2.3.1.1. Tách chiết DNA tổng số
Chủng Bacillus sp. TB1 được nuôi cấy trong môi trường LB ở nhiệt độ 37℃ trong 18 giờ, lắc 180 vòng/phút. Sinh khối tế bào sau khi nuôi cấy được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Wilson (2001) với một số thay đổi nhỏ. Dịch nuôi cấy với thể tích 5mL được ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu sinh khối tế bào và tái huyền phù tế bào trong 467 µL đệm TE (Tris-HCl 10mM; EDTA 1mM, pH 8). Sau đó, SDS 10%,
proteinase K 20 mg/mL và bông thủy tinh được thêm vào dịch huyền phù với lượng 30 µL, 3 µL và 100 mg, theo tuần tự. Hỗn hợp được trộn đều trong 5 phút và ủ ở 37°C trong 1 giờ. 100 µL NaCl 5M được thêm vào và trộn đều, sau đó tiếp tục bổ sung 80 µL CTAB/NaCl (10% CTAB, 5% NaCl) và ủ ở 65oC trong 20 phút. DNA tổng số được phân tách khỏi các thành phần của tế bào thông qua bổ sung hỗn hợp PCI (25 phenol: 24 chloroform: 1 isoamylalcohol) vào dung dịch với tỷ lệ 1:1, trộn đều và ly tâm 12.000 vòng / phút trong 5 phút. DNA tổng số được kết tủa bằng bổ sung 0,6 thể tích isopropanol lạnh, rửa bằng 500 µL ethanol 70% và hòa tan trong 20 µL TE buffer và bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo (Wilson, 2001).
DNA tổng số được tiến hành điện di và kiểm tra độ tinh sạch trên gel agarose 1 %, đệm TBE 1X, điện áp 100V trong thời gian 30 phút.
2.3.1.2. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế cho gene mã hóa chitinase và tiến hành phản ứng PCR.
Gene mã hóa chitinase của chủng Bacillus sp. TB1 phân lập được khuếch đại từ DNA tổng số và cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gene chitinase của vi khuẩn Bacillus subtilis HDZK-BYSB7 (mã số: CP026608). Trình tự mồi được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Trình tự mồi được dùng để khuếch đại gene chitinase
Mồi Trình tự
FChi1Kb 5’-GCAAACAATTTAGGATCAAA-3’ RChi1Kb 5’-TTATTTTTGCAAGGGGATCG-3’
Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện sử dụng 40 ng DNA khuôn mẫu, 10 µL Enzyme MyTaq Mix (Bioline – UK), 10 pmol mồi FChi1Kb, 10 pmol mồi RChi1Kb trong thể tích 20 µL. Chu trình phản ứng PCR được thực hiện như sau: biến tính 95o
C trong 5 phút; 30 chu kỳ: 95℃ trong 20 giây, 55℃ trong 30 giây, và 72℃ trong 1 phút 10 giây; cuối cùng là 72℃ trong 10 phút. Sản phẩm PCR được diện di trên gel agarose 1%, đệm TBE 1X, điện áp 100 V trong 30 phút.
2.3.1.3. Gửi mẫu đi đọc trình tự tại công ty Fist base, Malaysia.
Sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 1%, tinh sạch bằng GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và gửi giải trình tự tại công ty Fist base (Malaysia).