Tóm tắt luận án: Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Ghi : Hà Nội - 2023 Cơng trình hoàn thành tại: Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Lan Hương TS Phạm Tuấn Anh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách khoa Hà Nội họp Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Các bệnh tim mạch (CVD) nguyên nhân dẫn đến tử vong người Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xác định 17,9 triệu ca tử vong năm CVD, ước tính chiếm 31% số ca tử vong toàn cầu Các bệnh rối loạn tim mạch nhồi máu tim cấp tính, tắc mạch đột quỵ chủ yếu tích tụ nhiều fibrin mạch máu tạo thành huyết khối Các enzyme thủy phân fibrin thu nhận từ chủng vi sinh vật trở thành nguồn sản xuất enzyme thủy phân fibrin dễ tiếp cận hơn, rẻ thu hút ý điều trị bệnh liên quan đến huyết khối, làm tan huyết khối có máu Vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin phân lập chủ yếu từ nguồn thực phẩm lên men có nguồn thực phẩm lên men từ đậu tương, chủng vi khuẩn phân lập chủ yếu B subtilis, B amyloliquefaciens cho an toàn Trước nhu cầu sử dụng enzyme thủy phân fibrin ngày tăng lĩnh vực y dược thực phẩm bổ sung, việc mở rộng nghiên cứu tăng cường cải thiện hoạt độ enzyme nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp để tăng hiệu suất góp phần giảm chi phí sản xuất cần thiết Ngoài việc lựa chọn phương pháp lên men phù hợp tối ưu hóa thành phần môi trường lên men cho chủng cụ thể việc nghiên cứu cải thiện khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng khuẩn coi cách đem lại hiệu cao, ứng dụng sản xuất quy mơ cơng nghiệp Vì vậy, tác giả tiến hành “Nghiên cứu cải thiện khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens” phân lập từ sản phẩm tương Việt Nam Mục tiêu luận án Tuyển chọn nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin vi khuẩn Bacillus sp phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống Nội dung luận án - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao Định danh tên chủng phương pháp giải trình tự gene - Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng phương pháp đột biến dùng tia UV kết hợp hóa chất EtBr EMS - Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung chất Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Về ý nghĩa khoa học: + Đã phân lập tuyển chọn chủng B amyloliquefaciens HY6 từ tường Bần, Hưng Yên cải biến thành chủng đột biến ES4 có khả sinh enzyme thủy phân fibrin + Chứng minh việc nâng cao khả sinh tổng enzyme thủy phân fibrin chủng cách tạo đột biến sử dụng kết hợp tia UV với hóa chất EtBr EMS + Đã nâng cao khả sinh enzyme thủy phân fibrin cách thiết lập kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung chất hai giai đoạn chủng đột biến ES4 - Về ý nghĩa thực tiễn: + Bổ sung vào sưu tập giống chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao + Kết sở khoa học để nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất enzyme thủy phân fibrin nhằm tạo sản phẩm nhằm ứng dụng hỗ trợ phòng ngừa điều trị bệnh liên quan đến huyết khối Việt Nam Những đóng góp luận án - Là nghiên cứu có tính hệ thống phân lập, tuyển chọn, tạo chủng vi khuẩn đột biến, xác định điều kiện lên men nhằm thu enzyme thủy phân fibrin từ chủng B amyloliquefaciens HY6 có nguồn gốc từ tương Bần, Hừng Yên - Đã tạo chủng đột biến B amyloliquefaciens ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao so với chủng phân lập kỹ thuật sử dụng kết hợp đột biến tia UV với hóa chất EMS EtBr - Đã nâng cao khả sinh enzyme thủy phân cách thiết lập kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung chất hai giai đoạn thiết bị lên men lít Bố cục luận án Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương trình bày kiến thức tảng (1) Enzyme thủy phân fibrin bao gồm: tác dụng, chế thủy phân fibrin enzyme, nguồn thu ứng dụng enzyme, tình hình nghiên cứu nước (2) Chủng vi khuẩn Bacillus sp sinh tổng hợp enzyme, nguồn thu nhận phương pháp nâng cao hoạt tính enzyme chủng đột biến, tối ưu môi trường, điều kiện nuôi cấy kỹ thuật lên men thu nhận enzyme (3) Sản phẩm enzyme thương mại Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương trình bày đối tượng nghiên cứu, vật liệu, hóa chất, phương pháp phân tích thí nghiệm cụ thể thực để giải nội dung đặt nghiên cứu luận án Chương 3: Kết thảo luận Chương trình bày kết đạt từ nội dung nghiên cứu qua biện luận, phân tích sở khoa học so sánh với nghiên cứu cơng bố (nếu có) Chương 4: Kết luận kiến nghị Chương nêu kết luận đạt tương ứng với nội dung nghiên cứu đặt đồng thời đề xuất kiến nghị số nội dung tiếp tục làm để hoàn thiện phát triển kết đạt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giớí thiệu enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin hay gọi enzyme tiêu sợi huyết, hầu hết enzyme thủy phân fibrin thuộc họ protease subtilisin sinh tổng hợp chủng vi khuẩn Bacillus sp., chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập chủ yếu từ nguồn thực phẩm lên men, có nguồn đậu tương lên men truyền thống (Hình 1.1) Hình 1.1 Nguồn phân lập vi khuẩn sinh enzyme thủy phân fibrin Hình 1.2 Cơ chế thủy phân fibrin enzyme 1.1.1 Cơ chế tiêu sợi huyết enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin hỗ trợ làm tan sợi huyết thể, giúp máu lưu thông tốt cách phá vỡ protein fibrin máu, thúc đẩy tăng cường lưu lượng máu khỏe mạnh Bên cạnh đó, enzyme thủy phân fibrin có khả cắt bỏ chất ức chế hoạt hóa plasminogen, kích hoạt pro-urokinase chất kích hoạt plasminogen mơ (t-PA), hỗ trợ hoạt động tiêu sợi huyết plasmin (Hình 1.2), góp phần trì lưu lượng máu thích hợp, ngăn ngừa cục máu đơng 1.1.2 Ứng dụng enzyme thủy phân fibrin Các enzyme thủy phân fibrin có tác dụng kích hoạt chất hịa tan cục máu đơng, cho an tồn ngày quan tâm, nghiên cứu ứng dụng làm thuốc tan huyết khối lâm sàng, sử dụng phòng ngừa bệnh liên quan đến huyết khối tim mạch dạng thực phẩm chức 1.1.3 Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin thu nhận từ nhiều nguồn vi khuẩn khác nhau, chủ yếu phân lập từ nguồn đậu nành lên men như: Doenjang, Cheonggukjang, Meju, Kimchi (Hàn Quốc); Tempeh (Indonesia); Chickpeas, Douchi (Trung Quốc); Bột Dosa (Ấn Độ); Natto (Nhật Bản); Kishk (Ai Cập); mắm tôm lên men (Châu Á); nem chua, nước tương lên men (Việt Nam) Các chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme thủy phân fibrin phân lập chiếm đa số Bacillus sp có B amyloliquefaciens xem nguồn tiềm để sản xuất enzyme thủy phân fibrin ứng dụng sống 1.2 Giớí thiệu Bacillus sp 1.2.1 Đặc điểm Bacillus sp Bacillus sp trực khuẩn hình que, hiếu khí, khơng gây bệnh, hình thành nội bào tử Ở điều kiện sinh trưởng tối ưu Bacillus sp có thời gian hệ khoảng 25 phút 1.2.2 Nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân từ nguồn vi khuẩn Bacillus sp Các enzyme thủy phân fibrin thu nhận từ nguồn vi khuẩn Bacillus sp có B.amyloliquefaciens nghiên cứu nhiều số nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ Đến nhà khoa học nỗ lực tìm kiếm đa dạng chủng sản xuất enzyme cho hoạt độ cao từ nguồn phân lập khác nhau, nước khu vực Châu Á Ở Việt Nam enzyme thủy phân fibrin chưa thực quan tâm, thu nhận từ chủng vi khuẩn địa có nguồn thực phẩm lên men truyền thống để hướng tới ứng dụng 1.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin đột biến Để nâng cao khả thu nhận enzyme chủng, mang lại hiệu kinh tế, cải thiện khả sinh tổng hợp enzyme chủng cách sử dụng tác nhân đột biến theo phương pháp sinh học, lý học, hóa học áp dụng kỹ thuật quy trình đặc biệt để phát đột biến hữu ích tạo chủng có khả siêu tổng hợp enzyme 1.3.1 Phương pháp đột biến UV 1.3.1.1 Cơ chế gây đột biến UV Chiếu tia UV dẫn đến hình thành liên kết cộng hóa trị pyrimidine dimer, liên kết làm biến dạng cấu trúc DNA, ức chế trình chép phiên mã DNA, gây đột biến 1.3.1.2 Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn Đã có nhiều nghiên cứu cơng bố đem lại hiệu đáng kể cải thiện nâng cao hoạt tính enzyme chủng dại đột biến UV Kết nghiên cứu cho thấy, việc nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme chủng vi khuẩn phương pháp đột biến UV cho hoạt độ enzyme tăng từ 1,01 đến lần so với chủng ban đầu 1.3.2 Phương pháp đột biến hóa chất 1.3.2.1 Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS EtBr Tác nhân gây đột biến hóa học tạo thành chất cộng với nucleotide bắt cặp sai với bazơ bổ sung khuôn mẫu, dẫn đến thay đổi bazơ trình chép gây nên đột biến 1.3.2.2 Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS EtBr nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn Phương pháp đột biến hóa chất EMS, EtBr, phương pháp đột biến có độ ổn định cao so với đột biến UV, nhiều nghiên cứu công bố đem lại hiệu đáng kể việc cải thiện nâng cao hoạt tính enzyme chủng dại, tăng từ 1,12 đến lần Ở Việt Nam, đề tìm kiếm thu nhận cải thiện chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin phương pháp đơn giản đột biến UV hóa chất chưa quan tâm khai thác sử dụng để thu nhận nguồn enzyme tiềm 1.4 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men 1.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin Trong lên men, nguồn dinh dưỡng C (glucose, sacarose, maltose, glycerol, ), N (cao nấm men, cao thịt, bột đậu, peptone, tryptone,…), ion kim loại (Ca 2+, Mg2+, Fe2+, K+, Cu2+,…) điều kiện lên men (nhiệt độ, pH môi trưởng) nghiên cứu khảo sát lựa chọn cho chủng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin, chủng khác có điều kiện sử dụng nguồn dinh dưỡng để sinh tổng hợp enzyme cho hiệu tốt khác 1.4.2 Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men Trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin, việc tối ưu điều kiện thành phần môi trường lên men để tăng khả sinh tổng enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn quan tâm nghiên cứu nhiều tác giả cho kết tối ưu hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng khác nhau, tăng từ 1,5 đến 6,3 lần so với hoạt độ enzyme ban đầu 1.5 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 1.5.1 Lên men theo mẻ Là phương pháp lên men mà suốt thời gian lên men không thêm dinh dưỡng không loại bỏ sản phẩm cuối, hiệu thu nhận enzyme không cao 1.5.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất Là hình thức trung gian lên men theo mẻ lên men liên tục, nâng cao hiệu thu nhận enzyme, giảm chi phí trình sản xuất Các nghiên cứu tăng hoạt độ enzyme thủy phân fibrin từ 1,24 đến lần chủng lên men theo mẻ bổ sung chất 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên men Trong lên men, sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chủng giống, thành phần môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, cấp khí), thời gian ni cấy, 1.6 Sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại Các chế phẩm enzyme thủy phân fibrin ứng dụng phổ biến dạng thực phẩm chức đóng viên chủ yếu Nhật Bản, Mỹ, Canada, Việt Nam,… Các sản phẩm lưu hành thị trường có giá thành dao động khác nhau, phụ thuộc vào nguồn gốc sản phẩm hoạt độ enzyme có sản phẩm cao hay thấp Ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin nước chưa đáp ứng nhu cầu thị trường, phần lớn phải nhập nguyên liệu enzyme thương mại từ nước khác Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập từ sản phẩm tương ở: Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Yên Bái, Phú Thọ, Bắc Ninh, Nghệ An Hà Nội 2.1.2 Hóa chất Các hóa chất dùng nghiên cứu có nguồn gốc từ hãng Himedia (Ấn Độ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức), 2.1.3 Thành phần môi trường Gồm môi trường LB; môi trường GY; môi trường GYP môi trường tạo bào tử DSM 2.1.4 Thiết bị Các trang thiết bị sử dụng phịng thí nghiệm có xuất xứ từ nhiều nước Nhật Bản, Đức, Trung Quốc Việt Nam,… 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm Mẫu tương Phân lập Bacillus sp UV (5 lần) EtBr EMS EMS EtBr + EMS EtBr Dịng tế bào đột biến có hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao Kiểm tra độ ổn định hoạt độ enzyme chủng Tối ưu môi trường điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme Lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận hoạt độ enzyme cao 2.2.2 Phương pháp phân tích 2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzyme 2.2.2.2 Xác định đường khử phương pháp DNS 2.2.2.3 Xác định hàm lượng protein hòa tan phương pháp Bradford 2.2.2.4 Đo độ nhớt dịch lên men 2.2.2.5 Nhuộm gram 2.2.2.6 Xác định hàm lượng sinh khối khơ 2.2.2.7 Nhuộm bào tử 2.2.2.8 Định tính enzyme amylase 2.2.2.9 Định tính enzyme cellulose 2.2.2.10 Đặc điểm sinh hóa chủng gốc chủng đột biến 2.2.2.11 Tách DNA tổng số giải trình tự gene vi khuẩn 2.2.2.12 Xử lý số liệu: Các số liệu cơng bố giá trị trung bình với độ sai số xử lý phần mềm Excel với sai số cho phép ≤ 5% sử dụng phần mềm Design Expert 2.2.3 Phương pháp thí nghiệm 2.2.3.1 Phân lập sàng lọc chủng a Phương pháp phân lập: 10g + 90ml nước muối 0,9% nhiệt 80oC/20 phút Pha mẫu đến 10-5-10-6, trải đĩa môi trường LB agar, 37oC /24 h b Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease: khuẩn lạc cấy ria LB agar + 1% sữa gầy, 370C/24 h Các chủng sau sàng lọc lên men môi trường GY 370C, lắc 150 vòng/phút, 24 h đo hoạt độ enzyme 2.2.3.2 Hoạt hóa chủng Chủng ni môi trường LB 37oC 12-14 h trước sử dụng 2.2.3.3 Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào Chủng hoạt hóa cấp vào 50 ml mơi trường GY GYP (OD 0,2)/bình tam giác 250ml Ni 37oC, lắc 150 vòng/phút/ 24 h, ly tâm tách sinh khối 10.000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC/10 phút thu dịch đo hoạt độ enzyme 2.2.3 Đột biến chủng vi khuẩn a Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào cho đột biến t khoảng thời gian bổ sung chất (h); Sf nồng độ chất bổ sung (g/l); S0 nồng độ chất dịch lên men thời điểm bắt đầu bổ sung chất (g/l); YX/S: hiệu suất sử dụng chất tế bào (g/g) a Lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn Cơ chất bổ sung trình lên men thành phần dung dịch hỗn hợp có chứa glucose, YE peptone với tỉ lệ tuân theo điều kiện tối ưu cho hàm đáp ứng enzyme Dựa vào thông số động học lên men thẻo mẻ tốc độ tăng trưởng chủng/h hiệu suất sử dụng chất tế bào, sau khoảng thời gian định 0,25 giờ, chất cài đặt bổ sung tự động Chủng lên men môi trường tối ưu cho enzyme, nhiệt độ, pH môi trường khảo sát mục 2.2.3.7.b Quá trình bổ sung chất thực trước chủng phát triển chuyển sang pha cân b Lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn Cơ chất bổ sung có thành phần tỉ lệ chất thay đổi, tỉ lệ thành phần chất bổ sung giai đoạn khác nhau, giai đoạn đầu chất bổ sung thành phần tối ưu cho mật độ tế bào nhằm tăng sinh khối tế bào, giai đoạn giai đoạn bổ sung chất thành phần môi trường tối ưu cho enzyme Các thông số lên men bổ sung chất giai đoạn điều kiện lên men, thời gian bổ sung chất tốc độ cấp chất bổ sung trì lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao 3.1.1 Phân lập vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme protease Tổng số 28 mẫu tương phân lập 68 khuẩn lạc, khuẩn lạc làm môi trường LB agar + 1% sữa gầy để sàng lọc sơ cho 48 chủng có khả sinh enzyme protease, có 23 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao, chủng có đặc điểm hình thái khuẩn lạc khác nhau, đa dạng màu sắc, hình dạng Trong đó, chủng HY6 cho đường kính vịng thủy phân sữa gầy to 12 ± mm (Hình 3.1) 11 Hình 3.1 Kết đo đường kính vịng thủy phân sữa gầy 48 chủng phân lập 3.1.2 Khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng 23 chủng có hoạt tính protease cao cho lên men môi trường GY/24 giờ, lắc 150 rpm/37oC, đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin Kết 23 chủng có sinh tổng hợp enzyme phân hủy fibrin có hoạt độ từ 11,4 ± 2,2 FU/ml đến 49,2 ± 1,2 FU/ml Chủng HY6 phân lập từ tương Bần, Hưng Yên cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao đạt 49,2 ± 1,2 FU/ml chọn để tiếp tục nghiên cứu Chủng HY6 nhuộm Gram cho thấy tế bào chủng HY6 bắt màu tím vi khuẩn Gram dương, tế bào vi khuẩn hình que, có đầu tròn, tồn đơn lẻ thành đám hình chuỗi ngắn (Hình 3.2) Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc tế bào nhuộm Gram chủng HY6 soi kính hiển vi vật kính dầu 100x 3.2 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng lựa chọn phương pháp đột biến 3.2.1 Đột biến tia UV Chủng HY6 chiếu tia UV đột biến sau lần liên tiếp thu nhận chủng U5_90.5 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao đạt đạt 114 ± FU/ml (Hình 3.3), tăng 2,3 lần so với chủng HY6 3.2.2 Đột biến hóa chất EtBr Chủng HY6 đột biến hóa chất EtBr thu nhận chủng H12 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao đạt 180 ± 12 FU/ml (Hình 3.4), tăng 2,2 lần so với chủng HY6 Kết so với phương pháp chiếu tia UV cho hoạt độ enzyme tăng xấp xỉ Hình 3.3 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến tia UV Hình 3.4 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EtBr 3.2.3 Đột biến UV kết hợp hóa chất 3.2.3.1 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr Chủng U5_90.5 môi trường GYP có hoạt lực enzyme cao đạt 177,8 ± 9,8 FU/ml cho đột biến với hóa chất EtBr thu 02 chủng cho hoạt độ enzyme cao E1 (452 ± FU/ml) E5 (440 ± FU/ml) Hình 3.5 Kết quả, chủng đột biến cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng 5,5 lần so với chủng gốc tăng 2,5 lần so với chủng đột biến UV hóa chất trực tiếp 3.2.3.2 Đột biến chủng U5_90.5 EMS Chủng U5_90.5 cho đột biến với hóa chất EMS thu nhận chủng S33 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao đạt 456 ± FU/ml (Hình 3.6), hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng so với chủng HY6 ban đầu 5,6 lần 3.2.3.3 Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV EtBr) EMS Chủng E1 cho đột biến hóa chất EMS thu nhận chủng E1.10 cho hoạt độ enzyme cao đạt 320 ± 16 FU/ml (Hình 3.7), thấp chủng 13 E1 Điều cho thấy, trình sàng lọc thu nhận chủng đột biến khơng có lợi cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin Hình 3.5 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EtBr từ chủng U5_90.5 Hình 3.6 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EMS từ chủng U5_90.5 Hình 3.7 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EMS từ chủng E1 3.2.3.4 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr kết hợp với EMS 14 Chủng U5_90.5 cho đột biến kết hợp lúc hóa chất EtBr EMS (tỉ lệ 1:1) thu chủng ES4 cho hoạt độ enzyme cao đạt 416 ± FU/ml (Hình 3.8), tăng lần so với chủng HY6 Hình 3.8 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến EtBr kết hợp EMS 3.2.4 Độ ổn định chủng đột biến Các chủng đột biến chủng HY6 kiểm tra tính ổn định sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin qua 10 lần cấy chuyển Kết chủng ES4 cho độ ổn định chủng đột biến, hoạt độ enzym thủy phân fibrin 404 ± FU/ml (Hình 3.9), tăng lần so với chủng HY6 Hình 3.9 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng qua 10 lần cấy chuyển 3.2.5 Bước đầu tìm hiểu hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân fibrin chủng HY6 ban đầu chủng đột biến ES4 So sánh, phân tích genome chủng HY6 ES4 thực hệ thống RAST (trang https://rast.nmpdr.org/rast.cgi) Kết thu nhận số đặc điểm hệ gen chủng thể Bảng 3.1 Kích thước gen chủng ES4 tăng so với chủng HY6 1408 bp (Bảng 3.1) Tỷ lệ % GC chủng khơng đổi chiếm 45,78% Dự đốn 15 chức gen tảng RAST cho thấy chủng có 54 gen mã hóa rRNA Bảng 3.1 Đặc điểm tổ hợp gen chủng HY6 ES4 Số lượng contig Kích thước hệ gen (bp) Số lượng contig (với PEGs) Tỷ lệ GC (%) Số lượng trình tự mã hóa protein Số lượng hệ thống phân loại Số lượng gen mã hóa RNAs rRNAs tRNAs TmRNAs Chủng HY6 24 3912654 24 45,78 4351 329 54 52 Chủng ES4 28 3914062 28 45,78 4101 329 54 52 Hình 3.10 Kết chạy RAST chủng HY6 Phân tích trình tự hệ gen (whole genome sequencing): Gen giải hệ thống máy chủ RAST, số gen dự đoán chức hệ thống (subsystem) chủng đạt 28% (Hình 3.10 Hình 3.11), với gen subsystem nhỏ giống Chủng HY6 ES4 giải toàn trình tự gen, kết chủng xác định Bacillus amyloliquefaciens có ngân hàng gen GenBank Chủng HY6 ES4 xây dựng phân loài TYPE (STRAIN) GENOME SERVER (https://tygs.dsmz.de/user_requests/new) cho thấy, chủng HY6 ES4 gần giống với chủng Bacillus amyloliquefaciens DSM7 Các trình tự gen cho khác BLAST trang http://ncbi.nlm.nih.gov qua thu nhận số liệu gen thay đổi tổng hợp Bảng 3.2 16 Hình 3.11 Kết chạy RAST chủng ES4 Bảng 3.2 Các gen thay đổi chủng HY6 gốc chủng ES4 đột biến TT HY6 >CALMKEOM_00581 Sporulation kinase A >CALMKEOM_01099 Sporulation protein YunB >CALMKEOM_02669 Protein SprT-like protein >CALMKEOM_02828 Ferredoxin NADP reductase >CALMKEOM_02905 Glutaminase >CALMKEOM_03627 Protein UmuC >CALMKEOM_03629 DNA polymerase IV >CALMKEOM_04093 tRNA-Tyr(gta) ES4 >LCCANNEE_00351 Sporulation kinase A >LCCANNEE_03339 Sporulation protein YunB >LCCANNEE_04149 Sporulation protein YunB >LCCANNEE_02502 Protein SprT-like protein >LCCANNEE_02661 Ferredoxin NADP reductase >LCCANNEE_02738 Glutaminase Sự thay đổi protein S->A Không thay đổi I->V,S->N,Q>K,S->N Không thay đổi G->S Không thay đổi Không thay đổi >LCCANNEE_03733 DNA polymerase IV Không thay đổi >LCCANNEE_02788 tRNA-Tyr(gta) Đột biến nucleotid: A  G, T  G, C T Từ Bảng 3.2 cho thấy, mục số gen mã hóa tRNA(tyr) (là RNA vận chuyển đặc hiệu cho tyrosine), gen có xuất đột biến điểm A -> T, T -> G, C -> T, điểm đột biến nhỏ so với kích thước hệ gen, đó, tính tốn tỉ lệ GC theo % tỉ lệ gần không thay đổi Kết thể Bảng 17 3.1 (khi phân tích so sánh genome chủng HY6 ES4 hệ thống RAST), tỉ lệ % GC chủng không thay đổi (45,78 %) Ở mục số gen có liên quan đến bào tử, gen spoA thay đổi có khả liên quan đến hình thành bào tử chủng, mục số gen mã hóa cho enzyme chuỗi vận chuyển điện tử Trên sở phân tích thay đổi gen, chủng nuôi môi trường DSM/7 ngày nuôi, kết chủng ES4 không tạo bào tử Trên môi trường GYP/24 h, chủng ES4 (3 mPas) có độ nhớt giảm so với chủng HY6 (4 mPas), sinh khối tạo thành chủng ES4 so với HY6 khơng tăng, hàm lượng protein hịa tan chủng ES4 tăng 1,2 lần so với HY6 Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 tăng khoảng lần so với HY6, chủng có hoạt tính enzyme amylase enzyme cellulose Kiểm tra phản ứng sinh hoá chủng HY6 ES4 kit Api-20E 50CH cho thấy chủng có phản ứng sinh hóa giống nhau, khác 01 phản ứng sinh hóa số 24 (Arbutin), chủng ES4 có khả sinh arbutin cịn HY6 khơng 3.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 kỹ thuật lên men 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho khả sinh enzyme chủng 3.3.1.1 Nguồn carbon Kết khảo sát nguồn dinh dưỡng C cho thấy, chủng ES4 nguồn dinh dưỡng C glucose cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng cao đạt 375 ± FU/ml (Hình 3.12) chọn nguồn C cho chủng phát triển sinh enzyme thủy phân fibrin Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn C Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn N 3.3.1.2 Nguồn nitrogen Kết khảo sát cho thấy kết hợp nguồn peptone cao nấm men cho hoạt độ enzyme cao đạt 385 ± FU/ml (Hình 18 3.13) chọn nguồn N dùng để lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin chủng 3.3.1.3 Các ion kim loại Kết khảo sát cho thấy kết hợp ion kim loại Ca2+ Mg2+ cho hoạt độ enzyme đạt cao 388 ± 12 FU/ml (Hình 3.14) chọn để bổ sung mơi trường lên men Hình 3.14 Ảnh hưởng ion kim loại Hình 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ 3.3.2 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho khả sinh enzyme chủng 3.3.2.1 Nhiệt độ lên men Kết khảo sát cho thấy 37 o C cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao đạt 405 ± FU/ml (Hình 3.15) chọn nhiệt độ thích hợp chủng 3.3.2.2 pH môi trường ban đầu Kết khảo sát giá trị pH 6,5 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao 434 ± 14 FU/ml (Hình 3.16) lựa chọn giá trị pH thích hợp để chủng phát triển sinh enzyme Hình 3.16 Ảnh hưởng pH mơi trường ban đầu 3.3.3 Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin Kết phân tích ANOVA theo mơ hình bậc hai (Bảng 3.3) cho thấy mơ hình hồi quy hàm có ý nghĩa Các yếu tố 19 glucose, cao nấm men peptone có ảnh hưởng đáng kể đến mật độ tế bào hoạt độ enzyme chủng, yếu tố MgSO4 khơng có ý nghĩa sinh khối hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng, lại có ảnh hưởng tương tác với thành phần môi trường khác, yếu tố NaCl không ảnh hưởng đến sinh khối lại có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp enzyme Bảng 3.3 Kết phân tích ANOVA mơ hình bậc hai Source Model df 27 Cell density (OD 600 nm) Sum of Mean FpSquares Square value value < 143,18 5,30 219,52 0,0001 Sum of Squares 9,851E+05 Fibrinolytic enzyme Mean FSquare value 36484,72 299,59 B-Yeast extract C-Peptone 1,37 1,37 56,68 0,0003 1,009E+05 1,009E+05 828,68 D-CaCl2.2H2O 0,4523 0,4523 18,72 0,0049 16552,43 16552,43 135,92 E-MgSO4.7H2O F-NaCl 1 0,0575 0,0135 0,0575 0,0135 2,38 0,5576 279,82 2298,63 279,82 2298,63 2,30 18,87 AB 2,38 2,38 98,33 25,11 25,11 0,2062 0,6657 AC AD AE AF 1 1 0,0628 0,0748 0,0955 0,0167 0,0628 0,0748 0,0955 0,0167 2,60 3,10 3,95 0,6933 0,1738 0,4834 < 0,0001 0,1580 0,1290 0,0939 0,4369 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,1804 0,0049 4950,29 1291,78 158,58 10021,10 4950,29 1291,78 158,58 10021,10 40,65 10,61 1,30 82,29 BC 0,0659 0,0659 2,73 0,1497 31062,11 31062,11 255,06 BD BE BF 1 1,14 0,1301 0,1537 1,14 0,1301 0,1537 47,13 5,39 6,36 54,09 3148,49 6105,37 54,09 3148,49 6105,37 0,4441 25,85 50,13 CD 2,11 2,11 87,19 6438,57 6438,57 52,87 0,0003 CE CF 1 0,1957 0,0314 0,1957 0,0314 8,10 1,30 0,0005 0,0594 0,0451 < 0,0001 0,0293 0,2978 0,0007 0,0173 0,2973 0,0001 < 0,0001 0,5299 0,0023 0,0004 2226,91 2790,80 2226,91 2790,80 18,29 22,92 DE 0,0073 0,0073 0,3041 0,6013 11834,46 11834,46 97,18 DF EF 1 0,0606 0,0557 0,0606 0,0557 2,51 2,31 0,1644 0,1797 93,08 142,40 93,08 142,40 0,7643 1,17 A² 0,3302 0,3302 13,67 0,0101 54585,61 54585,61 448,22 B² 0,6359 0,6359 26,33 0,0022 25173,16 25173,16 206,71 C² 0,8209 0,8209 33,98 0,0011 81269,79 81269,79 667,34 D² 0,0494 0,0494 2,04 0,2027 16622,05 16622,05 136,49 1 3 33 0,2560 0,0450 0,1449 0,0833 0,0616 143,32 0,2560 0,0450 0,0242 0,0278 0,0205 10,60 1,86 0,0173 0,2211 0,4049 2425,63 326,02 121,78 158,06 85,50 19,92 2,68 1,35 2425,63 326,02 730,69 474,19 256,50 9,858E+05 0,0052 0,0030 < 0,0001 0,4156 0,3211 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0043 0,1529 1,85 0,3132 A-Glucose E² F² Residual Lack of Fit Pure Error Cor Total 1,71 91,33 1,71 70,89 0,0002 1,732E+05 1,732E+05 91,33 3780,8 < 0,0001 1,926E+05 1,926E+05 1422,3 1581,2 p-value < 0,0001 Phân tích tương tác bậc hai thành phần, có 5/15 tương tác glucose - YE, YE - CaCl2, YE - NaCl, peptone - CaCl2, YE MgSO4 ảnh hưởng đến mật độ tế bào Đối với hoạt độ enzym thủy phân fibrin có 10/15 tương tác có ý nghĩa Các hàm đáp ứng 20 mơ hình thể đầy đủ mối quan hệ thực biến xem xét (R2), mức độ xác (C.V %) phương pháp xử lý thực cho độ tin cậy cao thử nghiệm (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Kết phân tích phù hợp mơ hình với thực nghiệm Kết phân tích cho hàm hoạt độ enzyme Std Dev 11,04 Mean 389,75 C.V % 2,83 R² 0,9993 Adjusted R² 0,9959 Predicted R² 0,7984 Adeq Precision 66,7363 Kết phân tích cho hàm mật độ tế bào Std Dev 0,1554 Mean 5,78 C.V % 2,69 R² 0,9990 Adjusted R² 0,9944 Predicted R² 0,8066 Adeq Precision 48,8059 Hình 3.17 Bề mặt đáp ứng cho hàm mật độ tế bào hàm hoạt độ enzyme Đối với hàm hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, biến tác động theo thứ tự cao nấm men > glucose > peptone > MgSO4 > NaCl với tỷ lệ 1/0,84/0,7/0,11/ 0,11/ 0,04 Kết cho thấy ảnh hưởng biến độc lập đến mật độ tế bào hoạt độ enzyme có khác nhau, có thành phần ảnh hưởng lớn glucose; YE peptone Sự tương tác ảnh hưởng thành phần đến mật độ tế bào hoạt độ enzyme chủng ES4 thể rõ qua đồ thị bề 21 mặt ba chiều (3D) Hình 3.17 Phân tích ảnh hưởng biến độc lập hàm mật độ tế bào cho thấy hệ số ảnh hưởng cao nấm men cao nhất, cao gấp lần so với glucose peptone, 15 lần so với CaCl2, MgSO4 NaCl có ảnh hưởng ngược lại Tỷ lệ thành phần 1/0,12/0,12/0,07 tương ứng với thành phần cao nấm men/glucose/peptone/CaCl2 (Hình 3.18) Kết sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để tối ưu hóa thành phần môi trường GYP chủng ES4 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao đạt 686 ± 43 FU/ml, tăng 1,7 lần so với môi trường ban đầu Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin (FU/ml) E2 D2 C2 B2 F2 A B C D 150 E 50 A2 -50 EF -150 OD (600 nm) F AB AC DF AD DE CF CE CD BF BE BD AE AF BC Hình 3.18 Hệ số ảnh hưởng phương trình hồi quy bậc hai mật độ tế bào hoạt độ enzyme thủy phân fibrin 3.3.4 Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin 3.3.4.1 Lên men theo mẻ Hình 3.19 Động học trình lên men theo mẻ Chủng ES4 lên men theo mẻ môi trường tối ưu cho enzyme (Hình 3.19) Phân tích động học q trình lên men theo mẻ cho thấy tốc độ khuấy trộn tăng nhanh từ 1,75 h đạt cực đại sau h lên men cho thấy chủng giai đoạn phát triển cần cung cấp 22 nhiều oxi, kết OD chủng vi khuẩn phát triển nhanh (μ = 0,57 h-1) giai đoạn này, OD cực đại sau lên men Giá trị OD cao 13,04 ± 0,075 h tăng 1,5 lần hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao 870 ± 10 FU/ml 14 h, tăng khoảng 1,27 lần so với lên men bình tam giác 3.3.3.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn Từ kết động học lên men theo mẻ cho thấy, chủng phát triển mạnh thời gian từ - 5h, chất bổ sung thời điểm 5h, tốc độ bổ sung chất tính tốn cấp tự động sau khoảng thời gian 0,25h, trình bổ sung chất thời gian 8h (Hình 3.20) Kết lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn, giá trị OD cao 14h 108,1 ± 0,002, hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao 4057,14 ± 57,14 FU/ml 13h, tăng 4,66 lần so với lên men mẻ, mật độ tế bào 13h đạt 101,2 ± 0,005 tăng 7,75 lần so với lên men theo mẻ Hình 3.20 Động học trình lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn 3.3.3.3 Lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn Hình 3.21 Động học trình lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn Quá trình lên men theo mẻ bổ sung chất theo giai đoạn, giai đoạn đầu mục tiêu việc bổ sung chất để tăng sinh khối 23 tế bào, giai đoạn bổ sung chất để tăng khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng (Hình 3.21) Kết quả, mật độ tế bào cao 153,5 ± 0,002 14h, hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng cao đạt 5.300 ± 100 FU/ml 13h, tăng 6,09 lần so với lên men theo mẻ Ở 13h mật độ tế bào đạt 142,3 ± 0,02, tăng 10,91 lần so với lên men theo mẻ tăng 65,92 lần chủng HY6 ni bình tam giác 250ml Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đã phân lập tuyển chọn chủng HY6 từ nguồn tương Bần, Hưng Yên môi trường GYP cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin đạt 80,4 ± 1,2 FU/ml Chủng HY6 giải trình tự tồn hệ gen, định danh đặt tên Bacillus amyloiquefaciens HY6 Đã nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng HY6 sau lần đột biến tia UV kết hợp đột biến hóa chất EtBr EMS thu nhận đươc chủng ES4 đột biến cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin môi trường GYP tăng khoảng lần so với chủng gốc HY6, hoạt độ enzyme chủng đột biến ES4 qua 10 lần cấy chuyển cho độ ổn định cao (giảm 2,88%) Đã nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng đột biến ES4, xác lập điều kiện lên men tối ưu cho chủng đột biến ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin điều kiện nhiệt độ 37 o C pH môi trường ban đầu thích hợp 6,5 Thành phần mơi trường tối ưu cho chủng đột biến ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin gồm glucose (16,66 g/l), cao nấm men (2,75 g/l), peptone (7,44 g/l), CaCl 2H2 O (0,1 g/l), MgSO4 7H2 O (0,24 g/l) NaCl (9,65 g/l) Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin chủng môi trường tối ưu đạt 686 ± 43 FU/ml, tăng 1,7 lần so bình tam giá 250 ml Lựa chọn kỹ thuật lên men cho chủng đột biến ES4 kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung chất theo giai đoạn thiết bị lên men 2L, điều kiện nhiệt độ lên men 37 oC, pH mơi trường 6,5 pO trì mức tối thiểu 20%, chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin đạt 5.300 ± 100 FU/ml, tăng 6,09 lần so với lên men theo mẻ, tăng 65,92 lần so với chủng HY6 bình tam giác 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Bui Thi Thanh, Dam Thuy Hang, Pham Tuan Anh and Nguyen Lan Huong (2022) Enhanced Production of Fibrinolytic Enzyme by Bacillus sp Isolated from Vietnamese Traditional Fermented Soybean (Tuong ban) using Ultraviolet Irradiation and Chemical Mutation International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 11(05): 67-80 Bui Thi Thanh, Le Tuan, Nguyen Lan Huong and Pham Tuan Anh (2023) Improvement of Fibrinolytic Enzyme Production from Bacillus sp ES4 by Response Surface Methodology and Exponential Fed-Batch Fermentation International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, vol 12(03): 151-162