2.3.3.1. Phân lập gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế bằng phản ứng PCR
Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện sử dụng 40 ng DNA khuôn mẫu, 10 µL Enzyme MyTaq Mix (Bioline – UK), 10 pmol mồi FChi1Kb2, 10 pmol mồi RChi1Kb2 trong thể tích 20 µL. Chu trình phản ứng PCR được thực hiện như sau: biến tính 95o
C trong 5 phút; 30 chu kỳ: 95℃ trong 20 giây, 55℃ trong 30 giây, và 72℃ trong 1 phút 10 giây; cuối cùng là 72℃ trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, đệm TBE 1X, điện áp 100 V trong 30 phút.
2.3.3.2. Tinh sạch gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế
Sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 1%, tinh sạch bằng GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm tinh sạch được tiến hành điện di và kiểm tra độ tinh sạch trên gel agarose 1 %, đệm TBE 1X, điện áp 100V trong thời gian 30 phút.
Kiểm tra tế bào khả biến bằng cách sử dụng plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy/Chitinase (được cung cấp bởi phòng Sinh học phân tử, Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, gene mã hóa chitinase có kích thước 2025bp) được biến nạp vào tế bào E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42℃ trong 55 giây (Sambrook and Russell, 2001).
2.3.3.4. Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T và hóa biến nạp vào E.Coli TOP10.
Sản phẩm tinh sạch gene chitinase với kích thước khoảng 1 Kb được gắn vào vector pGEM – T (Promega, Mỹ) với thành phần phản ứng bao gồm: 3 µL 2X Rapid Ligation Buffer, 1.5 µL T4 DNA ligase (3 u/mL), 1 µL vector pGEM – T (50 ng), 1 µL sản phẩm PCR gene chitinase tinh sạch (50 ng), thêm nước cất vô trùng đến thể tích cuối cùng là 10 µL. Tất cả các thao tác được thực hiện trên đá. Hỗn hợp được trộn đều và ủ ở 20℃ qua đêm. Vector pGEM – T mang đoạn chèn được biến nạp vào tế bào E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42℃ trong 55 giây (Sambrook and Russell, 2001).
Thể tái tố hợp E. coli TOP10 được chọn lọc bằng cấy chuyển trên đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh 50 µg/mL ampicillin nuôi cấy 37℃ trong khoảng 16 giờ.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. TB1 và đọc trình tự gene 3.1.1. Tách chiết DNA tổng số
Sinh khối chủng vi khuẩn Bacillus sp. TB1 được thu hoạch sau 18 giờ nuôi cấy để tách chiết DNA tổng số, kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 1% được trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. DNA tổng số của chủng Bacillus sp.TB1
L: HyperLadder 1kb, 1: DNA tổng số của chủng Bacillus sp. TB1
Kết quả kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ chủng Bacillus sp. TB1 cho thấy DNA có chất lượng tốt, nồng độ cao và ít bị đứt gãy, có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp.
3.1.2. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế cho gene chitinase và tiến hành phản ứng PCR
Gene chitinase của chủng vi khuẩn Bacillus sp.TB1 được khuếch đại sử dụng cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự gene chitinase của vi khuẩn B. subtilis HDZK-BYSB7 (mã số: CP026608). Kết quả được trình bày ở Hình 3.2.
DNA tổng số tách chiết từ chủng TB1 được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR gene mã hóa chitinase, kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cho thấy đã khuếch đại thành công gene mã hóa chitinase từ DNA tổng số của chủng Bacillus sp. TB1 có kích
Hình 3.2. Sản phẩm khuếch đại PCR gene chitinase
L: HyperLadder 1kb, 1: sản phẩm PCR gene mã hóa chitinase.
Sau khi khuếch đại PCR thành công gene mã hóa chitinase, tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.3.) và gửi giải trình tự tại công ty Fist base (Malaysia).
Hình 3.3. Sản phẩm tinh sạch gene mã hóa chitinase dùng gửi đi đọc trình tự
3.1.3. Kết quả giải trình tự gene chitinase
Kết quả giải trình tự nucleotide gene mã hóa chitinase tại công ty Fist base cho thấy, đoạn gene thu được có kích thước 1083 bp. Phân tích trình tự gene chitinase của chủng
Bacillus sp. TB1 chứa khung đọc mở gồm 1083 nucleotide mã hóa cho một protein gồm 360 amino acid (Hình 3.4.) với trọng lượng phân tử khoảng 37 kDa:
Hình 3.4. Khung đọc mở
Trình tự amino acid suy diễn gene chitinase của chủng Bacillus sp. TB1 bằng công cụ ORFfinder – NCBI, ta có trình tự sau:
Hình 3.5. Trình tự amino acid suy diễn gene mã hóa chitinase của chủng Bacillus
Phân tích cấu trúc dự đoán của protein suy diễn từ gene mã hóa chitinase từ chủng
Bacillus sp. TB1 bằng công cụ SWISS – MODEL, mô hình cấu trúc không gian chitinase được xây dựng dựa trên mô hình cấu trúc của chitinase từ Bacillus cereus.. Cấu trúc phiến β được trình bày bằng mũi tên dạng lát mỏng, cấu trúc cuộn xoắn α được trình bằng bằng hình lát mỏng dạng cuộn (Hình 3.6.):
Hình 3.6: Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của chitinase 3.2. Thiết kế mồi với hai đầu chứa trình tự chứa trình tự enzyme cắt hạn chế
Các tổ hợp của enzyme có thể được sử dụng tùy thuộc vào các vị trí nhận biết (RS – Recognition sites) trong vector và của đoạn DNA ngoại lai.
Dựa vào kết quả giải trình tự gene, thông qua phần mềm NEBcutter V2.0 xác định bản đồ enzyme cắt hạn chế của gene ở Hình 3.7.
Và vector lựa chọn biểu hiện gene (vector pQE30).
Hình 3.8. Vector pQE30
Từ kết quả bản đồ các enzyme cắt hạn chế của gene và các enzyme cắt hạn chế của vector pQE30, mồi được thiết kế dựa trên trình tự gene chitinase của vi khuẩn Bacillus subtilis HDZK-BYSB7 (mã số: CP026608) với hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế được lựa chọn là BamHI và HindIII. Trình tự mồi được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Trình tự mồi được dùng để khuếch đại gene chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế
Mồi Trình tự
FChi1Kb2 5’-GGATCCGC AAACAATTTAGGATCAAA-3’ RChi1Kb2 5’-AAGCTTTTATTTTTGCAAGGGGATCG-3’ GGATCC: BamHI
Hầu hết các plasmid vector mang hai hoặc nhiều vị trí nhận biết enzyme hạn chế, ví dụ: vector pBR 322 chứa các vị trí nhận biết đơn HindIII và BamHI sau khi cắt bằng hai enzyme hạn chế tương ứng, đoạn DNA plasmid lớn hơn có thể được tinh sạch bằng điện di agarose gel và gắn với một đoạn DNA ngoại lai mang các đầu kết dính tương đồng với nó cũng được cắt bởi HindIII và BamHI. Kết quả, thể tái tổ hợp dạng vòng mang tính kháng Amp sau đó được dùng để biến nạp vào E.Coli. Do thiếu sự bổ trợ giữa các đầu lồi HindIII và BamHI nên đoạn vector lớn hơn không thể tái tạo vòng một cách hiệu quả được vì thế nó biến nạp vào E.Coli rất kém (Nguyễn Hoàng Lộc và cs, 2007).
3.3. Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGRM – T
3.3.1. Phân lập gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự cắt hạn chế
Kết quả khuếch đại PCR thành công gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự hạn chế (Hình 3.9.)
Hình 3.9. Khuếch đại PCR gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế
L: HyperLadder 1kb, 1: sản phẩm PCR gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế
Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch gene mã hóa chitinase trên gel agarose 1% được trình bày ở Hình 3.10.
Hình 3.10. Tinh sạch gene chitinase
L: HyperLadder 1kb, 1: gene mã hóa chitinase đã tinh sạch
Kết quả điện di cho thấy quá trình tinh sạch được thực hiện thành công, băng rõ, ít bẩn, nồng độ ước tính khoảng 50ng/µL, kích thước band khoảng 1 Kb. Gene mã hóa chitinase sau khi được tinh sạch được sử dụng để thực hiện phản ứng gắn vào vector pGEM – T.
3.3.2. Kết quả kiểm tra tế bào khả biến
Các tế bào E.Coli TOP10 đang phát triển nhanh chóng có sức sống khỏe mạnh và chuyển hóa tích cực tạo ra các tế bào khả biến dễ dàng hơn ở các giai đoạn tăng trưởng khác. Vì vậy cần thiết đưa vào giai đoạn phát triển nhanh trước khi bắt đầu.
Plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy/Chitinase (gene mã hóa chitinase có kích thước 2025bp) được biến nạp vào tế bào E. Coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42℃ trong 55 giây (Sambrook and Russell, 2003). Kết quả được thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11. Kiểm tra tế bào E.Coli TOP10 khả biến
A: LB + tế bào khả biến + H2O, B: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến + H2O, C: LB + tế bào khả biến + pGEM – T Easy/Chitinase, D: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến +
pGEM – T Easy/Chitinase
Kết quả kiểm tra tế bào khả biến cho thấy, trên đĩa thạch môi trường LB có bổ sung Ampicillin nồng độ cuối là 50μg/mL, có xuất hiện cả khuẩn lạc E. Coli TOP10. Các khuẩn lạc này là khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pGEM – T Easy/Chitinase. Tế bào khả biến có chất lượng tốt, có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3. Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T và hóa biến nạp vào
E.Coli TOP10
Gene mã hóa chitinase sau khi tinh sạch được gắn vào vector pGEM – T tạo thành vector tái tổ hợp pGEM – T/chitinase được biến nạp vào tế bào E. Coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả được thể hiện trong hình 3.12.
Hình 3.12. Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T
A: LB + tế bào khả biến + H2O, B: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến + H2O, C: LB + tế bào khả biến + Ligation mixture, D: LB + Amp50μg/mL + tế bào khả biến + Ligation
mixture
Kết quả cho thấy, trên đĩa thạch môi trường LB có bổ sung ampicillin nồng độ cuối là 50μg/mL, không xuất hiện khuẩn lạc E. Coli TOP10 cho thấy không có thể biến nạp mang vector pGEM – T tái tổ hợp.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Trên cơ sở các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau đây:
Khuếch đại thành công gene chitinase có kích thước khoảng 1kb từ DNA tổng số của chủng Bacillus sp. TB1. Chiều dài của gene chitinase là 1083 nucleotide, mã hóa một protein dài 360 amino acid.
Thiết kế được mồi với hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế (BamHI và HindIII). Phân lập thành công gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế (BamHI và
HindIII).
Tạo dòng chưa thành công gene chitinase vào vector pGEM – T.
2. KIẾN NGHỊ
Việc tạo dòng gene mã hóa chitinase là cơ sở sẽ cho việc biểu hiện gene và tối ưu điều kiện biểu hiện. Do đó, tôi xin kiến nghị:
Tiếp tục tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T làm cơ sở cho việc tạo dòng biểu hiện vào vector pQE30.
Biểu hiện gene mã hóa chitinase trong vật chủ E.Coli M15.
Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và sản xuất chitinsae tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Alias, N., Mahadi, N.M., Murad, A.M.A., Bakar, F.D.A., Mahmood, N.A.N., Illias, R.M., 2009. Expression and characterization of Trichoderma virens UKM-1 endochitinase in Escherichia coli. World J. Microbiol. Biotechnol. 25, 561–572. https://doi.org/10.1007/s11274-008-9924-y
Al-Rashed, S.A.A., Bakar, F.D.A., Said, M., Hassan, O., Rabu, A., Illias, R.M., Murad, A.M.A., n.d. Expression and characterization of the recombinant Trichoderma virens endochitinase Cht2 10.
A.T, N., Rasoul-Amini, S., Morowvat, M.H., Younes, G., 2011. Single Cell Protein: Production and Process. Am. J. Food Technol. 6. https://doi.org/10.3923/ajft.2011.103.116
Baneyx, F., 1999. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 10, 411–421. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(99)00003-8
Bhattacharya, D., Nagpure, Dr.A., Gupta, R., 2007. Bacterial Chitinases: Properties and Potential. Crit. Rev. Biotechnol. 27, 21–8. https://doi.org/10.1080/07388550601168223
Bhushan, B., Hoondal, G.S., 1998. Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp. BG-11. Biotechnol. Lett. 20, 157– 159. https://doi.org/10.1023/A:1005328508227
Breman, J., Brandling-Bennett, A., 2012. The challenge of malaria eradication in the twenty-first century: Research linked to operations is the key. Vaccine 29 Suppl 4, D97-103. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.12.003
Bussink, A.P., van Eijk, M., Renkema, G.H., Aerts, J.M., Boot, R.G., 2006. The Biology of the Gaucher Cell: The Cradle of Human Chitinases, in: International Review of Cytology, A Survey of Cell Biology. Academic Press, pp. 71–128. https://doi.org/10.1016/S0074-7696(06)52001-7
C, S.D., V., M., Archana, B., Roy, S., Naine, J., 2015. Production and partial purification of antifungal chitinase from Bacillus cereus VITSD3. Biosci. J. 31, 960–968. https://doi.org/10.14393/BJ-v31n3a2015-26263
Cai, Y., Yan, J., Hu, X., Han, B., Yuan, Z., 2007. Improving the Insecticidal Activity against Resistant Culex quinquefasciatus Mosquitoes by Expression of Chitinase Gene chiAC in Bacillus sphaericus. Appl. Environ. Microbiol. 73, 7744–7746. https://doi.org/10.1128/AEM.01510-07
Castillo, B.M., Dunn, M.F., Navarro, K.G., Meléndez, F.H., Ortiz, M.H., Guevara, S.E., Palacios, G.H., 2016. Antifungal performance of extracellular chitinases and culture
supernatants of Streptomyces galilaeus CFFSUR-B12 against Mycosphaerella fijiensis Morelet. World J. Microbiol. Biotechnol. 32, 44. https://doi.org/10.1007/s11274-015-1993-0
Chen, W.-M., Chen, G.-H., Chen, C.-S., Jiang, S.-T., 2009. Cloning, Expression and Purification of <I>Bacillus cereus</I> Endochitinase in the <I>Escherichia coli</I> AD494(DE3)pLysS Expression System. Biosci. Biotechnol. Biochem. advpub, 0904081425–0904081425. https://doi.org/10.1271/bbb.80618
Chil – Min Wen, Chien – Sheng Tseng, Chil – Yu Cheng, Yaw – Kuen Li (2010); Purification, characterization and cloning of a chitinase from Bacillus sp. NCTU2; Department of Applied Chemistry, The National Chiao Tung University.
Chu Thị Hoa (2012), Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa chitinase của B.
licheniformis KNUC213 trong Pichia pastoris, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Viện Sinhh thái và Tài nguyên sinh vật.
Collinge, D.B., Kragh, K.M., Mikkelsen, J.D., Nielsen, K.K., Rasmussen, U., Vad1, K., 1993. Plant chitinases. Plant J. 3, 31–40. https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.1993.t01- 1-00999.x
Corona, J.E., Nieto-Mazzocco, E., Velázquez-Robledo, R., Salcedo-Hernández, R., Bautista, M., Jiménez, B., Ibarra, J., 2003. Cloning, Sequencing, and Expression of the Chitinase Gene chiA74 from Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1023–9. https://doi.org/10.1128/AEM.69.2.1023-1029.2003
Dahiya, N., Tewari, R., Tiwari, R.P., Hoondal, G.S., 2005. Production of an Antifungal Chitinase from Enterobacter sp. NRG4 and its Application in Protoplast Production. World J. Microbiol. Biotechnol. 21, 1611–1616. https://doi.org/10.1007/s11274-005-8343-6
Demain, A.L., Vaishnav, P., 2009. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol. Adv. 27, 297–306. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2009.01.008
Deng, J.-J., Shi, D., Mao, H., Li, Z., Liang, S., Ke, Y., Luo, X., 2019. Heterologous expression and characterization of an antifungal chitinase (Chit46) from Trichoderma harzianum GIM 3.442 and its application in colloidal chitin conversion. Int. J. Biol. Macromol. 134, 113–121. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.04.177
Driss, F., Kallassy‐Awad, M., Zouari, N., Jaoua, S., 2005. Molecular characterization of a novel chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. J. Appl. Microbiol. 99, 945– 953. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2005.02639.x
Flach, J., Pilet, P.-E., Jollès, P., 1992. What’s new in chitinase research? Experientia 48, 701–716. https://doi.org/10.1007/BF02124285
Giáo trình Công Nghệ Sinh Học Môi Trường Tập 2 - Nguyễn Đức Lượng, 2016. . Công Nghệ Môi Trường. URL http://congnghemoitruong.com.vn/giao-trinh-cong-nghe- sinh-hoc-moi-truong-tap-2/ (accessed 5.6.21).
Hamid, R., Khan, M., Ahmad, M., Ahmad, M.M., Abdin, M., Musarrat, J., Javed, S., 2013. Chitinases: An update. J. Pharm. Bioallied Sci. 5, 21–9. https://doi.org/10.4103/0975- 7406.106559
Haran, S., 1996. Differential Expression of Trichoderma harzianum Chitinases During Mycoparasitism. Phytopathology 86, 980. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-980
Harman, G., 2000. Myths and Dogmas of Biocontrol Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzinum T-22. Plant Dis. - PLANT DIS 84, 377–393. https://doi.org/10.1094/PDIS.2000.84.4.377
Hoàng V.Đ., Huy N.Đ., Thảo T.T.P., Thoa L.T.K., Trang L.V.K., Lan T.T.P., n.d. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2020 1.
Horsch, M., Mayer, C., Sennhauser, U., Rast, D.M., 1997. β-N-Acetylhexosaminidase: A target for the design of antifungal agents. Pharmacol. Ther., Proceedings of the Sixth