Nghiên cứu tạo dõng biểu hiện gen mã hóa chitinase phân lập từ bacillus sp vào hệ thống vector pqe30

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƢỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÕNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHITINASE PHÂN LẬP TỪ BACILLUS SP VÀO HỆ THỐNG VECTOR pQE30 LÊ THỊ NHẬT ANH Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÕNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHITINASE PHÂN LẬP TỪ BACILLUS SP VÀO HỆ THỐNG VECTOR pQE30 Ngành : Công nghệ sinh học Khóa : 2018-2022 Sinh viên : Lê Thị Nhật Anh Ngƣời hƣớng dẫn : ThS Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày đề tài trung thực, khách quan nghiêm túc Những tài liệu tham khảo cho đề tài có nguồn gốc rõ ràng Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Sinh viên thực Lê Thị Nhật Anh i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin chân thành cảm ơn mẹ, cảm ơn ngƣời giúp đỡ, động viên tôi, hậu phƣơng vững hỗ trợ tơi tập trung hồn thành tốt đề tài Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Vũ Đức Hoàng, ngƣời thầy tâm huyết tận tình giúp đỡ tơi, khích lệ tinh thần dành nhiều thời gian trao đổi với Cảm ơn thầy theo sát, truyền đạt kiến thức chuyên ngành, đƣa góp ý kinh nghiệm thực tiễn ngành nhƣ sống suốt thời gian vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Sinh - Môi trƣờng giúp đỡ, hỗ trợ suốt trình học tập bốn năm giảng đƣờng đại học, tạo điều kiện hội để sinh viên đƣợc học tập, rèn luyện tốt Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ngƣời bạn, ngƣời anh, ngƣời chị bạn sinh viên khóa dƣới ln đồng hành tơi, ln chia sẻ kiến thức hỗ trợ giúp đỡ lẫn q trình nghiên cứu, học tập Tơi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 20 tháng năm 2022 Sinh viên thực ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Chitinase 1.1.1 Giới thiệu chitinase 1.1.2 Phân loại chitinase 1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase 1.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp chitinase 1.1.5 Ứng dụng Chitinase 1.2 Công nghệ DNA tái tổ hợp 12 1.3 Tình hình nghiên cứu chitinase 13 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 iii 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ Bacillus sp 17 2.2.2 Phân lập gen mã hóa chitinase 18 2.2.3 Chuẩn bị tế bào E Coli TOP 10 khả biến 19 2.2.4 Tạo dòng gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pGEM®-T (Promega, Mỹ) 19 2.2.5 Tách chiết vector tái tổ hợp pGEM®-T-Chitinase vector pQE30 19 2.2.6 Tạo dòng biểu gen mã hóa Chitinase vào hệ thống vector pQE30 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Tách chiết DNA tổng số 21 3.2 Phân lập gen mã hóa chitinase 21 3.3 Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM®-T 23 3.4 Tinh plasmid pQE30 pGEM®-T-Chitinase 25 3.5 Tạo dịng biểu gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pQE30 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 Kết luận 31 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra - acetic acid Kb Kilobase LB Môi trƣờng Luria bertani PCI Phenol : chloroform : isoamylalcohol PCR Polymerase chain reaction RE Restriction enzyme TBE Tris - Axit axetic - EDTA TE Tris - EDTA v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng biểu Trang 2.1 Trình tự cặp mồi đƣợc dùng để khuếch đại gen chitinase 18 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình vẽ Trang 1.1 Cơ chế thủy phân chitinase 2.1 Hệ thống vector pQE30 17 2.2 Chuẩn bị tế bào khả biến E.Coli TOP 10 19 3.1 DNA tổng số chủng Bacillus sp 21 3.2 Sản phẩm khuếch đại PCR gen chitinase 22 3.3 Tinh gen chitinase 22 3.4 Thể biến nạp mơi trƣờng LB rắn có bổ sung Ampicillin 23 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 24 3.6 Kết ttinh pGEM®-T-Chitinase 24 3.7 Kết phản ứng cắt pGEM®-T-Chitinase 25 3.8 Kết điện di tinh pGEM®-T-Chitinase pQE30 26 3.9 Kết phản ứng cắt BamHI pGEM®-T-Chitinase 27 3.10 Kết phản ứng cắt KpnI pGEM®-T-Chitinase 28 3.11 Kết phản ứng cắt pQE30 28 vii TÓM TẮT Kỹ thuật DNA tái tổ hợp công nghệ then chốt lĩnh vực công nghệ sinh học, cho phép phân lập, khuếch đại trình tự gen từ hệ genome sinh vật với mục đích nghiên cứu, chỉnh sửa chuyển vào thể nhằm tạo sản phẩm tốt phục vụ cho đời sống ngƣời Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để sản xuất chitinase với chất lƣợng tốt nhận đƣợc nhiều quan tâm nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tơi tạo dịng thành cơng pGEM®-T-Chitinase từ Bacillus sp đƣợc cung cấp Khoa Sinh - Môi trƣờng, trƣờng ĐH Sƣ phạm - ĐH Đà Nẵng Trình tự mồi đƣợc thiết kế cho sản phẩm đặc hiệu với kích thƣớc khoảng kb Mặc dù thành cơng việc tạo dịng nhƣng enzyme đƣợc thiết kế mồi không cắt hiệu Kết nghiên cứu sở cho tối ƣu phản ứng PCR, thiết kế mồi Từ khóa: Chitinase; tái tổ hợp; tạo dòng; Bacillus sp.; E.Coli TOP 10 viii Sự diện gen mã hóa chitinase thể tái tổ hợp với vector pGEM®-T đƣợc kiểm tra enzyme cắt giới hạn NdeI (Thermo scientific, Mỹ) Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% (Hình 3.7) Hình 3.7 Kết phản ứng cắt pGEM®-T-Chitinase L: HyperLadder 1kb (Bioline, Mỹ) 1: vector tái tổ hợp pGEM®-T-Chitinase tách chiết từ E coli TOP 10 2: vector tái tổ hợp pGEM®-T-Chitinase đƣợc cắt enzyme NdeI Vector tái tổ hợp pGEM®-T đƣợc chèn thành cơng gen chitinase có kích thƣớc khoảng 4,1 kb (Gen mã hóa chitinase: 1083 bp, pGEM®-T: 3000 bp ) Kết điện di thu đƣợc Hình 3.7 cho thấy vector tái tổ hợp nằm vị trí 2,3 kb 4,4 - kb sai khác vector tái tổ hợp trạng thái vòng, dạng vòng làm vector tái tổ hợp di chuyển chậm gel agarose Vector pGEM®-T có vị trí nhận biết enzyme NdeI đầu đoạn chèn, gen chitinase đƣợc chèn thành cơng vào vector pGEM®-T sử dụng enzyme NdeI để cắt, cho band vị trí 4,1 kb 3.4 Tinh plasmid pQE30 pGEM -T-Chitinase ® Tế bào E coli TOP 10 chứa plasmid pQE30 pGEM®-T-Chitinase đƣợc ni cấy mL mơi trƣờng LB + 50 µg/mL Ampicillin 37ºC, 16 DNA plasmid đƣợc tách chiết sử dụng kit TOP PURE®PLASMID DNA EXTRACTION KIT, 50 preps (ABT - Việt Nam) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất 25 Hình 3.8 Kết điện di tinh pGEM®-T-Chitinase pQE30 L: HyperLadder 1kb (Bioline, Mỹ) 1: vector tái tổ hợp pGEM®-T-Chitinase 2: vector pQE30 Vector pGEM®-T-Chitinase sau tinh xuất hai vị trí: 2,3 kb kb với nồng độ lần lƣợt là: 300 ng 15 ng Vector pQE30 có kích thƣớc khoảng 2,6 kb với nồng độ 200 ng 3.5 Tạo dòng biểu gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pQE30 Vector pGEM®-T-Chitinase, pQE30 đƣợc thiết kế có trình tự nhận biết BamHI, KpnI đầu đoạn chèn Tiến hành phân lập trình tự gen mong muốn phản ứng cắt theo khuyến nghị nhà sản xuất Phản ứng cắt BamHI đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% (Hình 3.9.) 26 Hình 3.9 Kết phản ứng cắt BamHI pGEM®-T-Chitinase L: HyperLadder 1kb (Bioline, Mỹ) 1: vector tái tổ hợp pGEM®-T-Chitinase 2: vector tái tổ hợp pGEM®-T-Chitinase sau cắt BamHI 3: vector pQE30 4: vector pQE30 sau cắt BamHI Qua hình ảnh điện di, cho thấy phản ứng cắt đƣợc thực hoàn toàn pQE30 vị trí kb, nồng độ thu đƣợc ~ 200 ng Vector pGEM®-T-Chitinase sau cắt xuất band: vị trí 5,5 kb, nồng độ plasmid thu đƣợc khoảng 200 ng, vị trí 4,1 kb đạt nồng độ khoảng 15 ng, vị trí 2,3 kb với nồng độ 25 ng Sự khác biệt vector pGEM®T-Chitinase trƣớc sau cắt phản ứng cắt chƣa đƣợc tối ƣu có sai lệch trình tự nhận biết enzyme BamHI Plasmid sau cắt đƣợc tinh kit TOP PURE®PCR/GEL DNA PURIFICATION KIT (ABT - Việt Nam) theo khuyến cáo nhà sản xuất tiến hành cắt KpnI Phản ứng cắt KpnI đƣợc thể Hình 3.10 27 Hình 3.10 Kết phản ứng cắt KpnI pGEM®-T-Chitinase L: HyperLadder 1kb (Bioline, Mỹ) 1: pGEM®-T-Chitinase cắt BamHI 2: pGEM®-T-Chitinase cắt KpnI 3: pGEM®-T-Chitinase cắt BamHI, KpnI Từ kết điện di agarose, xuất band tất vị trí Lane gồm band: 5,8 kb; 2,3 kb Tại lane 5,8 kb; 4,1 kb Band thu đƣợc vị trí 4,1 kb đạt nồng độ ~ 60 ng, kích thƣớc tƣơng đồng với sản phẩm cắt enzyme NdeI (Hình 3.7.) Sản phẩm phụ vị trí 5,8 kb cho thấy phản ứng cắt đạt hiệu chƣa cao, KpnI chƣa cắt hồn tồn plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa chitinase Sản phẩm cắt sử dụng hai enzyme cho kết trùng khớp với sản phẩm cắt loại enzyme Hình 3.11 Kết phản ứng cắt pQE30 L: HyperLadder 1kb (Bioline, Mỹ) 1: pQE30 2: pQE20 cắt BamHI 3: pQE30 cắt KpnI 28 Dựa vào Hình 3.11 hai enzyme BamHI KpnI cắt hồn tồn vị trí đặc hiệu hệ thống vector pQE30 Chứng tỏ, điều kiện phản ứng cắt đƣợc tối ƣu enzyme hoàn toàn ổn định Nhƣ vậy, khác biệt vector pGEM ®-TChitinase trƣớc sau cắt (Hình 3.9 Hình 3.10.) trình tự nhận biết enzyme BamHI khơng xuất pGEM®-T-Chitinase có sai lệch vài nucleotide vị trí nhận biết enzyme Bên cạnh đó, phản ứng cắt dƣới xúc tác KpnI, có xuất DNA plasmid vị trí khoảng kb Theo khuyến cáo (Thermo scientific, Mỹ) NdeI BamHI cần 0,2U enzyme (10 u/µL) cắt đƣợc µg lambda DNA 37ºC 16 Thể tích enzyme đƣợc sử dụng phản ứng cắt NdeI BamHI µL với nồng độ hai enzyme 20 U Dựa vào Hình 3.7 nồng độ DNA sau cắt 250 ng vị trí 4,1 kb Đối với KpnI (Promega, Mỹ), 10 u/µL, thể tích đƣợc sử dụng 0,5 µL Nhƣ vậy, enzyme lý dẫn đến xuất band phụ sau cắt Hiện tƣợng RE (restriction enzyme) khơng thể nhận diện trình tự để tiến hành cắt vị trí đặc hiệu lý sau: - RE bị chặn q trình methyl hóa DNA - Một số enzyme giới hạn yêu cầu base bổ sung bên sƣờn để liên kết phân cắt DNA hiệu - Trình tự nhận biết RE bị thay đổi dẫn đến RE gắn vào DNA để thực chức Mặc dù, DNA đƣợc sử dụng để cắt nghiên cứu plasmid dạng vịng nhƣng methyl hóa DNA khơng diễn ra, thông qua việc sử dụng NdeI cho hiệu cắt gần nhƣ tuyệt đối Vì DNA dạng vòng nên yêu cầu liên tục trình tự DNA phù hợp với yêu cầu số loại enzyme Nhƣ vậy, trình tự sản phẩm sau PCR thay đổi, dẫn đến gen chitinase mục tiêu không đƣợc tổng hợp đầy đủ trình tự nhận biết, phục vụ việc tạo dòng vào pQE30 Tại lane lane 2, Hình 3.10 có xuất band vị trí 4,1 kb, nhƣ có sản phẩm sau khuếch đại chứa trình tự nhận biết enzyme đƣợc thiết kế nhƣng với tỉ lệ thấp Trong đó, trình tự nhận biết KpnI nhiều trình tự nhận biết BamHI Tuy nhiên, khơng có sản phẩm kb (gen mã hóa Chitinase) lane 3, chứa 29 sản phẩm cắt enzyme Điều nồng độ sản phẩm chứa trình tự BamHI thấp trình tinh sạch, DNA thất thoát nhiều DNA polymerase Thermlrs aqtraticus (Taq) đƣợc chứng minh gây đột biến phản ứng khuếch đại DNA với tần số lỗi từ × 10−5 đến × 10−4 / khuếch đại (Cline J cs, 1996; Ling LL cs, 1991) Theo theo công bố Peter McInerney cộng sự, phần lớn đột biến chuyển đổi A - T → G - C; G - C → A - T đột biến phổ biến thứ hai Ngoài xuất đột biến chuyển đoạn, với A - T → T - A A - T → C - G (Peter McInerney cs, 2014) Sự sai lệch Taq DNA polymerase thiếu hoạt động exonuclease ′ → ′ sửa chữa nucleotide bị kết hợp sai xảy trình tổng hợp DNA Hơn nữa, xu hƣớng enzyme kết hợp sai dCTP với nucleotide T mạch khn DNA Trình tự nhận biết BamHI: 5’ G/GATCC3’, KpnI: 5’ GGTAC/C3’, đột biến xảy q trình khuếch đại, dẫn đến BamHI nhận diện tiến hành cắt vị trí mồi đƣợc thiết kế Patrick C Cirino cộng sự, 2003 thành công tạo enzyme đột biến từ gen có kích thƣớc 1,4 kb dƣới xúc tác Taq enzyme thu đƣợc sản phẩm có tỉ lệ đột biến lần lƣợt 45%, 40%, 31% với mức độ hoạt động thấp với enzyme chƣa đột biến 10% Nghiên cứu ra, MnCl tăng nồng độ tạo tỷ lệ lỗi trình khuếch đại cao hơn, ngồi chu kì tái ảnh hƣởng đến gia tăng đột biến phản ứng PCR Ngồi Taq enzyme, khơng nhận diện đƣợc trình tự đặc hiệu RE xuất phát từ gen mã hóa chitinase Trình tự gen mục tiêu đƣợc gắn vào pGEM®-T có ảnh hƣởng đến sinh trƣởng đến E.Coli TOP 10, dẫn đến E.Coli TOP 10 tiến hóa chỉnh sửa vài Nucleotide để chống lại xuất nhân tố lạ thể Nghiên cứu Paul D Sniegowski cộng chứng minh sau 10,000 hệ, số 12 quần thể E.Coli tự chỉnh sửa vài Nucleotide genomic để phục vụ cho q trình tiến hóa thân (Paul D Sniegowski cs, 1997) 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Khuếch đại thành công gen mã hóa Chitinase từ genomic Bacillus sp Tạo dịng thành cơng pGEM®-T-Chitinase Kiến nghị Giải trình tự pGEM®-T-Chitinase với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế Thay đổi enzyme thực phản ứng PCR 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aam B B cs 2010, Production of chito-oligosaccharides and their potential applications in medicine, Mar Drugs 8, 1482–1517 Abu-Tahon cs (2020), Anticancer and antifungal efficiencies of purified chitinase produced from Trichoderma viride under submerged fermentation, The Journal of General and Applied Microbiology, 66(1), 32-40 Ausubel cs (2003), Current Protocols in Molecular Biology Barboza-Corona JE cs (2003), Cloning, Sequencing, and Expression of the Chitinase Gene chiA74 from Bacillus thuringiensis, Applied and Environmental Microbiology, 69(2): 1023-1029 Bernard Henrissat (1991), A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities Bernard N (1911), Sur la fonction fungicide des bulbes d’ophrydées, Am Sci Nat Bot Paris, 14:221–234 Cai cs (2007), Improving the Insecticidal Activity against Resistant Culex quinquefasciatus Mosquitoes by Expression of Chitinase Gene chiAC in Bacillus sphaericus Cohen-Kupiec cs (1998), The molecular biology of chitin digestion, Curr Opin Biotech, vol 9, pp 270-277 Collinge DB cs (1993), Plant chitinases, The Plant Journal, 3(1): 31-40 Dahiya cs (2005), Production of an Antifungal Chitinase from Enterobacter sp NRG4 and its Application in Protoplast Production, Microbiology & Biotechnology, vol 21, pp 1611–1616 Eun Kyung Cho cs (2010), Overexpression and characterization of thermostable chitinase from Bacillus atrophaeus SC081 in Escherichia coli Faiza Saleem (2014), Characterization of Chitinases from Bacillus thuringiensis strains 32 Felse cs (1999), Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode, Proc Bioche, 34: pp 563-566 Flach J cs (1992), What's new in chitinase research, Experientia, 48(8): 701–716 F M Steinberg cs (1998), Biotech pharmaceuticals and biotherapy: an overview Gautam S P cs (1996), Protoplast formation from the Thermophilic fungus Malbranchea sulfurea, using the thermostable chitinase and laminarinase of Paecilomyces varioti, World J Microbiol Biotechnol, 12, 99-100 Ghanem cs (2010), Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus, African Journal of Biotechnology, 9(32): pp 5135-5146, 2010 Gupta cs (1995), Chitinase production by Streptomyces viridificans: Its potential in fungal cell wall lysis, J Appl Bacteriol, 78: pp 378- 383 Nguyễn Thị Hà (2000), Tối ƣu hố điều kiện ni cấy chủng nấm sợi Penicillium oxalicum sinh tổng hợp enzyme chitinase đƣợc phân lập từ đất”, Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ, pp 1001-1007 Trịnh Thị Thu Hà cs (2014), Phân lập gen mã hóa endochitinase từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Hà Nội, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 12(4): 757-763 Hamel F cs (1995), Characterisation of a class I chitinase gene and of woundinducible, root and flower-specific chitinase expression in Brassica napus, Biochim, Biophys, Acta 1263, pp 212-220 Hamid R cs (2013), Chitinases: an update, J Pharm Bioallied Sci, 5:21 Hao Z cs (2012), Optimization of nutrition factors on chitinase production from a newly isolated Chitiolyticbacter meiyuanensis SYBCH1, Brazilian Journal of Microbiology, 43: pp 177-186, 2012 Haran S cs (1996), Differential expression of Trichoderma harzianum chitinases during mycoparasitism, Phytopathology, 980-985 33 Chu Thị Hoa (2012), Tách dịng biểu gene mã hóa chitinase B licheniformis KNUC213 Pichia pastoris Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Ho-Seong L cs (1994), The production and enzymatic properties of chitinase from Pseudomonas stutzeri YPL-1 as a biocontrol agent, J Microbiol Biotechnol, 4: pp 134- 140 https://vasep.com.vn/gioi-thieu/tong-quan-nganh https://vtv.vn/kinh-te/xuat-khau-tom-thang-4-du-bao-tang-2020220416084726734.htm https://www.intechopen.com/chapters/57402 Itoh T cs (2019), Bacterial chitinase system as a model of chitin biodegradation In: Yang Q, Fukamizo T (eds) Targeting chitin-containing organisms, Springer, Singapore, pp 131–151 Jamialahmadi cs (2011), Enzymatic Production of N - Acetyl - Glucosamine from Chitin Using Crude Enzyme Preparation of Aeromonas sp PTC C1691, Biotechnology, 10(3): pp 292-297 Kabir K E cs (2006), Effect of Bombyx mori chitinase against japanese pine sawyer (Monochamus alternatus) adults as a biopesticide, Biosci Biotechnol Biochem, 70, 219- 222 Karasuda S cs (2003), Plant chitinase as a possible biocontrol agent for use instead of chemical fungicides, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 67(221224) Kapat cs (1996), Optimization of carbon and nitrogen sources in the medium and environmental factors for enhanced production of chitinase by Trichoderma harzianum, Bioproc Eng, 15: pp 13-20 Ku J.H cs (2005), Selective preparation of N-acetyl-D-glucosamine and N,N’diacetylchitobiose from chitin using a crude enzyme preparation from Aeromonas sp Biotechnology Letter 34 Kuk cs (2005), Selective preparation of N-acetyl-D-glucosamine and N,N’diacetylchitobiose from chitin using a crude enzyme preparation from Aeromonas sp., Biotechnology Letters, 27: pp 7-11, 2005 Kzhyshkowska cs (2007), Human chitinases and chitinase-like proteins as indicators for inflammation and cancer Biomarker insights, 2, 128-146 Phạm Thị Ngọc Lan cs (2010), Tuyển chọn chủng vi khuẩn phân hủy chitin khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase, TC Công nghệ Sinh học, 8(3B): 1639-1643 Le B cs (2018), Characterization of a chitinase from Salinivibrio sp BAO-1801 as an antifungal activity and a biocatalyst for producing chitobiose J Basic Microbiol 58: 848–856 Lee H W cs (2003), Antidiabetic effects of chitosan oligosaccharides in neonatal streptozotocin-induced noninsulin-dependent diabetes mellitus in rats Biol Pharm Bull, 26, 1100–1103 L Galambos cs (1998), Pharmaceutical firms and the transition to biotechnology: a study in strategic innovation, Business History Review, vol 72, no 2, pp 250–278 Phạm Thị Lịch cs (2003), Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận để thu nhận chế phẩm chitinase thô từ chủng Trichoderma sp Mahadevan B.C cs (1997), Properties of the chitinase of the antifungal agent Streptomyces lydicuis WYEC108, Enzyme Microb Technol, 20: pp 489-493 Maiza Alves Lopes cs (2008), Use of response surface methodology to examine chitinase regulation in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa Mathivanan cs (1997), Production of chitinase by Fusarium chlamydosporum, a mycoparasite to groundnut rust Puccinia arachidis, Ind J Exp Biol, 1997 M Bazan-Peregrino cs (2013), Combining virotherapy and angiotherapy for the treatment of breast cancer, Cancer Gene Therapy, vol 20, no 8, pp 461–468 Marcum cs (2007), Composition and method for treating rheumatoid arthritis, in US patent NO 003258 35 Marina Duarte Pinto Lobo cs (2013),Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli,” BMC Biotechnology Matsumiya M cs (1998), Distribution of chitinase and b-N-acetylhexosaminidase in the organs of a few squid and a cuttlefish, Fish Sci 64: 166–167 McCormack cs (1991), Chitinase production by Talaromyces emersonii”, 13: pp 677-682 Meyers SP (1986), Utilization of shrimp processing waste, Infofi sh Mark Digest 4:18–19 Montarop Yamabhai cs (2008), Secretion of recombinant Bacillus hydrolytic enzymes using Escherichia coli expression systems, Biotechnology, vol.133, no.1, pp.5057 Murao S cs (1992), Purification and Characterization of a Novel Type of Chitinase from Vibrio alginolyticus TK-22, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 56(2): 368-369 Nguyễn Văn Nam cs (2010), Chức chitinase nấm Trichoderma hazianum T1 trình đối kháng với nấm bệnh Fusarium solani, TC Công nghệ Sinh học, 8(3B): 1633-1638 Nawani cs (2005), Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs, Process Biochemistry, 40: pp 651-660 Pan cs (2005), Chitinase induces lysis of MCF-7 cells in culture and of human breast cancer xenograft B11-2 in SCID mice, Anticancer Research, 25(5), 3167-3172 Patidar cs (2005), Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isol isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation, Process Biochemistry, 40: pp 2962-2967 Patil cs (2000), Chitinolytic enzymes: An exploration, Enzyme Microb Technol, 26, pp.473-483 Patil N S cs (2013), Purification and characterization of an extracellular antifungal chitinase from Penicillium ochrochloron MTCC 517 and its application in protoplast formation, Process Biochem, 48, 176-183 36 Patrick C Cirino cs (2003), Generating Mutant Libraries Using Error-Prone PCR Peter McInerney cs (2014), Error Rate Comparison during Polymerase Chain Reaction by DNA Polymerase Nguyễn Thị Pha cs (2014), Khả đối kháng nấm Pyricularia Oryzae vi khuẩn sinh chitinase phân lập từ đất vùng rễ lúa PP Singh cs (1999), Biological control of Fusarium wilt of cucumber by chitinolytic bacteria Purwani E Yuli cs (2004), Characteristics of thermostable chitinase enzymes from the indonesian Bacillus sp.13.26, Enzyme and Microbial Technology, vol 35, pp 147-153 Ramírez M.V cs (2016), Industrial enzymes and metabolites from actinobacteria in food and medicine industry” In Actinobacteria-Basics and Biotechnological Application (DhanasekaranD and Jiang Y., eds), pp 315–328, INTECH World’ s largest Science, Technology & Medicine Rhoades J cs (2006), Inhibition of the adhesion of enteropathogenic Escherichia coli strains to HT-29 cells in culture by chito-oligosaccharides, Carbohy Poly 64, 57– 59 Ruth Nyanduko Okongo cs (2018), Comparative biocontrol ability of chitinases from bacteria and recombinant chitinases from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus Sabry cs (1992), Microbial degradation of shrimp shell waste, J Basic Microbiol, 32: pp 107-111 Saima cs (2013), Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 11: pp 39-46 Settha Kaset cs (2008), Preparation of N-acetyl-D-Glucosamine Using Enzyme from Aspergillus sp., Journal of Metals, Materials and Minerals, 18(2): pp 53-57 Shahidi F cs (2005), Chitin, chitosan and co-products: Chemistry, production, applications and health effects, Adv Food Nutr Res, vol 49, pp 93–135 37 Sherief cs (1991), Some properties of chitinase produced by potent Aspergillus carneus strain, Appl Microbiol Biotechnol Singh cs (2009), Optimization of medium constituents for improved chitinase production by Paenibacillus sp D1 using statistical approach, Journal of Applied Microbiology, 49: pp 708-714 Siok Hwee Tan cs (2000), The Penaeus monodon Chitinase gene is Differentially Expressed in the Hepatopancreas During the Molt Cycle, Marine Biotechnology, pp 126-135 S L Wang cs (1997), Purification and characterization of two bifunctional chitinases/lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell powder medium Swiontek B.M cs (2014), Chitinolytic microorganisms and their possible application in environmental protection, Curr Microbiol, 68, 71–81 Takayanagi cs (1991), Isolation and characterisation of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7U, Biochem Biophy Acta, 1078: pp 404-410 Thomas CJ cs (2000), Mutagenesis of the active site coding region of the Autographa californica nucleopolyhedrovirus chiA gene J Gen Virol, 81(5): 1403-1411 Trần Đình Toại cs (2008), Nghiên cứu động học q trình hoạt hóa chitinase phản ứng thủy phân chitin thành glucosamine, TC Khoa học Công nghệ 46(1): 79-85 Nguyễn Thị Thu Trang cs (2006) Khả sinh tổng hợp chitinaza chủng vi khuẩn Bacillus Q3 có hoạt tính kháng nấm cao, TC Sinh học 28(2): 82-85 Quách Ngọc Tùng cs (2013), Biểu gen mã hóa chitinase Bacillus licheniformis KNUC213 Escherichia coli, Kỷ yếu Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Nhà xuất Khoa học Công nghệ, 631-634 Usui T.H cs (1984), Transglycosylation reaction of a chitinase purified from Nocardia orientail, Biochem Biophy Acta 923: pp 302-339 Vyas cs (1989), Chitinase production by Myrothecium verrucaria and its significance in fungal mycelia degradation, J Gen Microbiol 35: pp 343-350 38 Yang S cs (2016), Cloning, expression, purification and application of a novel chitinase from a thermophilic marine bacterium Paenibacillus barengoltzii, Food Chem, 192, 1041–1048 Yasuyuki Arakane cs (2010), Insect chitinase and chitinase-like proteins, Cellular and Molecular Life Sciences, vol 67, pp 201-216 Young cs (1985), Kinetics of chitinase production: II Relation between bacterial growth, chitin hydrolysis, and enzyme synthesis, Biochem Bioegg, 27: pp 776-780 Wadhwa M cs (2016), Application of waste-derived proteins in the animal feed industry, In: Protein byproducts Elsevier, Kent, 161–192 Wang Di cs (2018), A potent chitinase from Bacillus subtilis for the efficient bioconversion of chitin-containing wastes, Biological Macromolecules W.T Chang cs (2003), An Antifungal Chitinase Produced by Bacillus cereus with Shrimp and Crab Shell Powder as a Carbon Source, Current Microbiology, vol 47, pp 102-108 Zhao, J cs (2011), Amino acid composition, molecular weight distribution and antioxidant stability of shrimp processing byproduct hidrolysate, Amer J Food Technol, 10: 904–913 Zikakis JP cs (1984), Chitin, Chitosan and Related Enzymes, Orlando, New York: Academic Press Inc, p XVII 39 ... Nội dung nghiên cứu Phân lập gen mã hóa chitinase từ Bacillus sp Tạo dịng gen mã hóa chitinase vào vector pGEM®-T Tạo dịng biểu gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector biểu pQE30 CHƢƠNG TỔNG... Bacillus sp Tạo dịng biểu gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pQE30 Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học việc phân lập tạo dịng biểu gen mã hóa chitinase. .. MƠI TRƢỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÕNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHITINASE PHÂN LẬP TỪ BACILLUS SP VÀO HỆ THỐNG VECTOR pQE30 Ngành : Cơng nghệ sinh học Khóa : 2018-2022 Sinh viên : Lê