Luận án nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển acanthaster planci

1 MỞ ĐẦU Bề mặt trái đất có đến 70% diện tích biển Đại dương, nơi chứa đựng nguồn tài nguyên sinh vật biển vô đa dạng phong phú với hàng trăm ngàn loài thực vật, động vật vi sinh vật khác Với đa dạng này, nguồn lợi mang lại từ biển vô dồi quý báu, cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chủ lực, chế biến hải sản, hóa mỹ phẩm, dược phẩm nhiều nhóm ngành khác Tuy nhiên, trước đây, giá trị mang lại từ nguồn lợi biển chủ yếu cho ngành chế biến thực phẩm, đó, giá trị cung cấp nguồn dược liệu ứng dụng cho y học dược học hạn chế Ngày nay, giá trị dược, y học tài nguyên biển ngày quan tâm nghiên cứu, ưu tiên phát triển Đã có nhiều hợp chất từ sinh vật biển phân lập, xác định cấu trúc thử nghiệm hoạt tính sinh học Trong đó, có hợp chất thể hoạt tính sinh học phong phú, cung cấp hình mẫu cho hệ thuốc Đồng thời, tìm hoạt chất từ sinh vật biển cịn có đóng góp vơ quan trọng lĩnh vực tổng hợp bán tổng hợp hữu Trên mô hình hoạt chất phân lập nghiên cứu tổng hợp lượng lớn hoạt chất từ nguyên liệu đầu phổ biến chuyển hóa dẫn xuất chúng để đánh giá chi tiết, tối ưu hệ thuốc có cấu trúc tương tự (analogous) [1-4] Việt Nam có dải bờ biển 3.260 km, diện tích triệu km2, với khí hậu nhiệt đới gió mùa điều kiện lý tưởng cho hệ sinh thái biển đa dạng chủng loại giàu trữ lượng Cho đến nay, xác định danh mục gần 12.000 loài sinh vật biển Việt Nam bao gồm động vật thực vật [5] Từ năm 1970, có vài cơng trình nghiên cứu hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển Những năm gần đây, với mục tiêu nghiên cứu thăm dò nguồn dược liệu quý từ sinh vật biển, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi sinh vật biển tiến hành nghiên cứu Tuy nhiên, so với nguồn tiềm sinh vật biển nước ta đến cơng trình nghiên cứu chưa đánh giá cách đầy đủ, toàn diện nguồn tài nguyên này, đặc biệt sinh vật thuộc ngành Da gai Ngành Da gai (Echinodermata), ngành động vật biển bao gồm năm lớp: Sao Biển (Asteroidea), Đuôi Rắn (Ophiuroidea), Cầu Gai (Echinoidea), Hải Sâm (Holothuria) Huệ Biển (Crinoidea), nguồn cung cấp dồi steroid phân cực Lớp chất có cấu trúc đa dạng có phổ sinh học rộng, chúng thể nhiều hoạt tính như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư, chống virus Steroid phân cực từ biển thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Ở Việt Nam, có số cơng trình nghiên cứu lớp chất này, nhiên nghiên cứu hạn chế việc phân lập đánh giá hoạt tính hợp chất Chưa có cơng trình nghiên cứu tổng thể vào nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học đánh giá hoạt tính sinh học steroid phân lập từ biển Với mục đích tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển thuộc ngành Da gai, chuyển hóa thành dẫn xuất polyhydroxysteroid hydroxyminosteroid từ steroid phổ biến sinh vật biển nhằm đóng góp sở nghiên cứu cho nghiên cứu lĩnh vực phát triển dược phẩm, luận án tập trung nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học đánh giá hoạt tính sinh học steroid từ loài biển phổ biến vùng biển Việt Nam Đối tượng tập trung nghiên cứu loài biển Acanthaster planci, loài biển đe dọa đến tồn rạn san hô chúng ăn mầm san hô sống Chính luận án: “Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa đánh giá tác dụng sinh học steroid từ loài biển Acanthaster planci” thực với nội dung sau:  Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ loài biển Acanthaster planci, đặc biệt steroid  Chuyển hóa dẫn xuất theo định hướng hydroxyl hóa oxime hóa từ steroid có hàm lượng lớn biển Acanthaster planci  Thử nghiệm số hoạt tính sinh học hợp chất phân lập tổng hợp CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung biển (Asteroidea) Sao biển lồi động vật khơng xương sống, thuộc ngành Da gai (Echinodermata), lớp Asteroidea Sao biển phân bố rộng khắp Đại dương, tập trung nhiều khu vực Bắc Thái Bình Dương Chúng sống đáy biển, thích nghi với khu vực đáy có cát, bùn cát, đá nhỏ khu vực có rạn san hơ Cơ thể biển dẹp theo chiều lưng bụng có đối xứng tỏa tròn bậc năm, gồm đĩa trung tâm có hay nhiều cánh (có thể lên tới 45 cánh) xếp xung quanh Cánh biển lồi có độ dài ngắn tương đối khác Lỗ miệng có màu sặc sỡ, bị bề mặt giá miệng hướng phía dưới, hậu mơn phía đối diện Bên quanh miệng vịng ống nước, từ phát ống nước nhánh hình nan quạt tỏa đến tận đỉnh cánh Bao bên ngồi ống nước nhánh có hai dãy chân ống Sao biển khơng có đầu việc di chuyển thực nhờ hoạt động nhịp nhàng hai hàng chân ống nằm phía cánh Tốc độ di chuyển biển chậm từ đến 10 cm phút, chúng nhạy cảm với ánh sáng độ mặn nước biển [6] Theo Blacke (1987), lớp Asteroidea chia thành (order) bao gồm: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida Velatida Đến người ta thống kê có khoảng 1900 lồi biển, nhóm vào 370 chi phân bố tất Đại dương giới [7] Những nơi có nhiều biển phải kể đến vùng biển Australia, Đơng Thái Bình Dương Bắc Mỹ, đặc biệt vùng biển nhiệt đới Ấn Độ - Thái Bình Dương nơi tập trung đại đa số lồi biển [6, 8] Ở Việt Nam có khoảng 78 loài biển khác nhau, phân bố dọc bờ biển từ Bắc đến Nam Loài biển Acanthaster planci thuộc chi Acanthaster, họ Acanthasteridae Valvatida Theo Mah Hansson (2013), có 17 họ (Acanthasteridae, Archasteridae, Asterinidae, Asterodiscididae, Asteropseidae, Chaetasteridae, Ganeriidae, Goniasteridae, Leilasteridae, Mithrodiidae, Odontasteridae, Ophidiasteridae, Oreasteridae, Podosphaerasteridae, Poraniidae, Solasteridae, Sphaerasteridae), 165 chi với khoảng 695 loài Theo Đăng ký giới loài sinh vật biển (World Register of Marine Species), chi Acanthaster có lồi Acanthaster planci (Linnaeus, 1758) Acanthaster brevispinus (Fisher, 1917) Cho đến nay, theo thống kê tác giả Guang Dong cs [9] giai đoạn từ năm 1977-2007 có khoảng 98 lồi biển nghiên cứu thành phần hóa học Các hợp chất phân lập từ loài biển chủ yếu hợp chất thuộc lớp chất steroid hợp chất ceramide Ngoài ra, biển chứa số lớp chất khác như: carotenoid, nucleoside, alkaloid, acid béo, peptide Trong đó, hợp chất steroid hợp chất chuyển hóa thứ cấp biển Hiện nay, có 800 hợp chất steroid phân cực phân lập từ loài biển khác nhau, đa dạng cấu trúc hợp chất dường vô tận [10] Trong số loài biển nghiên cứu, có số lồi quan tâm nghiên cứu chi tiết loài Asterina pectinifera, Culcita novaeguineae, Certonardoa semiregularis Linckia laevigata 1.2 Các nghiên cứu lớp chất steroid phân cực từ loài biển Lớp chất steroid từ biển, đặc biệt steroid phân cực, thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu nhà khoa học giới hoạt tính thú vị chúng như: hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư, chống virus, kháng viêm, giảm đau, tán huyết… Dựa vào cấu trúc hóa học steroid phân lập từ tự nhiên chia chúng thành nhóm chất sau: polyhydroxysteroid, steroid sulfate, steroid glycoside [11] 1.2.1 Polyhydroxysteroid Các polydydroxysteroid từ biển hợp chất có chứa từ đến nhóm hydroxyl (-OH) phần nhân tetracyclic steroid chúng phần mạch nhánh liên kết với nhân steroid vị trí C-17 Điều đặc biệt, nhóm –OH thường tìm thấy số vị trí xác định Chúng thường có mặt vị trí 3β, 6(α β), 8β, 15(α β) 16β nhân steroid Đơi nhóm –OH tìm thấy vị trí 4β, 5α, 7(α β), tìm thấy vị trí 14α Phần mạch nhánh hợp chất đa dạng, nhiên phần lớn hợp chất polyhydroxysteroid có phần mạch nhánh cholestane với nhóm –OH thường tìm thấy vị trí C-24 C-26 (C-28 C-29 loại mạch nhánh giống ergostane stigmastane) [11] Các penta- hexaol thường chiếm ưu polyhydroxysteroid Điển hình cho nhóm chất này, từ lồi biển Certonardoa semiregularis thu thập gần đảo Komun, Hàn Quốc, nhà khoa học Hàn Quốc phân lập 36 hợp chất polyhydroxysteroid (1-36) với đa dạng cấu trúc mạch nhánh vị trí nhóm hydroxyl [12-17] Từ lồi biển Asterina pectinifera, năm 2010, nhóm nhà khoa học Trung Quốc phân lập hợp chất polyhydroxysteroid (37-40), có hợp chất polyhydroxysteroid ester lần đầu phân lập tự nhiên (25S)-5α-cholestane3β,6α,7α,8,15α,16β-hexahydroxyl-26-O-14’Z-eicosenoate (37) [18] Từ loài biển Archaster typicus thu thập vùng biển Việt Nam, nhóm nghiên cứu Ivanchina cs phân lập hợp chất polyhydroxysteroid (41, 42) có nhóm -OH vị trí gặp 14α [19] Một loạt dẫn xuất polyhydroxysteroid phân lập từ loài biển khác cho thấy lượng lớn hợp chất tự nhiên có cấu trúc đa dạng có mặt lớp biển Asteroidea tầm quan trọng hợp chất tồn biển 1.2.2 Steroid sulfate Các hợp chất tự nhiên có nhóm sulfate phân bố rộng rãi động vật biển, đặc biệt sinh vật ngành Da gai Trong năm lớp ngành Da gai, người ta tìm hợp chất monosulfate, chứng minh hợp chất thứ cấp phổ biến biển Các hợp chất steroid sulfate khơng tìm thấy dạng hợp chất steroid tự mà cịn tìm thấy dạng sulfate hóa hợp chất steroid glycoside Nhóm sulfate tìm thấy vị trí C-3 C-15 hệ đa vịng nhân steroid; phần mạch nhánh đơn vị monosaccharide Từ loài biển Asterina pectinifera, Yan Peng cs phân lập chất 43 polyhydroxysteroid glycoside (44) có mặt nhóm sulfate đơn vị đường [18] Từ loài biển Lethasterias fusca, Ivanchina cs phân lập steroid glycoside sulfate, fuscaside A (45), có nhóm sulfate vị trí 15α hai đơn vị monosaccharide liên kết hai phần khác nhân steroid; hợp chất natri 24,25-dihydromarthasterone-3-sulfate (46) [20] Từ loài biển Mithrodia clavigera, Levina cs phân lập ba hợp chất steroid sulfate (47-49) Hợp chất 47, 48 có nhóm sulfate vị trí C-3 nhóm α-OH vị trí C-6 Trước đây, hợp chất cho sản phẩm thu sau thủy phân asterosaponin không tồn dạng tự Tuy nhiên sau chúng chứng minh tồn dạng tự thành phần hóa học biển Hợp chất 49 có nhóm sulfate vị trí 15α [21] Gần đây, năm 2015, từ loài biển Leptasterias ochotensis, Timofey cs phân lập hợp chất steroid sulfate phân cực [22] Trong bao gồm monoglycoside steroid sulfate (50-52) polyhydroxysteroid sulfate (53) Từ kết nghiên cứu cho thấy, sulfate hóa định hướng đặc trưng biến đổi sinh hóa biển Các hợp chất steroid bị sulfate hóa số vị trí khác hệ thống đa vòng và/hoặc mạnh nhánh hay chí chuỗi saccharide 1.2.3 Steroid glycoside Các hợp chất steroid glycoside sản phẩm chuyển hóa bật biển, chúng chịu trách nhiệm chức gây độc tính chúng [7] Dựa cấu trúc hóa học chúng, chia thành ba nhóm chất: polyhydroxysteroid glycoside, asterosaponin, cyclic steroid glycoside [23] Thông thường, đơn vị đường chuỗi carbohydrate có dạng pentose (arabinose, xylose, dẫn xuất methyl chúng); hexose (glucose, galactose); có nhóm sulfate [10] Cấu trúc đơn vị đường thường gặp loài biển thống kê bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số đơn vị đường thường gặp loài biển HO HO O O OH β-D-Glucose (Glc) β-D-Fucose (Fuc) 6-Deoxy-xylo-hex-4-ulose (DXHU) β-D-Galactose (Gal) β-D-Xylopyranose (Xyl) β-D-Quinovose (Qui) α-L-Arabinopyranose (Ara) D-Glucuronic acid (Glucur) β-D-Galactofuranose (Galf) β-D-Fucofuranose (Fucf) 1.2.3.1 β-D-Xylofuranose (Xylf) α-L-Arabinofuranose (Araf) Polyhydroxysteroid glycoside Các polyhydroxysteroid glycoside chất chuyển hóa thứ cấp đặc trưng thành phần biển Cấu trúc glycoside gồm hai phần: phần aglycon polyhydroxysteroid; phần chuỗi carbohydrate thường 1, đơn vị đường (hiếm gặp đơn vị đường) gắn vào hệ đa vòng phần mạch nhánh nhân steroid, hay chí vào hệ đa vòng phần mạch nhánh Các đơn vị monosaccharide dạng pentose, hexose dạng sulfate chúng [10] Những năm gần đây, có nhiều hợp chất polyhydroxysteroid glycoside phân lập Đa phần số mono-, diglycoside polyhydroxysteroid Tuy nhiên hợp chất gặp steroid triglycoside công bố phân lập từ số lồi biển, với số lượng khơng nhiều Từ năm 2008 đến nay, ba loài biển thuộc chi Anthenea nghiên cứu thành phần hóa học lớp chất steroid phân cực, có 32 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside phân lập Các hợp chất có phần glycoside chủ yếu mono-, diglycoside; đơn vị glycoside liên kết với khung steroid vị trí C-16 vị trí C-7 C-16 Đầu tiên nghiên cứu Ning Ma cs, năm 2009-2010, phân lập từ loài Anthenea chinensis 11 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside anthenoside A-K (54-64) Đơn vị monosaccharide anthenoside A (54) vị trí C-2 bị nhóm acetamid [24, 25] Đặc biệt, tất hợp chất 55-62 có mặt chuỗi carbohydrate có dạng 6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl-(1→3)-(6-O-methyl-β-Dgalactofuranose) gắn vị trí C-16 Hợp chất với chuỗi hai đơn vị đường chưa bắt gặp trước đó, lần hợp chất phân lập từ loài Anthenea chinensis [25] Tất hợp chất có liên kết đơi vị trí C8/C14 Từ lồi biển Anthenea aspera, Timofey cs phân lập 17 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside anthenoside L-U (65-74) [26], anthenoside V-X (75-77) anthenoside A1, A2 (78, 79) [27, 28] Chất 75 có cấu trúc nhân steroid dạng 5α-cholest-8(14)-ene-3α,7β,16α-hydroxysteroid Phân tử đường có dạng 2acetamido-2-deoxy-4-O-methyl-β-D-glucopyranosyl chất 78 79 lần tìm thấy steroid glycoside biển [28] 10 Từ loài biển Anthenea sibogae thu tập vùng biển Việt Nam, Timofey phân lập hợp chất polyhydroxysteroid glycoside anthenoside S1-S6 (80-85) Tất hợp chất có nhân steroid dạng 5α-cholest-8(14)-ene3α,6β,7β,16α-tetrahydroxysteroid; gắn với chuỗi carbohydrate vị trí C-7 C16 (80-83, 85) vị trí C-16 (84) Đơn vị đường dạng 4-O-methyl-β-Dglucopyranose (81) dạng mạch nhánh Δ24-cholestane (82) chưa tìm thấy trước steroid glycoside biển [29] Hình PL102: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 27c 259 Hình PL103: Phổ HSQC hợp chất 27c 260 Hình PL104: Phổ (+) ESI-MS hợp chất 27c 261 Hình PL105: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 28c 262 Hình PL106: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 28c 263 Hình PL107: Phổ (+) ESI-MS hợp chất 28c 264 Hình PL108: Phổ 1H NMR hợp chất 29c 265 Hình PL109: Phổ 13C NMR hợp chất 29c 266 Hình PL110: Phổ (+) HR ESI-MS hợp chất 29c 267 Hình PL111: Phổ 1H NMR hợp chất 30c 268 Hình PL112: Phổ 13C NMR hợp chất 30c 269 Hình PL113: Phổ (+) HR ESI-MS hợp chất 30c 270 Hình PL114: Phổ 1H NMR hợp chất 31c 271 Hình PL115: Phổ 13C NMR hợp chất 31c 272 Hình PL116: Phổ (+) HR ESI-MS hợp chất 31c 273 ... ? ?Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa đánh giá tác dụng sinh học steroid từ loài biển Acanthaster planci” thực với nội dung sau:  Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lồi biển Acanthaster. .. từ steroid phổ biến sinh vật biển nhằm đóng góp sở nghiên cứu cho nghiên cứu lĩnh vực phát triển dược phẩm, luận án tập trung nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học đánh giá hoạt tính sinh học. .. trình nghiên cứu lớp chất này, nhiên nghiên cứu hạn chế việc phân lập đánh giá hoạt tính hợp chất Chưa có cơng trình nghiên cứu tổng thể vào nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học đánh giá hoạt