Nghiên cứu phân lập và hoạt tính gây độc đối với nhuyễn thể của loài ốc bưu vàng của hợp chất pseudoginsenoside rt1 methyl ester từ phân đoạn nước của rễ loài aralia armata

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ MINH NGÂN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC ĐỐI VỚI NHUYỄN THỂ CỦA LOÀI ỐC BƢU VÀNG CỦA HỢP CHẤT PSEUDOGINSENOSIDE RT1 METHYL ESTER TỪ PHÂN ĐOẠN NƢỚC CỦA RỄ LOÀI ARALIA ARMATA LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Thúy Vân Đà Nẵng – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Đà Nẵng, ngày tháng năm 2022 Tác giả Lê Thị Minh Ngân LỜI CẢM ƠN Quá trình thực bảo vệ khoá luận tốt nghiệp giai đoạn quan trọng qng đời sinh viên Dƣới góc nhìn sinh viên sƣ phạm đầy nhiệt huyết tuổi trẻ chúng em nhận thấy khoá luận tốt nghiệp tiền đề nhằm trang bị kỹ nghiên cứu, kiến thức chuyên môn chuyên sâu quý báu trƣớc sẵn sàng bƣớc chân vào nghiệp Để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, trƣớc tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Đỗ Thị Thúy Vân tận tình hƣớng dẫn, hỗ trợ giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin cám ơn chị Nguyễn Thị Hồng Chƣơng hỗ trợ bọn em nhiều suốt trình từ ngày lấy mẫu, vƣợt qua bao khó khăn để đến ngày hơm Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo mơn thầy cơng tác khoa Hóa trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng, hỗ trợ kiến thức giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Bƣớc đầu làm quen với việc nghiên cứu nên báo cáo không tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp, bổ sung thầy để em thu nhận thêm nhiều kiến thức kinh nghiệm cho thân sau Cuối em xin chúc quý thầy cô sức khỏe, hạnh phúc thành công sống nhƣ nghiệp giảng dạy Em xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận văn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Aralia armata 1.1.1 Chi Aralia loài Armata 1.1.2 Tên gọi phân loại 1.1.3 Đặc điểm sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Aralia armata nƣớc7 1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Aralia armata giới 1.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học Aralia armata 11 1.4.1 Tác dụng gây độc tế bào 11 1.4.2 Các tác dụng dược lý khác 12 1.4.3 Công dụng dân gian 12 1.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào 13 1.5.1 Phương pháp MTT 14 1.5.2 Phương pháp SRB 14 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 16 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật 16 2.2.2 Phương pháp tách tinh chế chất 16 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 17 2.3 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT 17 2.4 PHÂN LẬP HỢP CHẤT AAR3 TỪ PHÂN ĐOẠN NƢỚC 18 2.5 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO NHUYỄN THỂ ỐC BƢU VÀNG CỦA HỢP CHẤT HÓA HỌC 20 2.5.1 Vật liệu 20 2.5.2 Phƣơng pháp thử tác dụng gây độc tế bào nhuyễn thể 20 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG PHÂN ĐOẠN NƢỚC 21 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO NHUYỄN THỂ CỦA HỢP CHẤT HÓA HỌC 26 NHẬN XÉT VÀ KIẾN NGHỊ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO .28 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CÁC KÍ HIỆU: d : Doublet (NMR) dd : Doublet of doublet (NMR) J(Hz) : Hằng số tƣơng tác (NMR) Rf : Retention factor m : Multiplet (NMR) s : Singlet (NMR) t : Triplet (NMR) ppm : Parts per million (mg/kg) ppb : Parts per billion (µg/kg) δ : Độ chuyển dịch hóa học (NMR) CÁC CHỮ VIẾT TẮT NMR : Nuclear magnetic resonance H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance LC50 : Half maximal inhibitory concentration DMSO : Dimethyl sunfoxide MMT : 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide SRB : Sulforhodamine B UV : Ultraviolet TCA : Trichloroacetic acid CH2Cl2 : Dichloromethane EtOAc : Ethyl acetat MeOH : Methanol EtOH : Ethanol BuOH : Butanol AAR3 : pseudoginsenoside RT1 methyl ester DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Phân loại khoa học Aralia Armata 1.2 Cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học 10 Aralia armata 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất AAR3 hợp chất tham 22 khảo 3.2 Hoạt tính gây độc nhuyễn thể chiết xuất phân đoạn hợp chất AAR3 27 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh A Armata 2.1 Rễ A Armata thô sau đƣợc cắt nhỏ 15 2.2 Rễ A Armata cắt, đem sấy sau đƣợc xay 16 vụn 2.3 Sơ đồ điều chế cao chiết 18 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất AAR3 từ phần cao chiết AA4 rễ 20 A Armata 3.1 Cấu trúc hóa học AAR3 đƣợc phân lập từ Aralia 22 Armata 3.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AAR3 25 3.3 Phổ 13C-NMR hợp chất AAR3 26 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việt Nam quốc gia nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều ánh sáng, lƣợng mƣa lớn, điều tạo nên thảm thực vật phong phú đa dạng dạng giúp ích nhiều việc tìm kiếm loại dƣợc liệu quý Trong có nhiều loại dƣợc liệu quý đƣợc nghiên cứu tìm hiểu xuyên suốt nhiều năm từ xƣa đến Aralia armata số Cây A armata có tên tiếng Việt Đơn châu chấu ngồi cịn có tên gọi khác Đinh lăng gai, Cẩm giảng, Cuồng, …Từ lâu hay đƣợc ngƣời dân sử dụng làm thuốc chữa bệnh nhƣ viêm gan, viêm họng, viêm amygdal, viêm bạch hầu, viêm khớp, viêm thận phù thũng, sƣng vú Hiện hầu hết báo cáo nghiên cứu nƣớc giới liên quan đến A armata tác dụng gây độc tế bào, giúp ích nhiều cho việc nghiên cứu phát triển y học Tuy nhiên bên cạnh tế bào thể ngƣời, tình hình nghiên cứu khả gây độc lồi nhuyễn thể cịn Lồi nhuyễn thể theo Wikipedia ngành phân loại sinh học có đặc điểm nhƣ thể mềm, có vỏ đá vơi che chở nâng đỡ, tùy lối sống mà vỏ cấu tạo thể thay đổi Bên cạnh lợi ích từ chúng mang lại làm thực phẩm cho ngƣời, làm thức ăn cho động vật khác, làm mơi trƣờng nƣớc, ngun liệu xuất chúng cịn mang lại tác hại khơng mong muốn nhƣ vật trung gian truyền bệnh gây hại cho trồng Trong nhuyễn thể ốc bƣu vàng ví dụ điển hình Ốc trƣởng thành cỡ lớn, dạng mập tròn, gồm đầu, thân chân Đầu có hai đơi xúc tu (một đơi dài đôi ngắn) Thân nằm chân, khối xoắn ẩn kín vỏ Tồn thể ốc nằm lớp vỏ Con đực có vảy miệng nhơ gợn sóng, có vảy miệng phẳng lõm xuống Ốc bƣơu vàng thƣờng ẩn nấu dƣới bùn, bờ ao, bờ mƣơng, hồ khó phát Đêm xuống, chúng lên mặt nƣớc cắn ngang thân lúa, ăn trụi thành đám, khiến nhiều diện tích lúa bị chết hoàn toàn Ốc bƣơu vàng loại thức ăn giàu đạm, khoáng sinh tố nên thƣờng dùng làm thức ăn bổ sung, đạm, khoáng sinh tố cho gia cầm ăn thƣờng xuyên Ốc thuộc nhóm thụ tinh trong, thƣờng đẻ trứng vào chiều tối Khi đẻ leo lên giá thể cao mặt nƣớc, trứng bám thành chùm, màu hồng, có khoảng 120 - SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân 500 trứng Trứng nở sau 12 - 15 ngày, nở hết - ngày Tỉ lệ nở khoảng 70%, tỉ lệ sống sau 10 ngày tuổi khoảng 80% Khi thời tiết ấm lên lúc ốc bƣơu vàng sinh sản mạnh Tuổi thọ - năm Trong quần đàn, tỉ lệ đực/cái khoảng 1/4 Tuỳ theo loại thức ăn có đƣợc mà tốc độ sinh trƣởng nhanh, chậm khác Ốc bƣơu vàng ăn thực vật, thức ăn ƣa thích xà lách, bèo tấm, mạ non, rau muống, vv ốc bƣơu vàng đối tƣợng hại lúa hay dƣa hấu, đặc biệt mạ dƣới tuần bị ốc ăn hết toàn Ốc bƣơu vàng giao phối với ốc bƣơu địa, ốc lác Lai tạo hệ ốc có đặc tính khác biệt nhƣ: mài ốc cứng (kế thừa từ ốc địa), cấu trúc vỏ + màu trứng + kích cỡ trứng + đặc điểm sinh sản giống với ốc bƣơu vàng "gốc" Đây nguyên nhân dẫn đến ốc địa dần biến Ốc đƣợc du nhập vào Việt Nam để nuôi làm thực phẩm xuất vào khoảng năm 1988 Sau chúng ngồi tự nhiên gặp điều kiện sinh sống thích hợp nên phát triển thành loài động vật gây hại trầm trọng cho lúa hầu hết tỉnh phía Nam Có thể nói, ốc bƣơu vàng loài động vật gây hại bậc nông nghiệp Việt Nam ốc bƣơu vàng sinh trƣởng chủ yếu vào vụ hè thu, đặc biệt mùa nƣớc Đồng thời hầu hết nghiên cứu A armata phận thân, có nghiên cứu rễ chúng Trong nghiên cứu gần đây, nhà khoa học chứng minh hoạt động diệt nhuyễn thể chất chiết xuất, tinh dầu hợp chất đƣợc phân lập từ nhiều loài thực vật khác Do việc nghiên cứu thành phần hố học rễ A armata để tìm hiểu hoạt chất có tác dụng gây độc tế bào nhuyễn thể, chứng minh cho hoạt tính rễ cơng việc có ý nghĩa khoa học thực tiễn Vì vậy, chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập hoạt tính gây độc nhuyễn thể lồi ốc bưu vàng hợp chất pseudoginsenoside RT1 methyl ester từ phân đoạn nước rễ lồi Aralia armata” nhằm tìm hiểu thành phần hóa học Aralia armata với mục đích đóng góp phần tƣ liệu vào hệ thống cơng trình khoa học loại Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập hợp chất hóa học từ phân đoạn nƣớc - Xác định hoạt tính nhuyễn thể của lồi ốc bƣu vàng hợp chất đƣợc phân lập từ rễ loài Aralia armata Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu Sắc ký lớp mỏng sử dụng mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày 0,2mm Phân lập chất phƣơng pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck silicagel pha đảo RP-18 Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H – NMR, 13C – NMR đo máy Bruker Avance – 500 MHz, chất chuẩn nội TMS cho 1H – NMR tín hiệu dung mơi (CD3OD) cho 13C – NMR Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bƣớc sóng λ = 254nm 365nm dùng để soi mỏng Ngồi cịn dùng số trang thiết bị khác nhƣ máy quay cất chân không, máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, loại pipet, bình định mức, giấy lọc, cột sắc kí, … Thuốc thử phun lên mỏng chủ yếu sử dụng dung dịch H2SO4 10%, sau sấy nhiệt độ khoảng 1100C Dung mơi dùng để chạy cột triển khai sắc kí lớp mỏng bao gồm CH2Cl2, EtOAc, MeOH BuOH loại tinh khiết đƣợc cất lại qua cột Vigereux trƣớc sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật Rót dung mơi tinh khiết (H2O, MeOH) vào bình bề mặt lớp vụn rễ Chiết mẫu nhiệt độ từ 800C – 900C Sau đó, dung dịch chiết đƣợc lọc ngang qua tờ giấy lọc Quá trình chiết đƣợc lặp lại nhiều lần, lần chiết khoảng 24h Gộp dịch chiết, cất loại dung môi dƣới áp suất thấp máy quay cất chân khơng, thu đƣợc cao chiết tổng Có thể gia tăng hiệu chiết cách đảo lộn, xốc hoăc sử dụng máy siêu âm Cao chiết tổng đƣợc chế thêm nƣớc chiết phân lớp lần lƣợt với dichloromethane ethyl acetate phễu chiết Với loại dung môi thực chiết lần Các dịch chiết đƣợc cất loại dung môi thu đƣợc cao chiết tƣơng ứng (cao chiết dichloromethane EtOAc) để tiếp tục nghiên cứu 2.2.2 Phương pháp tách tinh chế chất Các cao chiết dung môi khác thu đƣợc đƣợc tách tinh chế phƣơng pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi thích hợp Sắc kí cột gồm cột sắc kí thƣờng sử dụng silicagel pha thuận pha đảo Đối với chất có khối lƣợng phân tử khác sử dụng sắc kí cột Sephadex LH–18 Trƣờng hợp SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 16 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân cần thiết chạy cột lặp lại nhiều lần dùng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất Kiểm tra độ tinh khiết chất nhƣ theo dõi q trình tách chất cột sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi thích hợp 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Việc xác định cấu trúc hóa học chất đƣợc thực thông qua việc đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều nhƣ 1H–NMR, 13C–NMR so sánh đối chiếu với liệu phổ hợp chất tài liệu tham khảo 2.3 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT Quá trình điều chế loại cao chiết đƣợc mơ tả theo Hình 2.3 Bột rễ Aralia armata (5,0kg) Chiết xuất siêu âm methanol (12 lít × lần 60 phút) Lọc, loại bỏ dung môi chân không Cao methanol (450g) Bổ sung nƣớc cất (2 lít) Chiết phân bố lần lƣợt dichloromethane ethyl acetate Cao dichloromethane Cao ethyl acetate với Phân đoạn nƣớc (AA) Hình 2.3 Sơ đồ điều chế cao chiết từ rễ A armata  Điều chế cao phân đoạn Nguyên liệu rễ Aralia armata sau thu hái, rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khơ đem xay nhỏ đƣợc 5,0 kg bột - Lần 1: Cho 5kg bột nguyên liệu vào bình cầu, cho 12 lít dung dịch methanol, trộn thật kỹ cho ngấm dung môi vào bột nguyên liệu Rồi cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng Sau lọc lấy dịch chiết, đem cất loại dung môi chân khơng đƣợc dịch đặc SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 17 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân - Lần 2: Cho 12 lít dung dịch methanol vào bã nguyên liệu chiết lần 1, trộn thật kỹ cho ngấm dung môi vào bã nguyên liệu Rồi cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng Sau lọc lấy dịch chiết, đem cất loại dung môi chân không đến gần kiệt, thu đƣợc dịch đặc - Lần 3: Cho 12 lít dung dịch vào bã nguyên liệu methanol chiết lần 2, trộn thật kỹ cho ngấm dung môi vào bã nguyên liệu Rồi cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng Sau lọc lấy dịch chiết, đem cất loại dung môi chân không thu đƣợc dịch đặc Dồn dịch đặc sau lần chiết, bổ sung lít nƣớc cất – chất lơ lửng nƣớc cất loại bớt dung môi, phân lớp lần lƣợt với dicloromethane, ethyl acetate để tạo cao dichloromethane, cao ethyl acetat phân đoạn nƣớc 2.4 PHÂN LẬP HỢP CHẤT AAR3 TỪ PHÂN ĐOẠN NƢỚC Phân đoạn nƣớc đƣợc sắc ký cột diaion (HP – 20) sau rửa nƣớc để loại bỏ muối vơ đƣờng đơn Tiếp theo, rửa giải bƣớc dung mơi methanol theo tỉ lệ thể tích Methanol : Nƣớc lần lƣợt nhƣ sau 1:4, 1:1, 3:4 1:0 để tạo bốn phần cao chiết AA1, AA2, AA3, AA4 Sau điều chế xong cao chiết tiến hành sắc ký mỏng (TLC) sắc ký cột để dự đốn tìm chất từ cao chiết Cao chiết AA4 (15 g) đƣợc hòa tan với lƣợng tối thiểu methanol, sau tẩm với 150 g silica gel, cất quay bột tơi khô Tiến hành phân tách hỗn hợp cột silica gel pha thƣờng, rửa giải gradient hệ dung môi dichloromethane/methanol với độ phân cực tăng dần (dichloromethane/methanol, 100:0 → 0:100, v/v) thu đƣợc phân đoạn AA4A (3,5 g), AA4B (5,7g), AA4C AA4D Phân đoạn AA4A (3.5 g) đƣợc phân tách cột C18 pha đảo với hệ dung môi rửa giải methanol/nƣớc (3/3, v/v) thu đƣợc phân đoạn AA4A3 (890 mg), AA4A1, AA4A2 AA4A4 Phân đoạn AA4A3 (890 mg) đƣợc phân tách HPLC với 20% acetonitrile/nƣớc tốc độ dòng chảy mL/phút thu đƣợc hợp chất AAR3 (8,8 mg) Sơ đồ phân lập hợp chất AAR3 (pseudogisenoside RT1 methyl ester) từ cao AA4 đƣợc trình bày Hình 2.4 SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 18 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân Phân đoạn nƣớc (15 g) Sắc ký cột Dianion (HP – 20), rửa nƣớc để loại bỏ muối vô đƣờng đơn Rửa giải bƣớc MeOH/H2O (1/4, 1/1, 3/4, 1/0, v/v) AA4 AA1 AA2, AA3 (15 g) Sắc ký cột Silicagel Rửa giải Diclometan/MeOH (1/0 – 0/1, v/v) AA4A AA4C, AA4D 3,5 (g) AA4B 5,7 (g) Cột sắc ký pha đảo C18 Rửa giải MeOH/nƣớc (3/3, v/v) AA4A3 890 (mg) AA4A1, AA4A2, AA4A4 Sắc ký HPLC Rửa giải với 20% acetonitrile/nƣớc AAR3 8,8 (mg) Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất AAR3 từ phân đoạn nƣớc rễ A armata SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 19 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân 2.5 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO NHUYỄN THỂ ỐC BƢU VÀNG CỦA HỢP CHẤT HÓA HỌC 2.5.1 Vật liệu - Hóa chất: DMSO 1%, nƣớc cất, saponin trà - Mẫu thử: cao chiết chất (AAR3) - Các dòng tế bào thử nghiệm: Trứng ốc bƣu vàng đƣợc lấy từ cánh đồng lúa Huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam (15°55′58″N 108°11′46″E) Trứng ốc đƣợc ấp phịng thí nghiệm nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 70 ± 5% Ốc bƣu vàng nở đƣợc cho ăn rau muống Sau 07 ngày, ốc đạt kích thƣớc 1,0 - 3,0 mm đƣợc sử dụng để làm thí nghiệm 2.5.2 Phƣơng pháp thử tác dụng gây độc tế bào nhuyễn thể Phƣơng pháp thử độ độc tế bào nhuyễn thể đƣợc dựa phƣơng pháp đƣợc mô tả Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 1965) Phép thử đƣợc thực theo quy trình Ding et al [14] Các mẫu đƣợc chuẩn bị cách hịa tan hồn tồn DMSO (dung dịch gốc 1%) Thử nghiệm đƣợc thực dải nồng độ 1,5-200 μg/mL, lặp lại thí nghiệm bốn lần nồng độ Cho mẫu vào cốc 1000 mL có chứa 150 mL nƣớc cất, khuấy thêm 20 ốc vào cốc Các đối chứng tích cực tiêu cực đƣợc sử dụng thử nghiệm lần lƣợt saponin trà DMSO Các thí nghiệm đƣợc tiến hành nhiệt độ 26 ± 20C với chu kỳ quang 12:12h (sáng/tối) Sau 24h, chuyển ốc cần thử vào cốc có mỏ chứa 150 mL nƣớc cất để thu hồi Sau 24 tiếp theo, ốc không hồi phục (bất động, không bám vào thành cốc không phản ứng rút vào vỏ bị vật cùn đẩy nhẹ) đƣợc coi chết Số lƣợng ốc bƣu vàng chết/sống đƣợc ghi nhận Giá trị nồng độ gây chết 50 (LC50) thử nghiệm đƣợc tính tốn thơng qua phân tích log-probit [15] sử dụng SPSS25 với độ tin cậy 95% SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 20 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG PHÂN ĐOẠN NƢỚC Hợp chất AAR3: pseudoginsenoside RT1 methyl ester - Saponin axit oleanolic đƣợc phân lập từ phân đoạn nƣớc rễ A armata phƣơng pháp sắc ký khác bao gồm HPLC - Chất rắn dạng bột, màu trắng - Công thức phân tử: C48H76O18, M = 936 - Trong phân tử có chứa hai gốc đƣờng gốc metyl este axit glucuronic gốc khác gluco đƣợc gắn vị trí đầu cuối - Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 3.1 Hợp chất AAR3 đƣợc phân lập dƣới dạng chất nhựa, khơng màu Hình 3.1 Cấu trúc hóa học AAR3 đƣợc phân lập từ Aralia Armata SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 21 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất AAR3 hợp chất tham khảo [16] C δC#, d δCa, b δHa, c (mult., J, Hz) 39.5 38.6 0.78 (m)/1.36 (m) 27.0 26.4 1.79(m)/2.03 (m) 91.2 89.3 3.32 (dd, 13.5, 5.4) 40.2 39.4 - 57.1 55.7 0.75 (m) 19.3 18.3 1.25 (m)/1.44 (m) 33.9 33.0 1.28 (m)/1.39 (m) 40.7 39.7 - 49.1 47.9 1.54 (m) 10 37.8 36.8 - 11 24.5 23.6 1.81 (m)/1.83 (m) 12 123.7 122.7 5.37 (br s) 13 144.8 144.0 - 14 42.9 42.0 - 15 28.8 28.1 1.12 (m)/2.26 (m) 16 23.9 23.2 1.92 (m)/2.04 (m) 17 48.0 46.9 - 18 42.5 41.6 3.12 (dd, 11.5, 4.5) 19 47.2 46.1 1.20 (m)/1.73 (m) 20 31.5 30.6 - 21 34.8 33.8 1.12 (m)/1.31 (m) 22 33.1 32.4 1.50 (m)/ 1.57 (m) 23 28.2 27.7 1.20 (s) 24 16.5 16.2 1.01 (s) 25 16.0 15.4 0.80 (s) 26 17.7 17.3 1.03 (s) 27 26.4 26.0 1.20 (s) 28 178.0 176.5 - SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 22 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân 29 33.5 33.0 0.86 (s) 30 23.9 23.5 0.83 (s) 1’ 105.5 105.0 4.90 (d, 8.0) 2’ 82.7 82.9 4.12 (dd, 9.0, 8.0) 3’ 77.3 76.3 4.27 (dd, 9.0, 9.0) 4’ 72.9 72.5 4.35 (dd, 9.0, 9.0) 5’ 77.4 76.6 4.45 (d, 9.0) 6’ 171.2 170.3 - OCH3 52.8 52.0 3.69 (s) 1’’ 106.2 106.5 5.20 (d, 7.5) 2’’ 76.2 76.1 4.03 (dd, 9.0, 7.5) 3’’ 77.7 77.8 4.09 (dd, 9.0, 9.0) 4’’ 71.1 70.9 4.24 (m) 5’’ 67.1 67.2 4.30 (m)/3.62 (m) 1’’’ 95.6 95.6 6.30 (d, 8.0) 2’’’ 73.9 73.8 4.14 (dd, 9.0, 8.0) 3’’’ 78.2 78.5 4.22 (dd, 9.0, 9.0) 4’’’ 71.1 70.8 4.16 (dd, 9.0, 9.0) 5’’’ 78.6 79.0 3.97 (m) 6’’’ 62.4 62.0 4.30 (dd, 12.0, 5.0) 3-O-GluA 2′-O-xyl 28-O-glc 4.38 (dd, 12.0, 2.0) # δC Py – d5 [16], ađo CD3OD, b125 MHz, c500 MHz Phổ 1H-NMR (Hình 3.2) AAR3 tín hiệu đặc trƣng bảy nhóm metyl H 1.11 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.89 (3H, s), 0.89 (3H, s), 0.86 (3H, s), 0.79 (3H, s) 0.76 (3H, s), tín hiệu proton nhóm olefinic H 5,19 (1H, t, J = 4.0 Hz), tín hiệu proton gốc đƣờng H 3.0 – 4.6 hai tín hiệu proton anomeric H 4,52 (1H, d, J = 8,0 Hz) 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz) SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 23 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân Hình 4.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AAR3 Phổ 13C-NMR (Hình 3.3) AAR3 tín hiệu nhóm metyl C 16.0, 17.1, 17.8, 24.2, 26.5, 28.6, 33.9 cặp tín hiệu carbon olefinic C 1123,8 145,3 Từ cho thấy AAR3 saponin triterpenoidal loại oleanane Ngoài phổ C-NMR AAR3 cho thấy diện tín hiệu axit glucuronic C 106,7 tín 13 hiệu glucose C 105,3 SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 24 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân Hình 3.3 Phổ 13C-NMR hợp chất AAR3 Từ liệu phổ thu đƣợc kết hợp với liệu phổ hợp chất tham khảo tài liệu [16], hai tín hiệu proton anomeric phổ 1H-NMR AAR3 đƣợc quan sát cho thấy nguyên tố glucuronyl glucosyl đƣợc liên kết cấu hình β C-3 đƣợc chuyển từ trƣờng xuống C 91.3 cho thấy nhóm methine đƣợc oxy hóa C-3, tín hiệu cho C-28 khơng Phổ 1H 13C-NMR AAR3 cho thấy giống với aglycone oleanane-12-ene-28-oic acid đƣợc xác định từ tín hiệu liên kết đơi C-12 (CH)/C-13 (C), axit C-28 este Do đó, cấu trúc AAR3 đƣợc xác định là metyl este RT1 pseudoginsenoside [axit oleanolic 3-O-{βD-glucopyranosyl-(13)-βDglucuronopyranoside} metyl este] (Hình 3.1) SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 25 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO NHUYỄN THỂ CỦA HỢP CHẤT HÓA HỌC Các chiết xuất phân đoạn đƣợc thử nghiệm với khả gây độc nhuyễn thể ốc bƣu vàng Sau thử nghiệm, nhận thấy hoạt động phân đoạn nƣớc tốt Do đó, chúng tơi tiếp tục phân lập kiểm tra hoạt động hợp chất từ phân đoạn nƣớc Chiết xuất phân đoạn hợp chất phân lập đƣợc so sánh với saponin trà - đối chứng tích cực [21] đƣợc trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Hoạt tính gây độc nhuyễn thể chiết xuất phân đoạn hợp chất AAR3 LC50 (µg/mL) STT Hợp chất Phân đoạn diclometan 48.984 (33.962 – 75.925) Phân đoạn EtOAc 40.698 (34.020 – 49.226) Phân đoạn nƣớc 22.571 (15.985 – 31.713) AAR3 16.443 (10.834 – 25.854) Đối chiếu tích cực (Saponin trà) 9.225 (6.069 – 13.882) (Độ xác ~95%) Kết luận: Trong nghiên cứu gần đây, nhà khoa học chứng minh hoạt động diệt nhuyễn thể chất chiết xuất, tinh dầu hợp chất đƣợc phân lập từ lồi thực vật khác Ví dụ, chiết xuất MeOH từ lồi Ipomoea batatas có giá trị LC50 1000 µg/mL (48 giờ) [22] Chiết xuất n-butanol từ lồi Ilex paraguariensis có giá trị LC50 24,75 μg/mL (24 giờ) [23] Tinh dầu từ lồi Lantana camara có hoạt tính chống lại loài ốc sên P channeliculata với giá trị LC50 23,63 μg/mL [24] Một số hợp chất đƣợc phân lập từ vỏ Eucalyptus exserta F Muell thể hoạt tính diệt nhuyễn thể, hợp chất có hoạt tính mạnh yangambin với giá trị LC50 23,70 µg/mL chống lại ốc sên táo vàng (P channeliculata) [25] Các kết cho thấy hoạt tính gây độc nhuyễn thể lồi ốc bƣu vàng chất AAR3 chiết xuất hợp chất từ rễ A armata tốt SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 26 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân NHẬN XÉT VÀ KIẾN NGHỊ  NHẬN XÉT Qua trình nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phân lập hoạt tính gây độc nhuyễn thể loài ốc bƣu vàng hợp chất pseudoginsenoside RT1 methyl ester từ phân đoạn nƣớc rễ loài Aralia armata” thu đƣợc kết nhƣ sau: Từ nguyên liệu ban đầu, phƣơng pháp khác thu đƣợc cao chiết gồm cao dichloromethane, cao ethyl acetate phân đoạn nƣớc Bằng phƣơng pháp sắc ký cột sắc ký mỏng phân lập đƣợc hợp chất tinh khiết AAR3 Đồng thời phân tích số liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân: Phổ 1H-NMR, Phổ 13C-NMR so sánh với tài liệu tham khảo xác định đƣợc cấu trúc hợp chất tinh khiết AAR3 (pseudoginsenoside RT1 ester) Đã đánh giá hoạt tính gây độc nhuyễn thể hợp chất AAR3 (pseudoginsenoside RT1 ester) Kết cho thấy đƣợc hợp chất AAR3 có hoạt tính gây độc nhuyễn thể loài ốc bƣu vàng  KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu có hạn, thông qua kết đề tài mong muốn đề tài đƣợc phát triển rộng số vấn đề nhƣ sau: Nghiên cứu sâu thành phần dịch chiết A armata, phân lập xác định hợp chất hóa học chƣa định danh A armata Tiếp tục thử hoạt tính sinh học dịch chiết cịn lại A armata nghiên cứu phận khác A armata nhƣ: thân, Các kết nghiên cứu sở để tạo chế phẩm có hoạt tính gây độc tế bào nhuyễn thể, góp phần vào việc nghiên cứu loại thuốc diệt loài nhuyễn thể gây hại từ phân đoạn nƣớc A armata, loại phổ biến vùng ven rừng huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 27 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Phạm Thị Hồng Minh cộng (2016) “Nghiên cứu thành phần hoá học Đơn châu chấu Aralia armata (Wall.) Seem Họ Ngũ gia bì – Araliacea” [2] Nguyễn Mạnh Tuyển, Phƣơng Thiện Thƣơng (2013) “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học số tác dụng sinh học Đơn châu chấu” [3] Đỗ Thị Thuý Vân cộng (2021) “Aramatosides C and D, Previously Undescribed Triterpene Glycosides Isolated From the Roots of Aralia armata” [4] Nguyễn Thị Hồng Chƣơng cộng (2020) “Oleanane-type triterpene saponins from Aralia armata leaves and their cytotoxic activity” Tiếng Anh [5] Li Jinghua (1997) “Determination of amino acids and trace elements in Aralia armata (Wall.) Seem”, Journal of Pharmaceutical Practice, pp 30-31 [6] Zhi-Yong Jiang, Chun-Tao Yang, Shu-Qun Hou, Kai Tian, Wei Wang, Qiu-Fen Hu, Xiang-Zhong Huang (2016) “Cytotoxic Diterpenoids from the Roots of Aralia melanocarpa” [7] Miao, H.; Sun, Y.; Yuan, Y.; Zhao, H.; Wu, J.; Zhang, W.; Zhou, L., “Herbicidal and Cytotoxic Constituents from Aralia armata (Wall.) Seem”, Chemistry & Biodiversity, 13, 2016, pp 437-444 [8] Hu, M.; Ogawa, K.; Sashida, Y.; Pei-Gen, X., “Triterpenoid glucuronide saponins from root bark of Aralia armata”, Phytochemistry, 39, 1995, pp 179-184 [9] Yen, P.H.; Chuong, N.T.H.; Lien, G.T.K.; Cuc, N.T.; Nhiem, N.X.; Thanh, N.T.V.; Tai, B.H.; Seo, Y.; Namkung, W.; Park, S.; et al., “Oleanane-type triterpene saponins from Aralia armata leaves and their cytotoxic activity”, Natural Product Research, 2020, pp 1-8 [10] Yen, P.H.; Cuc, N.T.; Huong, P.T.T.; Nhiem, N.X.; Hong Chuong, N.T.; Lien, G.T.K.; Huu Tai, B.; Tuyen, N.V.; Van Minh, C.; Van Kiem, P., “Araliaarmoside: A New Triterpene Glycoside Isolated From the Leaves of Aralia armata”, Natural Product Communications, 15, 2020, 1934578X20953300 SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 28 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân [11] Trang, D.; Nhiem, N.; Ha, D.; Anh, H.; Thu, T.; Yen, P.; Tho, P.; Minh, C.; Kiem, P., “Oleanane saponins from the leaves of Aralia armata (Wall) Seem”, Vietnamese J Med Mater, 1, 2015, pp 12-17 [12] Kiem, P.V.; Nhiem, N.X.; Anh, N.H.; Yen, D.T.H.; Cuong, N.T.; Tai, B.H.; Yen, P.H.; Nam, N.H.; Minh, C.V.; Chinh, P.T.; etal., “Enantiomeric chromene derivatives with anticancer effects from Mallotus apelta”, Bioorganic Chemistry, 104, 2020, 104268 [13] Kiem, P.V.; Yen, D.T.; Hung, N.V.; Nhiem, N.X.; Tai, B.H.; Trang, D.T.; Yen, P.H.; Ngoc, T.M.; Minh, C.V.; Park, S.; et al., “Five New Pregnane Glycosides from Gymnema sylvestre and Their α-Glucosidase and α-Amylase Inhibitory Activities”, Molecules, 25, 2020 [14] Ding, W.; Huang, R.; Zhou, Z.; He, H.; Li, Y., “Ambrosia artemisiifolia as a potential resource for management of golden apple snails, Pomacea canaliculata (Lamarck)”, Pest Management Science, 74, 2018, pp 944-949 [15] Finney, D., Probit analysis, Reissue ed., 2009 [16] Liang, C.; Ding, Y.; Nguyen, H.T.; Kim, J.-A.; Boo, H.-J.; Kang, H.-K.; Nguyen, M.C.; Kim, Y.H., “Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20, 2010, pp 7110-7115 [17] Zou, M.-L.; Mao, S.-L.; Sang, S.-M.; Xia, Z.-H.; Lao, A.-N., “Two New Triterpenoid Saponins from Aralia subcapitata”, Natural Product Letters, 15, 2001, pp 157-161 [18] Miyase, T.; Sutoh, N.; Zhang, D.M.; Ueno, A., “Araliasaponins XII-XVIII, triterpene saponins from the roots of Aralia chinensis”, Phytochemistry, 42, 1996, pp 1123-1130 [19] Shao, C.-J.; Kasai, R.; Xu, J.-D.; Tanaka, O., “Saponins from roots of Kalopanax septemlobus (THUNB.)KOIDZ., Ciqiu: Structures of kalopanax-saponins C, D, E and F”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 37, 1989, pp 311-314 [20] Fujioka, N.; Kohda, H.; Yamasaki, K.; Kasai, R.; Shoyama, Y.; Nishioka, I., “Dammarane and oleanane saponins from callus tissue of Panax japonicus”, Phytochemistry, 28, 1989, pp 1855-1858 SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 29 GVHD: TS Đỗ Thị Thúy Vân [21] Jia, T.-W.; Wang, W.; Sun, L.-P.; Lv, S.; Yang, K.; Zhang, N.-M.; Huang, X.B.; Liu, J.-B.; Liu, H.-C.; Liu, R.-H.; et al., “Molluscicidal effectiveness of Luo-Wei, a novel plant-derived molluscicide, against Oncomelania hupensis, Biomphalaria alexandrina and Bulinus truncatus”, Infectious Diseases of Poverty, 8, 2019 [22] A.A, N.; A, N.; S, S., “Molluscicidal activity of Ipomoea batatas leaf extracts against Pomacea canaliculata (Golden apple snail)”, Food Research, 4, 2020, pp 131137, doi:10.26656/fr.2017.4(S5).003 [23] Brito, F.C.d.; Gosmann, G.; Oliveira, G.T., “Extracts of the unripe fruit of Ilex paraguariensis as a potential chemical control against the golden apple snail Pomacea canaliculata (Gastropoda, Ampullariidae)”, Natural Product Research, 33, 2019, pp 2379-2382, doi:10.1080/14786419.2018.1443084 [24] Huy Hung, N.; Ngoc Dai, D.; Satyal, P.; Thi Huong, L.; Thi Chinh, B.; Quang Hung, D.; Anh Tai, T.; Setzer, W.N., “Lantana camara Essential Oils from Vietnam: Chemical Composition, Molluscicidal, and Mosquito Larvicidal Activity”, Chemistry & Biodiversity, 18, 2021, e2100145, doi:https://doi.org/10.1002/cbdv.202100145 [25] Li, J.; Xu, H., “Bioactive compounds from the bark of Eucalyptus exserta F Muell”, Industrial Crops and Products, 40, 2012, pp 302-306, doi:https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2012.03.032 [26] Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Kenneth D.P., Monks A., Tierney S., Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D., Boyd M.R (1988) Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines Cancer Reseach, 48: 4827 – 4833 [27] Viện Dƣợc liệu- Bộ Y tế (2006) Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng dƣợc lý thuốc từ dƣợc thảo, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật- Hà Nội SVTH: Lê Thị Minh Ngân – Lớp 18SHH Trang 30 ... tiêu nghiên cứu - Phân lập hợp chất hóa học từ phân đoạn nƣớc - Xác định hoạt tính nhuyễn thể của lồi ốc bƣu vàng hợp chất đƣợc phân lập từ rễ loài Aralia armata Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu SVTH:... tế bào nhuyễn thể, chứng minh cho hoạt tính rễ cơng việc có ý nghĩa khoa học thực tiễn Vì vậy, tơi chọn đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập hoạt tính gây độc nhuyễn thể lồi ốc bưu vàng hợp chất pseudoginsenoside. .. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO NHUYỄN THỂ CỦA HỢP CHẤT HÓA HỌC Các chiết xuất phân đoạn đƣợc thử nghiệm với khả gây độc nhuyễn thể ốc bƣu vàng Sau thử nghiệm, nhận thấy hoạt động phân đoạn nƣớc