.P., Thoa L.T.K., Trang L.V.K., Lan T.T.P., n.d Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2020 Horsch, M., Mayer, C., Sennhauser, U., Rast, D.M., 1997 β-N-Acetylhexosaminidase: A target for the design of antifungal agents Pharmacol Ther., Proceedings of the Sixth International Symposium on Molecular Aspects of Chemotherapy 76, 187–218 https://doi.org/10.1016/S0163-7258(97)00110-1 Itoh, T., Araki, T., Nishiyama, T., Hibi, T., Kimoto, H., 2019 Structural and functional characterization of a glycoside hydrolase family β-N-acetylglucosaminidase from Paenibacillus sp str FPU-7 J Biochem (Tokyo) 166, 503–515 https://doi.org/10.1093/jb/mvz072 Jinzhu, S., Qian, Y., Beidong, L., Dianfu, C., 2005 Expression of the chitinase gene from Trichoderma aureoviride in Saccharomyces cerevisiae Appl Microbiol Biotechnol 69, 39–43 https://doi.org/10.1007/s00253-005-1957-7 Juárez-Hernández, E.O., Casados-Vázquez, L.E., Brieba, L.G., Torres-Larios, A., Jimenez-Sandoval, P., Barboza-Corona, J.E., 2019 The crystal structure of the chitinase ChiA74 of Bacillus thuringiensis has a multidomain assembly Sci Rep 9, 2591 https://doi.org/10.1038/s41598-019-39464-z Karasuda, S., Tanaka, S., Kajihara, H., Yamamoto, Y., Koga, D., 2003 Plant Chitinase as a Possible Biocontrol Agent for Use Instead of Chemical Fungicides Biosci Biotechnol Biochem 67, 221–224 https://doi.org/10.1271/bbb.67.221 Kezuka, Y., Ohishi, M., Itoh, Y., Watanabe, J., Mitsutomi, M., Watanabe, T., Nonaka, T., 2006 Structural Studies of a Two-domain Chitinase from Streptomyces griseus HUT6037 J Mol Biol 358, 472–484 https://doi.org/10.1016/j.jmb.2006.02.013 35 Kuranda, M.J., Robbins, P.W., 1991 Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae J Biol Chem 266, 19758–19767 https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)55057-2 Kurita, K., 2001 Controlled functionalization of the polysaccharide chitin Prog Polym Sci 26, 1921–1971 https://doi.org/10.1016/S0079-6700(01)00007-7 Laine, R.A., Lo, W.C.J., 2000 Diagnosis of fungal infections with a chitinase US6093552A Le, B., Yang, S.H., 2018 Characterization of a chitinase from Salinivibrio sp BAO1801 as an antifungal activity and a biocatalyst for producing chitobiose J Basic Microbiol 58, 848–856 https://doi.org/10.1002/jobm.201800256 Lee, Y.-S., Park, I.-H., Yoo, J.-S., Chung, S.-Y., Lee, Y.-C., Cho, Y.-S., Ahn, S.-C., Kim, C.-M., Choi, Y.-L., 2007 Cloning, purification, and characterization of chitinase from Bacillus sp DAU101 Bioresour Technol 98, 2734–2741 https://doi.org/10.1016/j.biortech.2006.09.048 Liu, J., NanGong, Z., Zhang, J., Song, P., Tang, Y., Gao, Y., Wang, Q., 2019 Expression and characterization of two chitinases with synergistic effect and antifungal activity from Xenorhabdus nematophila World J Microbiol Biotechnol 35, 106 https://doi.org/10.1007/s11274-019-2670-5 Loc, N.H., Quang, H.T., Hung, N.B., Huy, N.D., Phuong, T.T.B., Ha, T.T.T., 2011 Trichoderma asperellum Chi42 Genes Encode Chitinase Mycobiology 39, 182–186 https://doi.org/10.5941/MYCO.2011.39.3.182 Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P.M., Henrissat, B., 2014 The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013 Nucleic Acids Res 42, D490– D495 https://doi.org/10.1093/nar/gkt1178 Lorito, M., Peterbauer, C., Hayes, C.K., Harman, G.E.Y 1994, n.d Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination Microbiology 140, 623–629 https://doi.org/10.1099/00221287-140-3-623 Malherbe, D.F., du Toit, M., Cordero Otero, R.R., van Rensburg, P., Pretorius, I.S., 2003 Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wine production Appl Microbiol Biotechnol 61, 502–511 https://doi.org/10.1007/s00253-002-1208-0 Miller, L.H., 1992 The challenge of malaria Science 257, 36–38 36 Murao, S., Kawada, T., Itoh, H., Oyama, H., Shin, T., 1992 Purification and Characterization of a Novel Type of Chitinase from Vibrio alginolyticus TK-22 Biosci Biotechnol Biochem 56, 368–369 https://doi.org/10.1271/bbb.56.368 Nguyễn Bảo Hưng (2010), Tạo dòng biểu gen chitinase từ nấm Trichoderma, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế Nguyễn Đức Lượng (2002) “Thí nghiệm cơng nghệ sinh học” NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh p 3-67, 260-291 Nguyễn Hồng Lộc (2007), Giáo trình nhập mơn cơng nghệ sinh học, NXB Đại học Huế Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi (2007), Giáo trình Sinh học phân tử, NXB Đại học Huế Nguyễn Quỳnh Anh, Nguyễn Đức Hồng, Trần Linh Thước (2003), “Tạo dịng mã hóa protein vỏ VP19 vi rút WSSV gây hội chứng đốm trắng tôm Sú (P monodon)”, TC Di truyền học & Ứng dụng 4, tr 49-55 Patil, R.S., Ghormade, V., Deshpande, M.V., 2000 Chitinolytic enzymes: an exploration Enzyme Microb Technol 26, 473–483 Quách Ngọc Tùng, Nguyễn Văn Hiếu Phí Quyết Tiến (2013) “Biểu gen mã hóa chitinase Bacillus licheniformis KNUC213 Escherichia coli” Kỷ yếu Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc Nhà xuất Khoa học Công nghệ 631634 Quách Ngọc Tùng, Nguyễn Văn Hiếu, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Bùi Thị Liên, Nguyễn Văn Thế, Phí Quyết Tiến(2020), Đặc điểm sinh học tiềm sinh tổng hợp Chitinase vi khuẩn Bacillus Licheniformis DS23, Viện Công nghệ sinh học (IBT), Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST) Rajan, L.A., Dharini, J., Singh, K.H.P., Sivvaswaamy, S.N., Sheela, J.S., Sundar, N., 2010 Identification, cloning and sequence analysis of chitinase gene in Bacillus halodurans isolated from salted fish Biotechnology 9, 229–233 Rathore, A.S., Gupta, R.D., 2015 Chitinases from Bacteria to Human: Properties, Applications, and Future Perspectives Enzyme Res 2015, 1–8 https://doi.org/10.1155/2015/791907 Saleem, F., Younas, A., Bashir, R., Naz, S., Munir, N., Shakoori, A.R., n.d Molecular Cloning and Characterization of Exochitinase A Gene of Indigenous Bacillus thuringiensis Isolates 11 37 Sambrook, J., Russell, D.W., 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual CSHL Press Sharma, R.R., Singh, D., Singh, R., 2009 Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: A review Biol Control 50, 205–221 https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2009.05.001 Shubakov, A.A., Kucheryavykh, P.S., 2004 Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi Appl Biochem Microbiol 40, 445–447 https://doi.org/10.1023/B:ABIM.0000040665.98210.97 Singh, G., Bhalla, A., Bhatti, J., Chandel, S., Rajput, A., Abdullah, A., Andrabi, S., Kaur, P., 2013 Potential of Chitinases as a Biopesticide against Agriculturally Harmful Fungi and Insects Res Rev J Microbiol Biotechnol 3, 27–32 Srivastava, D.B., Ethayathulla, A.S., Kumar, J., Singh, N., Sharma, S., Das, U., Srinivasan, A., Singh, T.P., 2006 Crystal structure of a secretory signalling glycoprotein from sheep at 2.0Å resolution J Struct Biol 156, 505–516 https://doi.org/10.1016/j.jsb.2006.05.008 Sun, X.-D., Lee, I.-S., 2006 Gene Technology in Tissue Engineering Am J Biochem Biotechnol 2, 66–72 https://doi.org/10.3844/ajbbsp.2006.66.72 Swiontek Brzezinska, M., Jankiewicz, U., Burkowska, A., Walczak, M., 2014 Chitinolytic Microorganisms and Their Possible Application in Environmental Protection Curr Microbiol 68, 71–81 https://doi.org/10.1007/s00284-013-0440-4 tailieumienphi.vn, n.d [PDF]Giáo trình Nhập mơn Cơng nghệ sinh học - PGS TS Nguyễn Hồng Lộc.pdf [WWW Document] tailieumienphi.vn URL https://tailieumienphi.vn/doc/giao-trinh-nhap-mon-cong-nghe-sinh-hoc-pgs-ts-nguyenhoang-loc-ophbuq.html (accessed 5.6.21) Tạo dòng biểu gen chitinase từ nấm trichoderma - Luận văn, đồ án, đề tài tốt nghiệp [WWW Document], n.d URL http://luanvan.co/luan-van/tao-dong-va-bieu-hien-genchitinase-tu-nam-trichoderma-3181/ (accessed 5.3.21) Taylor, S., 2005 Advances in Food and Nutrition Research Elsevier Thomas, C., Gooday, G., King, L., Possee, R., 2000 Mutagenesis of the active site coding region of the Autographa californica nucleopolyhedrovirus chiA gene J Gen Virol 81, 1403–11 https://doi.org/10.1099/0022-1317-81-5-1403 Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Ngơ Đình Bính (2017), Biểu tinh chitinase từ Bacillus thuringiensis serovar kurstaki vi khuẩn Escherichia Coli, Vietnam Journal of Bioteachnology - Vol 15, No 38 Trịnh Thị Thu Hà, Lê Thị Minh Thành, Lê Văn Trường, Mẫn Hồng Phước, Hoàng Thị Hồng Anh Đồng Văn Quyền (2018), Sàng lọc nghiên khả sinh tổng hợp chitinase chủng Bacillus thuringiensis phân lập Việt Nam, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH CN Việt Nam Umemoto, N., Kanda, Y., Ohnuma, T., Osawa, T., Numata, T., Sakuda, S., Taira, T., Fukamizo, T., 2015 Crystal structures and inhibitor binding properties of plant class V chitinases: the cycad enzyme exhibits unique structural and functional features Plant J 82, 54–66 https://doi.org/10.1111/tpj.12785 Vaaje‐Kolstad, G., Horn, S.J., Sørlie, M., Eijsink, V.G.H., 2013 The chitinolytic machinery of Serratia marcescens – a model system for enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharides FEBS J 280, 3028–3049 https://doi.org/10.1111/febs.12181 van Hartingsveldt, W., van Zeijl, C.M.J., Harteveld, G.M., Gouka, R.J., Suykerbuyk, M.E.G., Luiten, R.G.M., van Paridon, P.A., Selten, G.C.M., Veenstra, A.E., van Gorcom, R.F.M., van den Hondel, C.A.M.J.J., 1993 Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger Gene 127, 87–94 https://doi.org/10.1016/0378-1119(93)90620-I Wadhwa, M., Bakshi, M.P.S., 2016 Chapter 10 - Application of Waste-Derived Proteins in the Animal Feed Industry, in: Singh Dhillon, G (Ed.), Protein Byproducts Academic Press, pp 161–192 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802391-4.00010-0 Wang, D., Li, A., Han, H., Liu, T., Yang, Q., 2018 A potent chitinase from Bacillus subtilis for the efficient bioconversion of chitin-containing wastes Int J Biol Macromol 116, 863–868 https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.05.122 Wilson, K., 2001 Preparation of Genomic DNA from Bacteria, in: Current Protocols in Molecular Biology / Edited by Frederick M Ausubel [và cs.] p 2.4.1-2.4.5 https://doi.org/10.1002/0471142727.mb0204s56 Yang, C.-Y., Ho, Y.-C., Pang, J.-C., Huang, S.-S., Tschen, J.S.-M., 2009 Cloning and expression of an antifungal chitinase gene of a novel Bacillus subtilis isolate from Taiwan potato field Bioresour Technol 100, 1454–1458 https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.07.039 Yu, P., Li, J.-R., 2008 Molecular cloning, sequence analysis, expression and characterization of the endochitinase gene from Trichoderma sp in Escherichia coli BL21 World J Microbiol Biotechnol 24, 2509–2516 https://doi.org/10.1007/s11274-008-9772-9 39 PHỤ LỤC Hình HyperLadder 1kb (Bioline – UK) 40 Hình Trình tự nucleotide gene mã hóa chitinase phân lập từ Bacillus sp TB1 41 ... sp TB1 vào vector pGEM – T? ?? MỤC TIÊU ĐỀ T? ?I Phân lập t? ??o dòng gene mã hóa chitinase phân lập t? ?? Bacillus sp TB1 vào vector pGEM – T Ý NGHĨA CỦA ĐỀ T? ?I 3.1 Ý nghĩa khoa học K? ?t nghiên cứu đề t? ?i... chitinase vào vector pGEM – T hóa biến nạp vào E.Coli TOP10 Gene mã hóa chitinase sau tinh gắn vào vector pGEM – T t? ??o thành vector t? ?i t? ?? hợp pGEM – T /chitinase biến nạp vào t? ?? bào E Coli TOP10... quy trình phân lập t? ??o dịng gene mã hóa chitinase phân lập t? ?? Bacillus sp TB1 vào vector pGEM – T 3.2 Ý nghĩa thực tiễn K? ?t nghiên cứu sở để t? ??o nguồn nguyên liệu cho t? ??o dòng biểu biểu chitinase