Phân lập và tuyển chọn chủng bacillus sp sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt thấp NGUYỄN THỊ THU TRANG Trang.NTT202668M@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Tuân Chữ ký GVHD Bộ môn: Công nghệ Sinh học Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 10/2022 ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Họ tên học viên: Nguyễn Thị Thu Trang Khóa: CH2020B Mã học viên: 20202668M Viện: Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Công nghệ Sinh học Đầu đề đề tài nghiên cứu: Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt thấp Nội dung nghiên cứu: – Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase cao tạo độ nhớt thấp – Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt canh trường lên men chủng tuyển chọn – Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men phương pháp đáp ứng bề mặt nhằm cải thiện hoạt lực enzyme giảm độ nhớt canh trường – Lên men theo mẻ thiết bị L Họ tên giảng viên hướng dẫn: TS Lê Tuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày hoàn thành đồ án: Ngày …… tháng …… năm 20… Giảng viên hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) I LỜI CẢM ƠN Trải qua năm học tập nghiên cứu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy Thầy, Cô với nỗ lực cố gắng thân mình, em hồn thành đề tài luận văn Thông qua luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành thầy TS Lê Tuân; Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình giảng dạy hướng dẫn em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời, em muốn bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Nguyễn Lan Hương giúp đỡ để em học hồn thành chương trình Thạc sỹ Đại học Bách Khoa Hà Nội Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm giúp em tích lũy thêm nhiều kiến thức suốt thời gian học tập vừa qua Cuối cùng, em xin cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè quan tâm, động viên sát cánh bên em suốt khoảng thời gian thực đồ án tốt nghiệp Trong q trình hồn thiện đồ án hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm nên khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý Thầy, Cơ để luận văn em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! II TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Nattokinase (NK) enzyme phân hủy fibrin có tiềm lớn ngăn ngừa điều trị bệnh liên quan huyết khối Tuy nhiên, trình thu hồi NK từ dịch lên men lỏng thường bị cản trở độ nhớt canh trường cao Trong bối cảnh đó, luận văn đặt mục tiêu phân lập chủng Bacillus subtilis sinh tổng hợp NK cao tạo độ nhớt thấp Trong nghiên cứu này, phân lập 73 dòng khuẩn lạc sinh protease từ 25 mẫu phâp lập bao gồm tương, đất, nước biển natto thương mại Tiến hành sàng lọc 73 dòng khuẩn lạc theo tiêu chí khả sinh tổng hợp enzyme phân giải fibrin đột nhớt canh trường lên men lỏng lựa chọn chủng TVY.04 có hoạt lực NK cao đạt 98,5 ± 3,5 FU/mL độ nhớt thấp đạt 3,87 ± 3,5 cP Kết định danh cho thấy chủng TVY.04 thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens Kết khảo sát điều kiện lên men nhận thấy nhiệt độ lên men 37°C, tốc độ lắc 150 rpm tỉ lệ cấp giống OD 600 nm = 0,2 cho hoạt lực NK cao đồng thời tạo độ nhớt thấp Thành phần môi trường dinh dưỡng khảo sát tối ưu theo mơ hình Minimal run Box-Behnken với tiêu chí hoạt lực enzyme cao độ nhớt thấp Kết thành phần môi trường tối ưu bao gồm: 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, g/L CaCl2, 10 g/L cao nấm men, g/L NaCl, g/L K2HPO4 Lên men chủng TVY.04 môi trường tối ưu, quy mơ bình tam giác giúp hoạt lực NK tăng lần, đạt 210,47 ± 4,36 FU/mL nhiên độ nhớt chưa cải thiện so với môi trường ban đầu Lên men theo mẻ chủng Bacillus amyloliquefaciens môi trường tối ưu thiết bị bioreator quy mô L thu hoạt lực NK đạt 460 ± 12 FU/mL, độ nhớt canh trường đạt 4,41 ± cP; tăng 50% xấp xỉ 10% so với hoạt lực NK độ nhớt (4,08 ± cP) lên men bình tam giác Học viên thực III MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT X CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xu hướng nghiên cứu nước 1.2 Enzyme Nattokinase 1.2.1 Lịch sử 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm nattokinase 1.3 Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase 1.4 Nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase 1.4.1 Thực phẩm lên men 1.4.2 Nguồn phân lập khác 1.4.3 Tương Việt Nam 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp NK lên men lỏng 10 1.5.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 12 1.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 13 1.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại 13 1.6 Poly – γ – glutamic acid (γ-PGA) 14 1.6.1 Cấu trúc γ-PGA 14 1.6.2 Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 16 1.6.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA 18 1.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình tổng hợp γ-PGA lên men lỏng 20 1.6.5 Ảnh hưởng độ nhớt tới trình thu hồi enzyme 21 1.7 Kết luận 22 CHƯƠNG - VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 23 2.1.2 Chủng đối chứng 23 2.1.3 Hóa chất thí nghiệm 23 2.1.4 Các môi trường dinh dưỡng 23 2.1.5 Thiết bị 24 2.2 Phương pháp phân tích 24 IV 2.2.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn sinh nattokinase 24 2.2.2 Phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào vi sinh vật 25 2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng hoạt lực enzyme phân giải fibrin 25 2.2.4 Phương pháp xác định độ nhớt canh trường lên men 26 2.2.5 Phương pháp phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) 26 2.2.6 Phương pháp xác định nồng độ đường khử 26 2.2.7 Phương pháp điện di SDS – PAGE 27 2.2.8 Định danh chủng phương pháp 16S rRNA 27 2.2.9 Xác định mật độ tế bào thông qua giá trị OD 600nm 28 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 28 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Hoạt hóa tăng sinh chủng 29 2.4.2 Sàng lọc thứ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme NK phương pháp lên men lỏng 29 2.4.3 Sàng lọc thứ cấp chủng tạo độ nhớt thấp 30 2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện lên men tới khả sinh tổng hợp NK độ nhớt chủng TVY.04 30 2.4.5 Sàng lọc yếu tố môi trường ảnh hường tới hoạt lực độ nhớt chủng sản xuất 31 2.4.6 Tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men phương pháp đáp ứng bề mặt 31 2.4.7 Kiểm chứng thí nghiệm thiết bị bioreactor quy mô L 32 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh nattokinase 33 3.1.1 Sàng lọc sơ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme protease 33 3.1.2 Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí hoạt lực NK cao 37 3.1.3 Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí độ nhớt thấp 38 3.1.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng TVY.04 38 3.1.5 Định danh chủng phương pháp 16S rRNA 39 3.1.6 Phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) 41 3.1.7 Phân tích protein ngoại bào 41 V 3.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện lên men tới khả sinh tổng hợp NK độ nhớt chủng TVY.04 42 3.2.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc 42 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men 43 3.2.3 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống theo giá trị OD 600nm 44 3.3 Tối ưu hóa yếu tố mơi trường ảnh hưởng tới hoạt lực NK độ nhớt chủng TVY.04 phương pháp đáp ứng bề mặt 45 3.3.1 Sàng lọc thành phần môi trường Minimum-Run screening 45 3.3.2 Tối ưu hóa hàm lượng yếu tố lựa chọn RSM 48 3.3.3 So sánh chủng B amyloliquefaciens TVY.04 với chủng đối chứng 54 3.4 Kiểm chứng thí nghiệm Bioreactor quy mơ L 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 65 VI DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số nghiên cứu nattokinase Việt Nam Bảng 1.2: Enzyme phân giải fibrin từ chủng vi khuẩn khác Bảng 1.3: Các nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK từ thực phẩm lên men Bảng 1.4: Nồng độ thành phần môi trường lên men 12 Bảng 1.5: Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt lực NK lên men 14 Bảng 1.6: Khối lượng phân tử γ-PGA từ số chủng vi khuẩn khác [73, 74] 15 Bảng 1.7: Tóm tắt đặc tính số vi khuẩn Bacillus sản xuất γ-PGA [68] 17 Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng môi trường 23 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số chủng phân lập 34 Bảng 3.2: Kết thí nghiệm dựa thiết kế Minimum-Run resolution IV screening 45 Bảng 3.3: Phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố lựa chọn tới hoạt lực enzyme 46 Bảng 3.4: Phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố lựa chọn tới độ nhớt47 Bảng 3.5: Bảng kết thí nghiệm thực nghiệm tối ưu sử dụng Box – Behnken design 48 Bảng 3.6: Kết phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố đến hoạt lực enzyme 49 Bảng 3.7: Kết phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố đến độ nhớt 51 VII DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Thơng kê số lượng nghiên cứu (cộng dồn) với từ khóa “Nattokinase” sở liệu Science Direct khoảng thời gian từ 1988 – 2022 Hình 1.2: Infographic phân bố nghiên cứu nattokinase theo quốc gia Hình 1.3: Thống kê tỷ lệ nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK theo quốc gia tổng số 42 báo khoa học Hình 1.4: Natto-Đậu nành lên men [10] Hình 1.5: Cấu trúc không gian nattokinase [15] Hình 1.6: Sự phân bố nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp NK [39] Hình 1.7: Tương lên men truyền thống Việt Nam 10 Hình 1.8: Thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp NK 11 Hình 1.9: Cấu trúc γ-PGA [69] 15 Hình 1.10: a) Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA; b) Các gen sinh tổng hợp γ-PGA Bacillus spp [75] 18 Hình 3.1: Khuẩn lạc thu sau 24h phân lập môi trường LBS agar với mẫu khác 33 Hình 3.2: Hoạt lực enzyme phân giải fibrin 40 chủng phân lập 37 Hình 3.3: Độ nhớt canh trường sau lên men từ chủng 38 Hình 3.4: Ảnh khuẩn lạc đĩa LBS agar (A) nhuộm Gram (B) 39 Hình 3.5: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA chủng TVY.04 39 Hình 3.6: Kết so sánh trình tự chủng TVY.04 ngân hàng Genbank 40 Hình 3.7: Sắc ký mỏng sản phẩm thủy phân EPS 41 Hình 3.8: Điện di đồ enzyme thơ (giếng 1: marker protein; giếng 2: enzyme thô) 41 Hình 3.9: Ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả sinh tổng hợp enzyme độ nhớt chủng TVY.04 42 Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men tới khả sinh tổng hợp enzyme NK độ nhớt chủng TVY.04 43 Hình 3.11: Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống tới khả sinh tổng hợp enzyme NK độ nhớt chủng TVY.04 44 Hình 3.12: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng thông số đầu vào tới khả sinh tổng hợp NK chủng B amyloliquefaciens TVY.04 50 Hình 3.13: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng thơng số đầu vào tới q trình sản xuất độ nhớt chủng B amyloliquefaciens TVY.04 52 Hình 3.14: Kết lên men kiểm chứng lại dự đốn mơ hình 53 VIII Hình 3.15: Kết so sánh hoạt lực NK độ nhớt chủng B amyloliquefacines TVY.04 chủng đối chứng B subtilis D 54 Hình 3.16: Các thông số vận hành lên men thiết bị L chứa L môi trường tối ưu 55 Hình 3.17: Kết lên men theo mẻ chủng B amyloliquefaciens TVY.04 quy mô thiết bị L với L môi trường 56 IX có độ tin cậy cao giá trị p hai yếu tố 0,0004 0,0145 nhỏ 0,05 Bên cạnh đó, mơ hình khơng thành cơng đánh giá xác ảnh hưởng glucose độ nhớt chủng TVY.04 sản xuất độ tin cậy liệu đánh giá glucose thấp, p > 0,05 Mặc dù vậy, thực tế glucose ảnh hưởng tới độ nhớt thí nghiệm sàng lọc Mục 3.3.1 phần khẳng định vai trò glucose độ nhớt Giá trị F thiếu phù hợp 15,15 thiếu phù hợp khơng có ý nghĩa giá trị p = 0,0625 > 0,05 Vì vậy, kết luận mơ hình phản ánh xác mối quan hệ yếu tố Phương trình hồi quy mơ hình độ nhớt biểu diễn sau: Y2 = 3,62 + 0,14875X1 + 0,4775X2 + 0,26375X3 + 0,01X1X2 + 0,0225X2X3 – 0,44X2X3 + 0,76875X12 + 0,96625X22 – 0,19625X32 (cP) Phương trình theo biến thực độ nhớt canh trường : Độ nhớt (cP) = +3,10583 – 0,065661*Glucose – 0,108707*Peptone + 0,328075*CaCl2 + 0,000033*Glucose*Peptone + 0,000188*Glucose*CaCl2 – 0,007040*Peptone*CaCl2 + 0,001335*Glucose2 + 0,006184*Peptone2 – 0,007850*CaCl22 Mối quan hệ hai yếu tố độc lập biểu diễn thông qua biểu đồ bề mặt đáp ứng (3D) giữ yếu tố lại mức (Hình 3.15) A B Hình 3.13: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng thông số đầu vào tới trình sản xuất độ nhớt chủng B amyloliquefaciens TVY.04 C A: Glucose Peptone; B: Glucose CaCl2; C: Peptone CaCl2 52 Từ đồ thị bề mặt đáp ứng nhận thấy điểm tối ưu nằm vùng màu xanh dương độ nhớt thấp Chính vậy, độ nhớt canh trường giảm đạt nồng độ peptone CaCl2 giảm giá trị độ nhớt thấp đạt nồng độ peptone khoảng từ g/L đến 20 g/L nồng độ CaCl2 nằm khoảng – g/L (Hình 3.13C) Độ nhớt canh trường sau lên men giảm hàm lượng đường tăng, vượt qua nồng độ tối ưu độ nhớt sản xuất chủng TVY.04 tăng (Hình 3.13A, B) Dựa kết phân tích liệu thực nghiệm, mơ hình đưa hàm lượng tối ưu cho yếu tố đế thỏa mãn hai yêu cầu: hàm lượng NK thu tối đa độ nhớt thu tối thiểu Từ đó, hàm lượng tối ưu cho yếu tố là: 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, g/L CaCl2 Do thành phần mơi trường GPY sau tối ưu gồm 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, g/L CaCl2, 10 g/L cao nấm men, 5g/L NaCl, g/L K2HPO4 Tiến hành lên men chủng B amyloliquefaciens TVY.04 môi trường sau tối ưu so sánh với kết dự đoán từ phần mềm (Hình 3.14) Hình 3.14: Kết lên men kiểm chứng lại dự đốn mơ hình Từ đồ thị Hình 3.14 cho thấy, điều kiện lên men với môi trường tối ưu, hoạt lực enzyme NK độ nhớt canh trường phần mềm dự đoán 214,42 FU/mL 3,59 cP; theo thực nghiệm, hoạt lực NK đạt 210,47 ± 4,36 FU/mL sau 24 lên men Kết hoạt lực NK thực nghiệm sát với kết dự đoán phần mềm Tuy nhiên, độ nhớt canh trường thu từ thực nghiệm có sai lệch nhỏ (khoảng 10%) so với độ nhớt dự đoán từ phần mềm độ nhớt thực tế đo 4,08 ± 0,00 cP Sự sai khác đến từ việc mơ hình chưa thể đánh giá cách đáng tin cậy ảnh hưởng glucose đến độ nhớt dịch lên men (p = 0,1058) 53 3.3.3 So sánh chủng B amyloliquefaciens TVY.04 với chủng đối chứng Tiến hành lên men hai chủng B amyloliquefaciens TVY.04 B subtilis D môi trường tối ưu cho chủng so sánh hoạt lực NK, độ nhớt chủng tạo thành Kết thu được thể Hình 3.15 Hình 3.15: Kết so sánh hoạt lực NK độ nhớt chủng B amyloliquefacines TVY.04 chủng đối chứng B subtilis D Thông qua kết so sánh hai chủng thể Hình 3.15 cho thấy chủng B subtilis D sinh tổng hợp NK cho hoạt lực enzyme (732 ± 12 FU/mL) cao gấp xấp xỉ 3,5 lần hoạt lực NK từ chủng B amyloliquefaciens TVY.04 Đồng thời, độ nhớt canh trường chủng D sản xuất đạt 4,44 ± 0,00 cP, cao 10% so với độ nhớt tạo chủng TVY.04 3.4 Kiểm chứng thí nghiệm Bioreactor quy mô L Để nâng quy mô lên men nhằm mục đích tăng khả sinh tổng hợp NK quan sát thay đổi độ nhớt lên men quy mô thiết bị, đồng thời theo dõi phát triển chủng theo thời gian, chủng B amyloliquefacines TVY.04 lên men thiết lên men L với thể tích L mơi trường tối ưu Các thông số lên men kết thu từ lên men theo mẻ trình bày Hình 3.16 3.17 54 Hình 3.16: Các thông số vận hành lên men thiết bị L chứa L môi trường tối ưu Nhiệt độ lên men trì 37⁰C suốt trình lên men Từ đồ thị Hình 3.16 cho thấy đầu lên men, pO2 giảm nhanh chóng xuống xấp xỉ 20% lúc chủng bước vào pha tăng trưởng nên nhu cầu oxi cao Tuy nhiên sau thời điểm lên men kết thúc pha tăng trưởng vào thời điểm 15 giờ, pO2 trì giá trị trì 20% Điều lượng oxi hịa tan thiết bị lên men đủ đáp ứng nhu cầu chủng B amyloliquefaciens TVY.04 Bước vào pha cân sau 15 lên men, pO2 tiếp tục trì 20% pha chủng khơng có nhu cầu cao oxi thời điểm sau 24 lên men pO2 bắt đầu tăng OD 600nm giảm kết thúc trình lên men pO2 đạt 40,23% pH môi trường lên men trì giá trị 7,0 HCl 2N NaOH 2N NaOH thêm nhanh vào môi trường lên men sau thời điểm lên men Đây khoảng thời gian chủng pha tăng trưởng Do đó, chủng sử dụng nguồn glucose để sinh trưởng, phát triển đồng thời tạo axit hữu khiến cho pH môi trường giảm [100] Tuy nhiên từ thời điểm 11 lên men, NaOH không bổ sung thêm vào môi trường trùng hợp khoảng thời gian hoạt lực enzyme NK bắt đầu tăng nhanh Sau thời điểm này, NaOH tiếp tục thêm vào mơi trường suốt q trình sinh trưởng chủng thời thời điểm 20 sau lên men dừng lại axit HCl bắt đầu bơm vào mơi trường Q trình xảy trùng với giai đoạn chủng TVY.04 tích lũy nhiều enzyme pha cân việc tích lũy enzyme diễn chủng sử dụng nguồn nitơ từ peptone cao nấm men để sinh tổng hợp enzyme, sinh ion NH4+ làm pH mơi trường tăng [100], lúc axit HCl 2N thêm vào mơi trường để cân pH 55 Hình 3.17: Kết lên men theo mẻ chủng B amyloliquefaciens TVY.04 quy mô thiết bị L với L môi trường Từ kết quả lên men theo mẻ thiết bị L thể Hình 3.17 rút kết luận trình lên men chủng TVY.04 sau:  Pha tăng trưởng chủng TVY.04 kéo dài từ tới 15 lên men Tuy nhiên, chủng phát triển nhanh khoảng thời gian từ đến lên men sau phát triển chậm dần tới 15 trước bước vào pha cân  Pha cân chủng 16 tới 24 sau lên men Hoạt lực enzyme đạt cao trì pha cân  OD600nm chủng cao đạt cuối pha cân thời điểm 24 lên men, thời điểm OD 600nm đạt 28,83 ± 0,07 Kết thúc trình lên men OD 600nm đạt 27,03 ± 0,12 Chủng có xu hướng sinh enzyme pha tăng trưởng hoạt lực NK chủng bắt đầu tăng nhanh sau 7h lên men đạt hoạt lực NK cao pha cân Hoạt lực trung bình enzyme suốt pha cân đạt 433 FU/mL, hoạt lực NK đạt giá trị cao 460 ± 12 FU/mL thời điểm cuối pha cân Kết thúc trình lên men hoạt lực giảm 424 ± FU/mL Sự tăng hoạt lực enzyme chủng sinh phù hợp với phát triển chủng chứng tỏ chủng tiết enzyme ngoại bào đồng thời với trình tăng sinh khối Hoạt lực enzyme lên men thiết bị tăng 50% so với lên men bình tam giác thời điểm 24 sau lên men Cùng với trình sản xuất enzyme, chủng tạo độ nhớt Độ nhớt canh trường chủng sản xuất bắt đầu đo từ thời điểm sau lên men nhận thấy độ nhớt chủng tạo tăng pha tăng trưởng chậm dần, đạt giá trị cao 5,91 ± 0,03 cP sau 14 lên men Tới pha cân (từ thời điểm 16 lên 56 men), độ nhớt sản xuất bắt đầu giảm dần đạt giá trị thấp kết thúc trình lên men độ nhớt canh trường, 4,37 ± 0,03 cP Tại thời điểm 24h hoạt lực enzyme NK đạt cao độ nhớt canh trường thời điểm có giá trị gần tương đương với thời điểm kết thúc trình lên men đạt 4,41 ± 0,00 cP, tăng khoảng 10% so với lên men bình tam giác Xu hướng giảm dần độ nhớt pha cân giải thích Kimura cộng (2010) Theo đó, nhóm tác giả lí giải chủng B subtilis natto – lồi có quan hệ gần gũi với lồi B amyloliquefaciens có khả sinh γ–PGA giai đoạn đầu pha cân cách để trữ nguồn dinh dưỡng đến giai đoạn sau pha cân nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, chủng sinh enzyme GGT (γ-glutamyltranspeptidase) giúp phân hủy γ–PGA thành glutamate trở thành nguồn dinh dưỡng cho tế bào, độ nhớt canh trường giảm Từ Hình 3.17 thấy giảm hàm lượng glucose phù hợp với phát triển chủng Trong pha tăng trưởng, chủng phát triển mạnh mẽ lượng glucose tiêu hao cách đáng kể Kết thúc pha tăng trưởng, hàm lượng glucose cịn lại mơi trường xấp xỉ 15 g/L Tuy nhiên, chủng bước vào pha cân (từ 16 đến 24 giờ), tiêu thụ glucose tiếp tục diễn Lí giải cho giảm hàm lượng đường pha cân bằng, chủng khơng cịn sử dụng nguồn cacbon nhiều pha tăng trưởng chủng cần glucose để tạo lượng nhỏ lượng giúp trì tế bào tạo sản phẩm, tiêu thụ glucose tiếp diễn Cuối pha cân (24 giờ) hàm lượng đường cịn lại mơi trường 6,9 ± 0,04 g/L Sau 24 lên men, OD600nm giảm, chủng vào pha suy vong nhu cầu dinh dưỡng khơng cịn Chính vậy, lượng đường cịn lại kết thúc lên men thời điểm 26 6,9 ± 0,04 g/L 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập tuyển chọn chủng TVY.04 từ tương truyền thống Việt Nam có hoạt lực NK cao đạt 98,5 ± 3,5 FU/mL, đồng thời có độ nhớt thấp 3,87 ± 0,03 cP Từ kết định danh 16S rRNA, chủng đề xuất gọi tên Bacillus amyloiquefaciens TVY.04 Khảo sát số điều kiện lên men ảnh hưởng tới tới khả sinh tổng hợp enzyme NK độ nhớt chủng B amyloiquefaciens TVY.04 thu được: – Tốc độ lắc: 150 rpm – Nhiệt độ lên men: 37ºC – Tỉ lệ cấp giống: OD600 nm = 0,2 Các điều kiện lên men thu giúp chủng sinh tổng hợp NK đạt hoạt lực cao đồng thời độ nhớt đạt thấp Thành phần môi trường lên men tối ưu hóa phương pháp đáp ứng bề mặt nhằm tăng hoạt lực NK giảm độ nhớt canh trường gồm: 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, g/L CaCl2,10 g/L cao nấm men, g/L NaCl, g/L K2HPO4 Lên men theo mẻ chủng B amyloiquefaciens TVY.04 thiết bị L chứa L môi trường tối ưu thu đươc số kết sau: – OD600 nm đạt 28,83 ± 0,07 sau 24 lên men – Hoạt lực NK cao đạt 460 ± 12 FU/mL thời điểm 24 lên men, tăng 50% so với hoạt lực NK lên men bình tam giác – Độ nhớt canh trường đạt 4,41 ± 0,00 cP cao 10% so với bình tam giác thời điểm 24 lên men KIẾN NGHỊ Tiến hành lặp quy hoạch thực nghiệm để đánh giá đầy đủ vai trò ảnh hưởng yếu tố tới khả sinh tổng hợp enzyme NK độ nhớt canh trường sau lên men chủng tạo thành Lên men fed-batch kéo dài pha tăng trưởng giúp tăng hoạt lực enzyme NK 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]Đ T H Tuyến, L T B Phượng, L T N Anh, and N T M Trang, "Phân lập vi khuẩn cho hoạt tính nattokinase cao khảo sát ảnh hưởng số yếu tố q trình lên men thu nhận nattokinase," Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một, vol 4, pp 55-62, 2017 [2]D N A Huy, P A Hao, and P V Hung, "Screening and identification of Bacillus sp isolated from traditional Vietnamese soybean-fermented products for high fibrinolytic enzyme production," International Food Research Journal, vol 23, pp 326-331, 2016 [3]T Q Tuan, L T T Ai, D M Hiep, and T C Dong, "Purification and characterization of recombinant nattokinase from Bacillus subtilis," Tạp chí Sinh học, vol 37, pp 75-84, 2015 [4]N A Tuan, D T H Thuan, T T M Tam, and N T Huong, "Determination the optimum fermentation in obtaining nattokinase by Bacillus subtilis natto," International Journal of Innovation and Applied Studies, vol 13, no 3, pp 663-668, 2015 [5]N A Tuan and N T Huong, "Optimization of the fermentation medium to receive the highest biomass yield By Bacillus Subtilis Natto and the initial test of nattokinase yield," IOSR Journal of Engineering, vol 04, pp 35-040, 2014 [6]B T Nhung and N H Phuoc, "Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ Natto Nhật Bản làm giống sản xuất Natto," Journal of Thu Dau Mot University, vol 1, pp 38-43, 2014 [7]L T Bich Phuong, V T Hanh, T T Phong, L T Hung, T T Hong Van, and L T Huong, "Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase," Tạp chí Sinh học, 2012 [8]N L Huong, H T Phuong, and P Q Luan, "Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật tổng hợp enzyme nattokinase từ số thực phẩm đậu tương lên men," Tạp chí khoa học cơng nghệ trường đại học kỹ thuật, vol 81, pp 175-179, 2011 [9]B T Thanh, D T Hang, P T Anh, and N L Huong, "Enhanced production of fibrinolytic enzyme by Bacillus sp isolated from Vietnamese traditional fermented soybean (Tuong ban) using ultraviolet irradiation and chemical Mutation," International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, vol 11, pp 67-80, 2022 [10]Y Weng, J Yao, S Sparks, and K Y Wang, "Nattokinase: An oral antithrombotic agent for the prevention of cardiovascular disease," International journal of molecular sciences, vol 18, no 3, pp 523-541, 2017 [11]B Furie and B C Furie, "Mechanisms of thrombus formation," N Engl J Med, vol 359, no 9, pp 938-49, 2008 [12]H Sumi, H Hamada, H Tsushima, H Mihara, and H Muraki, "A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet," Experientia, vol 43, no 10, pp 1110-1111, 1987 [13]H Chen, M E McGowan, N Ren, S Lal, N Nassif, F Shad-Kaneez, X Qu, Y Lin, "Nattokinase: A promising alternative in prevention and treatment of cardiovascular diseases," Biomarker insights, vol 13, pp 130-148, 2018 [14]F Dabbagh, M Negahdaripour, A Berenjian, A Behfa, F Mohammadi, M Zamani, C Irajie, Y Ghasemi, "Nattokinase: production and application," Appl Microbiol Biotechnol, vol 98, no 22, pp 9199-9206, 2014 [15]Y Yanagisawa, T Chatake, K Chiba-Kamoshida, S Naito, T Ohsugi, H Sumi, I Yasuda, Y Morimoto, "Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto," Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, vol 66, no Pt 12, pp 1670-3, 2010 [16]C Wang, M Du, D Zheng, F Kong, G Zu, and Y Feng, "Purification and characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 57, no 20, pp 9722-9729, 2009 59 [17]M Milner and K Makise, "Natto and its active ingredient nattokinase: a potent and safe thrombolytic agent," Alternative and Complementary Therapies, vol 8, pp 157-164, 2002 [18] Y Kurosawa, S Nirengi, T Homma, K Esaki, M Ohta, J F Clark, T Hamaoka, "A single-dose of oral nattokinase potentiates thrombolysis and anti-coagulation profiles," Scientific reports, vol 5, pp 11601-11608, 2015 [19]E Kotb, "Activity assessment of microbial fibrinolytic enzymes," Appl Microbiol Biotechnol, vol 97, no 15, pp 6647-6665, 2013 [20]D Yogesh and P M Halami, "Fibrinolytic enzymes of Bacillus spp.: An overview," International Food Research Journal, vol 24, pp 35-47, 2017 [21]Y Peng, Q Huang, R H Zhang, and Y Z Zhang, "Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food," Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, vol 134, no 1, pp 45-52, 2003 [22]W K C Kim, K H Kim, Y Park, H H Choi, J Y Lee, Y S Oh, H I Kwon, I B Lee, S E., "Purification and Characterization of a Fibrinolytic Enzyme Produced from Bacillus sp strain CK 11-4 Screened from Chungkook-Jang," Applied and environmental microbiology, vol 62, pp 2482-2488, 1996 [23]H D Jo, H Lee, S J Jeong, and J Kim, "Purification and characterization of a major fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 isolated from Meju," Journal of microbiology and biotechnology, vol 21, pp 11661173, 2011 [24]A Montriwong, S Kaewphuak, S Rodtong, S Roytrakul, and J Yongsawatdigul, "Novel fibrinolytic enzymes from Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7 isolated from fish sauce fermentation," Process Biochemistry, vol 47, no 12, pp 2379-2387, 2012 [25] F Lu, Z Lu, X Bie, Z Yao, Y Wang, Y Lu, Y Guo, "Purification and characterization of a novel anticoagulant and fibrinolytic enzyme produced by endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3," Thrombosis Research, vol 126, no 5, pp 349-355, 2010 [26] X Wei, M Luo, L Xu, Y Zhang, X Lin, P Kong, H Liu, "Production of fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens by fermentation of chickpeas, with the evaluation of the anticoagulant and antioxidant properties of chickpeas," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 59, no 8, pp 3957-3963, 2011 [27]J Yuan, J Yang, Z Zhuang, Y Yang, L Lin, and S Wang, "Thrombolytic effects of Douchi fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis LD-8547 in vitro and in vivo," BMC Biotechnology, vol 12, no 1, pp 36-45, 2012 [28]M G B Pagnoncelli, M J Fernandes, C Rodrigues, and C R Soccol, "22 Nattokinases," in Current Developments in Biotechnology and Bioengineering, pp 509-526, 2017 [29]S Ethiraj, "Nattokinase: An updated critical review on challenges and perspectives," Cardiovascular & Hematological Agents in Medicinal Chemistry, vol 16, 2017 [30]Y Mine, A H K Wong, and B Jiang, "Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods," Food Research International, vol 38, no 3, pp 243-250, 2005 [31]Y Inatsu, N Nakamura, Y Yuriko, T Fushimi, L Watanasiritum, and S Kawamoto, "Characterization of Bacillus subtilis strains in Thua nao, a traditional fermented soybean food in northern Thailand," Letters in Applied Microbiology, vol 43, no 3, pp 237-242, 2006 [32]Y T Kim, W K Kim, and H I Oh, "Screening and identification of the fibrinolytic bacterial strain from Chungkook-jang," Korean J Appl Microbiol Biotechnol., vol 23, pp 1-5, 1995 [33]S Wang, C Zhang, Y Yang, M Diao, and M Bai, "Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547," World Journal of Microbiology & Biotechnology, vol 24, pp 475-482, 2008 60 [34]Y Peng, Zhang, Yizheng, "Isolation and characterization of fibrinolytic enzyme-producing strain DC-4 from chinese douchi and primary analysis of the enzyme property," Gaojishu tongxun, vol 12, no 2, pp 30-34, 2002 [35]Z Yao, X Liu, J M Shim, K W Lee, H J Kim, and J H Kim, "Properties of a fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus amyloliquefaciens RSB34, isolated from Doenjang," Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 27, no 1, pp 9-18, 2017 [36]D S Afifah, Muhammad Syah, Dahrul Suhartono, Maggy, "Malaysian journal of microbiology isolation and identification of fibrinolytic protease-producing microorganisms from Red Oncom and Gembus, Indonesian fermented soybean cakes," Malaysian Journal of Microbiology, vol 10, pp 273-279, 2014 [37]Z Yao, J A Kim, and J H Kim, "Properties of a fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus subtilis JS2 isolated from saeu (small shrimp) jeotgal," Food Sci Biotechnol, vol 27, no 3, pp 765-772, 2018 [38]M J Ahn, H J Ku, S H Lee, and J H Lee, "Characterization of a novel fibrinolytic enzyme, BsfA, from Bacillus subtilis ZA400 in kimchi reveals its pertinence to thrombosis treatment," Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 25, no 12, pp 2090-2099, 2015 [39] D Li, L Hou, M Hu, Y Gao, Z Tian, B Fan, S Li, F Wang, "Recent advances in nattokinase-enriched fermented soybean foods: A review," Foods, vol 11, no 13, pp 1867-1886, 2022 [40]P V P Devanthi and K Gkatzionis, "Soy sauce fermentation: Microorganisms, aroma formation, and process modification," Food Res Int, vol 120, pp 364-374, 2019 [41] S Ju, Z Cao, C Wong, Y Liu, M Foda, Z, Zhang, J Li, "Isolation and optimal fermentation condition of the Bacillus subtilis Subsp natto Strain WTC016 for nattokinase production," Fermentation, vol 5, pp 92-104, 2019 [42]H Vignesh, E M Basha, N G R Babu, and N Saravanan, "Production, optimization and characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis REVS12 isolated from natto," vol 5, pp 426-426, 2014 [43]L L Man, D J Xiang, and C L Zhang, "Strain screening from traditional fermented soybean foods and induction of nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6," Probiotics Antimicrob Proteins, vol 11, no 1, pp 283-294, 2019 [44]A Fadul, E Obeid, A Alawad, and H Moawia, "Isolation and characterization of Bacillus Subtillus with potential production of nattokinase," International Journal of Advanced Research (IJAR), vol 3, pp 94-101, 2015 [45]R Dubey, J Kumar, D Agrawala, T Char, and P Pusp, "Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources." African Journal of Biotechnology, vol 10, pp 1408-1420, 2010 [46]J K Wang, H H Chiu, and C S Hsieh, "Optimization of the medium components by statistical experimental methods to enhance nattokinase activity," Fooyin Journal of Health Sciences, vol 1, pp 21-27, 2009 [47]H D Paik, S K Lee, S Heo, S Y Kim, H Lee, and T J Kwon, "Purification and characterization of the fibrinolytic enzyme produced by Bacillus subtilis KCK-7 from Chungkookjang," Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 14, pp 829-835, 2004 [48]V Deepak, K Kalishwaralal, S Ramkumarpandian, S V Babu, S R Senthilkumar, and G Sangiliyandi, "Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology," Bioresource Technology, vol 99, no 17, pp 8170-8174, 2008 [49]Y H Cho, J Song, K Kim, M Kim, I Lee, S Kim, H Kim, N Han, B Lee, B S Kim, "Production of nattokinase by batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis," New biotechnology, vol 27, pp 341-346, 2010 [50]J Liu, J Xing, T Chang, Z Ma, and H Liu, "Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using 61 statistical experimental methods," Process Biochemistry, vol 40, no 8, pp 2757-2762, 2005 [51]P Chantawannakul, A Oncharoen, K Klanbut, E Chukeatirote, and S Lumyong, "Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand," Science Asia, vol 28, 2002 [52]X Zhang, L J Yun, L P Peng, Y Lu, K P Ma, and F Tang, "Optimization of douchi fibrinolytic enzyme production by statistical experimental methods," Journal of Huazhong University of Science and Technology vol 33, no 1, pp 153-158, 2013 [53]Y Hu, D Yu, Z Wang, J Hou, R Tyagi, Y Liang, Y Hu, "Purification and characterization of a novel, highly potent fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis DC27 screened from Douchi, a traditional Chinese fermented soybean food," Scientific Reports, vol 9, no 1, pp 9235-9245, 2019 [54]S S V Devchand N Avhad, Virendra K Rathod, "A novel fibrinolytic enzyme from Bacillus Sphaericus MTCC 3672: Optimization and purification studies," American Journal of Current Microbiology, p 1-13, 2013 [55]C T Wang, B P Ji, B Li, R Nout, P L Li, H Ji, and L F Chen, "Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional Douchi," Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, vol 33, no 9, pp 750-758, 2006 [56]B Aydin, M Raja, K John, D Fariba, G Younes "Nattokinase production: medium components and feeding strategy studies," Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterly, vol 20, pp 541-547, 2014 [57]P S Rasagnya and M Vangalapati, "Studies on optimization of process parameters for nattokinase production by Bacillus subtilis NCIM 2724 and purification by liquid-liquid extraction," International Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technology, vol 2, no 9, pp 45164521, 2013 [58]D M Kumar, R Rakshitha, M A Vidhya, P S Jennifer, S Prasad, M R Kumar, P T Kalaichelvan "Production, optimization and characterization of fibrinolytic enzyme by Bacillus subtilis RJAS19," Pakistan Journal of Biological Sciences, vol 17, no 4, pp 529-534, 2014 [59]L L Hu, J Li, Y F, Zhang, W Z Yang, "Optimization of liquid fermentation conditions of nattokinase," National Knowledge Infrastructure，NKI, China, 2011 [60]L Medina, M Almeida, J Silva, M Melo, M A Celligoi, and J Vignoli, Produỗóo de Nattokinase por Bacillus subtilis natto em Diferentes Fontes de Carbono e Nitrogênio 2015, pp 287-290 [61]P M Mahajan, S V Gokhale, and S S Lele, "Production of nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: Media optimization, scale up, and kinetic modeling," Food Science and Biotechnology, vol 19, no 6, pp 1593-1603, 2010 [62]H M Zhou, H X Zhang, Y H Xie, T T Zhou, H Liu, and Y B Luo, "Optimization of liquid fermentation conditions and encapsulation for nattokinase production," Advanced Materials Research, vol 781-784, pp 1403-1409, 2013 [63]X Wang, L Yang, H Yang, and Z Tu, "A kind of Fibrinolytic Enzyme in Douchi and its training method processed," Patent, 2017 [64]J G Park, Y S Noh, S G Nam, and S H Jin, "Fibrinolytic enzyme derived from Bacillus sp HLN-21 strain and, isolation and purification method thereof," Patent, 2002 [65]H T V Lin, G J Wu, M C Hsieh, S H Chang, and G J Tsai, "Purification and characterization of nattokinase from cultural filtrate of red alga porphyra dentata fermented by Bacillus subtilis N1," Journal of Marine Science and Technology (Taiwan), vol 23, pp 240-248, 2015 [66]E Y Kwon, K M Kim, M K Kim, I Y Lee, and B S Kim, "Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis," vol 34, pp 789-793, 2011 62 [67]R Wu, G Chen, S Pan, J Zeng, and Z Liang, "Cost-effective fibrinolytic enzyme production by Bacillus subtilis WR350 using medium supplemented with corn steep powder and sucrose," Scientific Reports, vol 9, 2019 [68]S Sirisansaneeyakul, M Cao, N Kongklom, C Chuensangjun, Z Shi, and Y Chisti, "Microbial production of poly-γ-glutamic acid," World J Microbiol Biotechnol, vol 33, no 9, p 173, 2017 [69]Q Wang, X Wei, and S Chen, "30 - Production and application of poly-γglutamic acid," Biotechnology and Bioengineering, pp 693-717 2017 [70]D H Li, H Lizhen, Y Gao, Z Tian, B Fan, Wang and S Li, "Recent advances in microbial synthesis of poly-gamma-glutamic acid: A Review," Foods, vol 11, no 5, pp 739-758, 2022 [71]A Ogunleye, A Bhat, V U Irorere, D Hill, C Williams, and I Radecka, "Poly-γ-glutamic acid: production, properties and applications," Microbiology (Reading), vol 161, no 1, pp 1-17, 2015 [72]A Richard and A Margaritis, "Rheology, oxygen transfer, and molecular weight characteristics of poly (glutamic acid) fermentation by Bacillus subtilis," Biotechnol Bioeng, vol 82, no 3, pp 299-305, 2003 [73]Y Peng, B Jiang, T Zhang, W Mu, M Miao, and Y Hua, "High-level production of poly(γ-glutamic acid) by a newly isolated glutamateindependent strain, Bacillus methylotrophicus," Process Biochemistry, vol 50, no 3, pp 329-335, 2015 [74]I L Shih and Y T Van, "The production of poly-(γ-glutamic acid) from microorganisms and its various applications," Bioresource Technology, vol 79, no 3, pp 207-225, 2001 [75]P Nair, G R Navale, and M S Dharne, "Poly-gamma-glutamic acid biopolymer: a sleeping giant with diverse applications and unique opportunities for commercialization," Biomass Conversion and Biorefinery, pp 1-19, 2021 [76]Z Luo, Y Gou, J Liu, H, Qiu, M Zhao, W Zou, S Li, "Microbial synthesis of poly-γ-glutamic acid: current progress, challenges, and future perspectives," Biotechnology for Biofuels, vol 9, no 1, pp 134-146, 2016 [77]S B Silva, V V Cantarelli, and M A Ayub, "Production and optimization of poly-γ-glutamic acid by Bacillus subtilis BL53 isolated from the Amazonian environment," Bioprocess Biosyst Eng, vol 37, no 3, pp 469479, 2014 [78]G A Birrer, A M Cromwick, and R A Gross, "γ-Poly(glutamic acid) formation by Bacillus licheniformis 9945a: physiological and biochemical studies," International Journal of Biological Macromolecules, vol 16, no 5, pp 265-275, 1994 [79]N Kongklom, H Luo, Z Shi, C Pechyen, Y Chisti, and S Sirisansaneeyakul, "Production of poly-γ-glutamic acid by glutamic acid-independent Bacillus licheniformis TISTR 1010 using different feeding strategies," Biochemical Engineering Journal, vol 100, pp 67-75, 2015 [80]J R Ogez, J C Hodgdon, M P Beal, and S E Builder, "Downstream processing of proteins: Recent advances," Biotechnology Advances, vol 7, no 4, pp 467-488, 1989 [81]K G Clarke, "11 - Downstream processing," Bioprocess Engineering, pp 209-234, 2013 [82] "Investigation of poly(γ-glutamic acid) production via online determination of viscosity and oxygen transfer rate in shake flasks," Journal of Biological Engineering, vol 11, pp 23-39, 2017 [83] L R N Meissner, J Arndt, T G Palmen, T Jesstel, H Mitsunaga, E Fukusaki, J Buchs, "Investigation of poly(γ-glutamic acid) production via online determination of viscosity and oxygen transfer rate in shake flasks," Journal of biological engineering, vol 11, pp 23-23, 2017 [84]L L Wang, J T Chen, L F Wang, S Wu, G Z Zhang,,, HHH Q Yu, X D Ye, Q S Shi, "Conformations and molecular interactions of poly-γglutamic acid as a soluble microbial product in aqueous solutions," Scientific Reports, vol 7, no 1, pp 12787-12798, 2017 63 [85]G Nie, Z Zhu, F Liu, Z Nie, Y Ye, and W Yue, "Co-production of nattokinase and poly (γ-glutamic acid) under solid-state fermentation using soybean and rice husk," Brazilian Archives of Biology and Technology, vol 58, pp 718-724, 2015 [86]M Li, Z Zhang, S Li, Z Tian, and X Ma, "Study on the mechanism of production of γ-PGA and nattokinase in Bacillus subtilis natto based on RNAseq analysis," Microbial cell factories, vol 20, no 1, pp 83-98, 2021 [87]L Wang, N Liu C Yu, J Chen, K Hong, Y Zang, M Wang, G Nie "Inhibition of nattokinase against the production of poly (γ-glutamic Acid) in Bacillus subtilis natto," Biotechnology Letters, vol 42, no 11, pp 2285-2291, 2020 [88]J P Tamang and S Nikkuni, "Selection of starter cultures for the production of kinema, a fermented soybean food of the Himalaya," World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 12, no 6, pp 629-635, 1996 [89]A Goto and M Kunioka, "Biosynthesis and hydrolysis of poly(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis IF03335," Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, vol 56, no 7, pp 1031-1035, 1992 [90]D.Y Song, L V Reddy, D Charalampopoulos, and Y J Wee, "Poly-(γglutamic acid) production and optimization from agro-industrial bioresources as renewable substrates by Bacillus sp FBL-2 through response surface methodology," Biomolecules, vol 9, no 12, pp 754-766, 2019 [91]G L Miller, "Use of Dinitrosalicylic Acid reagent for determination of reducing sugar," Analytical Chemistry, vol 31, no 3, pp 426-428, 1959 [92]S Mesapogu, C M Jillepalli, and D K Arora, "Agarose gel electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis: Methods and principles," in Analyzing Microbes: Manual of Molecular Biology Techniques, pp 73-91, 2013 [93]U K Laemmli, "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4," Nature, vol 227, no 5259, pp 680-685, 1970 [94]J Rajaselvam, N Benit, S S Alotaibi, M A Rathi, S Srigopalram, G D Biji, P Vijayarahavan, "In vitro fibrinolytic activity of an enzyme purified from Bacillus amyloliquefaciens strain KJ10 isolated from soybean paste," Saudi Journal of Biological Sciences, vol 28, no 8, pp 4117-4123, 2021 [95]G H Kwon, H A Lee, J Y Park, J S Kim, J Lim, C S Park, D Y Kwon, Y S Kim, J H Kim, "Development of a RAPD-PCR method for identification of Bacillus species isolated from Cheonggukjang," International Journal of Food Microbiology, vol 129, no 3, pp 282-287, 2009 [96]M S Ngalimat, R S R Yahaya, M M A Baharudin, S M Yaminudin, M Karim, S A Ahmad, S Sabri, "A review on the biotechnological applications of the operational group Bacillus amyloliquefaciens," Microorganisms, vol 9, no 3, pp 614-632, 2021 [97]P Thapa, A Thapa, S Khadka, S Sapkota, O P Panta, S Sharma, T B Karki, P Poudel, "Screening and characterization of potent poly glutamic acid producing Bacillus sp isolated from Kinema, water and soil samples," Heliyon, vol 7, no 8, pp 7715-7723, 2021 [98]F S Peter, W Allan, and J H Stephen, "Principles of fermentation technology," Elsevier Science & Technology: Amsterdam, The Netherlands, 2016 [99]R G Gad, S Nirmala, and S N Sivvaswamy, "Fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens: optimization and scale up studies," International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol 6, no 10, pp 370378, 2014 [100]T Suzuki, T Yamane, and S Shimizu, "Phenomenological background and some preliminary trials of automated substrate supply in pH-stat modal fedbatch culture ssing a setpoint of high limit," Journal of Fermentation and Bioengineering, vol 69, no 5, pp 292-297, 1990 64 PHỤ LỤC Đường chuẩn tyrosine: Xây dụng đường chuẩn tyrosine: chuẩn bị dải nồng độ tyrosine từ – 60 µg/L tiến hành đo độ hấp thụ bước sóng 275 nm Theo đường chuẩn tính độ tăng độ hấp thụ bước song 275 nm ứng với độ tăng nồng độ tyrosine µg/L (a) Nồng độ tyrosine (µl/mL) 12 24 30 60 Vtyrosine (µl) 20 40 80 100 200 Vnước (µl) Vtổng (mL) 1980 1960 1920 1900 1800 2 2 Đồ thị đường chuẩn tyrosine: Đường chuẩn glucose: Đồ thị đường chuẩn glucose: 65 Đường chuẩn OD 600nm – CFU Sự phát triển chủng biểu diễn thông qua kết OD 600nm mật độ tế bào (CFU/mL) theo thời gian nhân giống Đường cong sinh trưởng chủng B amyloliquefaciens TVY.04 Từ đồ thị thể đường cong sinh trưởng cho thấy chủng TVY.04 có pha log từ đến Sau tăng sinh, mật độ tế bào bắt đầu giảm Chọn thời gian cấp giống lên men chủng TVY.04 sau tăng sinh Khi đó, OD 600nm đạt khoảng 5,0 mật độ tế bào đạt khoảng x 108 CFU/mL 66 ... Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase cao tạo độ nhớt thấp – Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt canh trường lên men chủng tuyển chọn – Tối... Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Công nghệ Sinh học Đầu đề đề tài nghiên cứu: Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt thấp Nội dung nghiên cứu: – Phân lập. .. lần để đánh giá sai Chủng cho hoạt lực enzyme cao chọn sàng lọc thứ cấp để lựa chọn chủng tạo độ nhớt thấp 29 2.4.3 Sàng lọc thứ cấp chủng tạo độ nhớt thấp Các chủng tuyển chọn theo Mục 2.4.2