Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens CP16 04

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRỊNH THÀNH TRUNG TS TRẦN THỊ THANH HUYỀN Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn cao học này, xin chân thành cảm ơn TS Trịnh Thành Trung TS Trần Thị Thanh Huyền động viên, hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trính học tập Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học nói riêng Khoa Sinh học nói chung dạy dỗ tơi q trình học tập Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Học viên Nguyễn Phương Liên MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1 Giới thiệu chung chi vi khuẩn Bacillus 1.1.2 Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus .4 1.1.3 Hệ thống phân loại Bacillus đại 1.1.4 Phương pháp phân lập phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus 1.2 Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus 12 1.2.1 Lipopeptide mạch vịng mang điện tích dương 13 1.2.2 Lipopeptide mạch vịng khơng mang điện tích dương 15 1.2.3 Lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương 17 1.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus 18 1.4 Mục đích nghiên cứu 19 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu .20 2.1.1 Chủng vi sinh vật 20 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 20 i 2.2 Phương pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Xác định khả sinh chất kháng nấm chất kháng khuẩn 22 2.2.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 22 2.2.3 Xác định khả phân giải phosphate khó tan 23 2.2.4 Xác định khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 23 2.2.5 Dấu vân tay rep-PCR phân tích tính tương đồng kiểu gen 23 2.2.6 Phân tích trình tự đa gen xây dựng phát sinh chủng loại 24 2.2.7 Tách chiết chất kháng nấm kháng khuẩn 24 2.2.8 Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn 25 2.2.9 Xác định đặc tính sinh hóa lý chất kháng nấm kháng khuẩn 26 2.2.10 Thử nghiệm tính an toàn chất kháng nấm kháng khuẩn 27 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 3.1 Lựa chọn chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum đánh giá đặc tính sinh học chủng nghiên cứu 28 3.1.1 B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam 28 3.1.2 Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn 28 3.1.3 Enzyme ngoại bào 32 3.1.4 Khả phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 33 3.2 Phân tích đa dạng kiểu gen chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum .34 3.2.1 Phân tích dấu vân tay rep-PCR .34 3.2.2 Phân tích trình tự đa gen .36 ii 3.3 Tách chiết, tinh xác định chất sinh học chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 39 3.3.1 So sánh hiệu tách chiết chất kháng nấm chất kháng khuẩn 39 3.3.2 Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn 40 3.3.3 Xác định tính chất chất kháng nấm kháng khuẩn .41 3.4 Thử nghiệm tính an tồn chất kháng nấm chất kháng khuẩn 46 3.4.1 Thử nghiệm nẩy mầm hạt .47 3.4.2 Thử nghiệm khả sinh trưởng 47 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 57 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thông tin 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum Bảng 3.2 Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn Bảng 3.3 Khả sinh loại enzyme ngoại bào Bảng 3.4 Khả phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trưởng IAA Bảng 3.5 Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn dịch chiết thô Bảng 3.6 Khả bền nhiệt chất kháng nấm kháng khuẩn Bảng 3.7 Khả bền pH chất kháng nấm chất kháng khuẩn Bảng 3.8 Khả bền với enzyme thủy phân Bảng 3.9 Khả nẩy mầm hạt xử lý với chất kháng sinh Bảng 3.10 Khả sinh trưởng non xử lý với chất kháng sinh iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mối quan hệ phát sinh chủng loại lồi Bacillus nhóm lớn Hình 1.2 Kết phân loại vi khuẩn Bacillus phần mềm ApiwebTM Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi peptide chất kháng sinh polymyxin Hình 1.4 Cấu trúc chất kháng sinh iturin Hình 1.5 Cấu trúc nhóm kháng sinh fengysin Hình 1.6 Cấu trúc lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ceraxin Hình 3.1 Sơ đồ mối tương đồng kiểu gen xây dựng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC Hình 3.2 Sơ đồ mối tương đồng kiểu gen xây dựng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5 Hình 3.3 Mối quan hệ chủng SP 1901 CP 1604 phát sinh chủng loại loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC chất kháng nấm chất kháng khuẩn tinh từ dịch nuôi cấy chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 Hình 3.5 Khối phổ phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm phân đoạn chất có hoạt tính kháng khuẩn Hình 3.6 Hoạt tính chất kháng nấm chất kháng khuẩn xử lý nhiệt nhiệt độ khác v CÁC CHỮ VIẾT TẮT API: Thanh định danh API (Anatical Profile Index) D: Đường kính ( Diameter) Da: Daton Dab: 2,4 - diaminobutyric acid GTTB: Giá trị trung bình HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao IAA: Hóc mơn thực vật IAA (Indole-3-Acetic Acid) KBT: Khoảng biến thiên MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) MS: Khối phổ (Mass Spectrometry) NA: Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar) NRPSs: Enzyme sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome (NonRibosomal Peptide Synthetases) PCR: Phản ứng khuếch đại ADN PDA: Thạch khoai tây (Potato Dextrose Agar) vi MỞ ĐẦU Chi Bacillus nhóm lồi vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng rãi hệ sinh thái Bacillus có khả sinh nội bào tử, dạng nghỉ tế bào để giúp vi khuẩn chống chịu tồn trước điều kiện bất lợi môi trường khô hạn thiếu dinh dưỡng Theo hệ thống phân loại nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài loài phụ loài Trong số đó, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum (hay cịn gọi B velezensis, B methylotrophicus B oryzicola) tám lồi vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis Đây loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho trồng khả sinh chất kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh enzyme thủy phân có khả tăng cường tính miễn dịch chống lại xâm nhiễm loại vi sinh vật gây bệnh Do sở hữu đặc tính quý, vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu cấp độ từ giải mã hệ genome đến nghiên cứu chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng nhà kính ngồi thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập, đánh giá đặc tính có lợi ứng dụng đấu tranh sinh học để phòng ngừa loại dịch bệnh hại trồng Một số chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học chế phẩm phòng trừ bệnh Nhiều báo cáo công bố hiệu sử dụng chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phòng trừ làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh mức độ nhiễm bệnh vi khuẩn nấm gây bệnh gây Sản lượng nông sản thu hoạch tăng lên đáng kể bổ sung chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 vào phân bón B amyloliquefaciens subsp plantarum sản sinh nhiều loại chất trao đổi bậc hai có hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh Các chất trao đổi bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore protein kháng khuẩn Đa số chất tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized TÀI LIỆU THAM KHẢO Abriouel, H., C M Franz, N Ben Omar and A Galvez (2011), "Diversity and applications of Bacillus bacteriocins", FEMS Microbiol Rev, 35, pp 201-232 Arguelles-Arias, A., M Ongena, B Halimi, Y Lara, A Brans, B Joris and P Fickers (2009), "Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens", Microb Cell Fact, 8, pp 63 Ash, C., F J.A.E., A Wallbank and S M D Collin (1991), "Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of smallsubunit-ribosomal RNA sequences", Letters in Applied Microbiology, 13, pp 202-206 Borriss, R., X H Chen, C Rueckert, J Blom, A Becker, B Baumgarth, B Fan, R Pukall, P Schumann, C Sproer, H Junge, J Vater, A Puhler, and H P Klenk (2011), "Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens subsp nov and Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum subsp nov based on complete genome sequence comparisons", Int J Syst Evol Microbiol, 61, pp 1786-1801 Chakraborty, K., B Thilakan, and V K Raola (2014), "Polyketide family of novel antibacterial 7-O-Methyl-5′-hydroxy-3′-heptenoate-macrolactin from seaweed-associated Bacillus subtilis MTCC 10403", J Agric Food Chem, 62, pp 12194-12208 Chen, X H., J Vater, J Piel, P Franke, R Scholz, K Schneider, A Koumoutsi, G Hitzeroth, N Grammel, A W Strittmatter, G Gottschalk, R D Sussmuth, and R Borriss (2006), "Structural and functional chracterization of three polyketide systhase gene clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB42", J Bacteriol, 188, pp 4024-4036 50 Chen, D., X Liu, C Li, W Tian, Q Shen, and B Shen (2014), "Isolation of Bacillus amyloliquefaciens S20 and its application in control of eggplant bacterial wilt", J Environ Manage, 137, pp 120-127 Chowdhury, S P., A Hartmann, X Gao, and R Borriss (2015), "Biocontrol mechanism by root-associated Bacillus amyloliquefaciens FZB42 - a review", Front Microbiol, 6, pp 780 Chun, J., J H Lee, Y Jung, M Kim, S Kim, B K Kim and Y W Lim (2007), "EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences", Int J Syst Evol Microbiol, 57(Pt 10), pp 2259-2261 10 Chung, E J., M T Hossain, A Khan, K H Kim, C O Jeon, and Y R Chung (2015), "Bacillus oryzicola sp nov., an Endophytic Bacterium Isolated from the Roots of Rice with Antimicrobial, Plant Growth Promoting, and Systemic Resistance Inducing Activities in Rice", Plant Pathol J, 31, pp 152-164 11 Cochrance, S A and J C Vederas (2014), "Lipopeptides from Bacillus and Paenibacillus spp.: A golden mine of antibiotic cadidates", Med Res Rev, 36, pp 4-31 12 Copping L G and J J Mann (2000), "Biopesticides: a review of their action, applications and efficacy", Pest Mag Sci, 56, pp 651-676 13 Dunlap, C A., S J Kim, S W Kwon, and A P Rooney (2015), "Bacillus velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum and 'Bacillus oryzicola' are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based on phylogenomics", Int J Syst Evol Microbiol 14 Dworkin, M., S Falkow, E Rosenberg, K H Schleifer and E Stackebrandt (2006), "The Prokaryotes" 15 Freitas D B., M P Reis, C I Lima-Bittencourt, P S Costa, P S Assis, E Chartone-Souza, and A M Nascimento (2008), "Genotypic and phenotypic 51 diversity of Bacillus spp isolated from steel plant waste", BMC Research Notes, 1, pp 92-103 16 Gabor E M., Vreis E J., and D B Janssen (2003), "Efficient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods", FEMS Microbiol Ecol, 44, pp 153-163 17 Glickmann E and Y Dessaux (1995), "A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria", Appl Environ Microbiol, 61, pp 793-796 18 Goldman, E and L H Green (2009), "Practical handbook of microbiology" 19 Gong, M., J Wang, J Zhang, H Yang, X Lu, Y Pei, and J Cheng (2006), "Study of the antifungal ability of Bacillus subtilis strain PY-1 in vitro and identification of its antifungal substance (iturin A)", Acta Bioch Bioph Sin, 38, pp 233-240 20 Gong, A D., H P Li, Q S Yuan, X S Song, W Yao, W J He, J B Zhang, and Y C Liao (2015), "Antagonistic mechanism of iturin A and plipastatin A from Bacillus amyloliquefaciens S76-3 from wheat spikes against Fusarium graminearum", PLoS One, 10, pp 0116871 21 Gustafson, K., M Roman, and W Fenical (1989), "The macrolactins, a novel class of antiviral and cytotoxic macrolides from a deep-sea marine bacterium", J Am Chem Soc, 111, pp 7519-7524 22 Han, Y., B Zhang, Q Shen, C You, Y Yu, P Li, and Q Shang (2015), "Purification and Identification of Two Antifungal Cyclic Peptides Produced by Bacillus amyloliquefaciens L-H15", Appl Biochem Biotechnol, 176, pp 22022212 23 He, Z., D Kisla, L Zhang, C Yuan, K B Green-Church, and A E Yousef (2007), "Isolation and identification of a Paenibacillus polymyxa strain that coproduces a novel lantibiotic and polymyxin", Appl Environ Microbiol, 73, pp 168-178 52 24 He, S., H Wang, X Yan, P Zhu, J Chen, and R Yang (2013), "Preparative isolation and purification of macrolactin antibiotics from marine bacterium Bacillus amyloliquefaciens using high-speed counter-current chromatography in stepwise elution mode", J Chromatogr A, 1272, pp 15-19 25 Holman W I M (1943), "A new technique for the determination of phosphorus by the molyndenum blue method", Biochem, 37, pp 256-259 26 Hopwood D.A (2007), "Streptomyces in Nature and Medicine: The antibiotic Makers", Oxford Univesity Press 27 Huang, J., Z Wei, S Tan, X Mei, Q Shen, and Y Xu (2014), "Suppression of bacterial wilt of tomato by bioorganic fertilizer made from the antibacterial compound producing strain Bacillus amyloliquefaciens HR62", J Agric Food Chem, 62, pp 10708-10716 28 Idriss, E E., O Makarewicz, A Farouk, K Rosner, R Greiner, H Bochow, T Richter and R Borriss (2002), "Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect", Microbiology, 148(Pt 7), pp 2097-2109 29 Kubo Y., Rooney A., Tsukakoshi Y., Nakagawa R., Hasegawa H., and K Kimura (2011), "Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to Natto (fermented soybean) production", Appl Environ Microbiol, 77, pp 64636469 30 Ji, S H., N C Paul, J X Deng, Y S Kim, B S Yun, and S H Yu (2013), "Biocontrol Activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against Fungal Plant Diseases", Mycobiology, 41, pp 234-242 31 Kim D H., H K Kim, K M Kim, C K Kim, M H Jeong, K H Moon, and J S Kang (2011), "Antibacterial activities of macrolactin A and 7-O-succinyl macrolactin A from Bacillus polyfermenticus KJS-2 against vancomycinresistant enterococci and methicillin-resistant Staphylococcus aureus", Arch Pharm Res, 34, pp 147-152 53 32 Kang, S M., R Radhakrishnan, and I J Lee (2015), "Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum GR53, a potent biocontrol agent resists Rhizoctonia disease on Chinese cabbage through hormonal and antioxidants regulation", World J Microbiol Biotechnol, 31, pp 1517-1527 33 Lecadet, M M., E Frachon, V C Dumanoir, H Ripouteau, S Hamon, P Laurent and I Thiery (1999), "Updating the H-antigen classification of Bacillus thuringiensis", J Appl Microbiol, 86(4), pp 660-672 34 Lee, H and H Y Kim (2011), "Lantibiotics, class I bacteriocins from the genus Bacillus", J Microbiol Biotechnol, 21(3), pp 229-235 35 Madhaiyan, M., S Poonguzhali, S W Kwon, and T M Sa (2010), "Bacillus methylotrophicus sp nov., a methanol-utilizing, plant-growth-promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil", Int J Syst Evol Microbiol, 60, pp 2490-2495 36 Maragakis, L L and T M Perl (2008), "Acinetobacter baumannii: epidemiology, antimicrobial resistance, and treatment options", Clin Infect Dis, 46(8), pp 1254-1263 37 Meena K R and S S Kanwar (2015), "Lipopeptides as the antifungal and antibacterial agents: Application in food safety and therapeutics", Biomed Res Int, pp 173050 38 Moyes, R B., J Reynolds and D P Breakwell (2009) "Differential staining of bacteria: gram stain", Curr Protoc Microbiol, 39 Romero-Tabarez, M., R Jansen, M Sylla, H L nsdorf, S H ußler, D A Santosa, K N Timmis, and G Molinari (2006), "7-O-Malonyl macrolactin A, a new macrolactin antibiotic from Bacillus subtilis active against methicillinresistant Staphylococcus aureus, vancomycin-resistant enterococci, and a smallcolony variant of Burkholderia cepacia", Antimicrob Agents Chem, 50, pp 1701-1709 40 Rooney, A P., N P Price, C Ehrhardt, J L Swezey, and J D Bannan (2009), "Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex 54 and description of Bacillus subtilis subsp inaquosorum subsp nov", Int J Syst Evol Microbiol, 59, pp 2429-2436 41 Ruiz-Garcia, C., V Bejar, F Martinez-Checa, I Llamas, and E Quesada (2005), "Bacillus velezensis sp nov., a surfactant-producing bacterium isolated from the river Velez in Malaga, southern Spain", Int J Syst Evol Microbiol, 55, pp 191-195 42 Pyoung, K., J Ryu, Y H Kim, and Y T Chi (2010), "Production of biosurfactant lipopeptides iturin A, fengycin, and surfactin a from Bacillus subtilis CMB32 for control of Colletotrichum gloeosporioides", J Microbiol Biotechn, 20, pp 138-145 43 Schneider, K., X H Chen, J Vater, P Franke, G Nicholson, R Borriss, and R D Sussmuth (2007), "Macrolactin is the polyketide biosysthesis product of the pks2 cluster of Bacillus amyloliquefaciens FZB42", J Nat Prod, 70, pp 14171423 44 Shivaji, S., P Chaturvedi, K Suresh, G S Reddy, C B Dutt, M Wainwright, J V Narlikar and P M Bhargava (2006), "Bacillus aerius sp nov., Bacillus aerophilus sp nov., Bacillus stratosphericus sp nov and Bacillus altitudinis sp nov., isolated from cryogenic tubes used for collecting air samples from high altitudes", Int J Syst Evol Microbiol, 56(Pt 7), pp 1465-1473 45 Van D T T., B N H Linh, D V Hop, D M Phuong, and T T Trung (2014), "Identification of antibiotic-producing Bacillus sensu lato isolated from national parks of Hoang Lien and Phu Quoc in Vietnam", J Viet Env, 6, pp 77-83 46 Vos, P D., G M Garrity, D Jones, N R Krieg, W Ludwig, F A Rainey, K H Schleifer and W B Whitman (2009), "BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology" 47 Wang, X., and G Liang (2014), "Control efficacy of an endophytic Bacillus amyloliquefaciens strain BZ6-1 against peanut bacterial Wilt, Ralstonia solanacearum", Biomed Res Int, pp 465435 55 48 Wu, Y., J Yuan, W Raza, Q Shen, and Q Huang (2014), "Biocontrol traits and antagonistic potential of Bacillus amyloliquefaciens strain NJZJSB3 against Sclerotinia sclerotiorum, a causal agent of canola stem rot", J Microbiol Biotechnol, 24, pp 1327-1336 49 Yuan J, Li B, Zhang N, Waseem R, Shen Q & Huang Q (2012), "Production of bacillomycin- and macrolactin-type antibiotics by Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 for suppressing soilborne plant pathogens", J Agric Food Chem, 60, pp 2976-2981 56 PHỤ LỤC Hình ảnh hoạt tính enzyme chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum Hình ảnh vịng phân giải chất tinh bột tan 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái Việt Nam Thứ tự chủng trình bày bảng 3.1 Hình ảnh vịng phân giải chất casein 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái Việt Nam Thứ tự chủng trình bày bảng 3.1 57 Hình ảnh vòng phân giải chất tributyrin 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái Việt Nam Thứ tự chủng trình bày bảng 3.1 Trình tự đa gen chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 >Seq1 [organism= B amyloliquefaciens subsp plantarum] strain CP 1604 gyrase subunit alpha (gyrA) gene, partial cds GCGTTATCGTATCCCGGGCGCTTCCGGATGTGCGTGACGGTCTGAAGCCGGTTCACAGACGGAT TTTGTACGCAATGAATGATTTAGGCATGACCAGTGACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATC GTCGGTGAAGTTATCGGTAAGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCGGTTTACGAATCAATGGTCA GAATGGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTTGTTGACGGACACGGCAACTTCGGTTCGGT TGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAGCGAGAATGTCAAAAATCGCAATGGA AATTCTGCGTGACATTACGAAAGACACGATTGACTATCAAGATAACTATGACGGTTCAGAAAG AGAGCCTGCCGTCATGCCTTCGAGATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGGGCTGCCGGTATTGCG GTCGGAATGGCGACAAACATTCCCCCGCATCAGCTTGGGGAAGTCATTGAAGGCGTGCTTGCCG TAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCAGGAGCTGATGGAATACATCCCGGGCCCGGATTTTCC GACTGCAGGTCAGATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGGGGATC AATCACGATCCGGGCTAAGGCTGAAATCGAAGAGACTTCATCGGGAAAAGAAAGAATTATTGT CACGGAACTTCCTTATCAGGTGAACAAAGCGAGATTAATTGAAAAAATCGCGGATCTTGTCCGG GACAAAAAAATCGAAGGAATTACCGATCTGCGAGACGAATCCGACCGTAACGGAATGAGAATC GTCATTGAGATCCGCCGTGACGCCAATGCTCACGTCATTTTGAATAACCTGTACAAACAAACGG CCCTGCAGACGTCTTTCGGAATCAACCTGCTGGCGCT >Seq2 [organism= B amyloliquefaciens subsp plantarum] strain CP 1604 polymerase subunit beta (rpoB) gene, partial cds 58 AAAGATGATGTATACACATCTATTCACATTGAAGAATATGAATCAGAAGCACGTGATACAAAG CTTGGACCGGAAGAGATCACCCGCGATATTCCAAACGTAGGGGAAGACGCGCTTCGCAACCTT GATGACCGCGGAATTATCCGTATCGGTGCGGAAGTCAACGACGGAGACCTTCTCGTAGGTAAA GTAACGCCTAAAGGTGTAACTGAGCTTACGGCTGAAGAACGCCTTCTTCATGCGATCTTTGGAG AAAAAGCGCGTGAAGTCCGTGATACTTCTCTCCGTGTGCCTCACGGCGGCGGCGGAATTATCCA CGACGTAAAAGTCTTCAACCGTGAAGACGGCGACGAACTTCCTCCGGGAGTGAACCAGCTTGT ACGCGTATATATCGTTCAGAAACGTAAGATTTCTGAAGGTGATAAAATGGCCGGACGTCACGG AAATAAAGGGGTTATCTCGAAGATTCTTCCTGAAGAAGATATGCCTTACCTTCCTGACGGCACG CCGATCGATATCATGCTTAACCCGCTGGGTGTACCATCACGTATGAATATCGGTCAGGTATTAG AACTTCACATGGGTATGGCTGCCCGCTACCTCGGCATTCACATCGCGTCACCTGTATTTGACGGC GCGCGTGAAGAAGATGTGTGGGAAACACTTGAAGAAGCAGGCATGTCAAGAGACGCTAAAAC AGTTCTTTATGACGGCCGTACGGGAGAACCGTTCGACAACCGTGTATCAGTCGGAATCATGTAC ATGATCAAACTGGCTCACATGGTTGACGATAAACTTCATGCCCGTTCTACAGGTCCTTACTCACT TGTTACGCAGCAGCCTCTCGGCGGTAAAGCCCAATTCGGCGGACAGCGTTTCGGTGAGATGGAG GTTTGGGCGCTTGAAGCTTACGGCGCAGCTTACACGCTTCAAGAAATCCTGACTGTGAAGTCCG ATGACGTGG >Seq3 [organism= B amyloliquefaciens subsp plantarum] strain CP 1604 phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase (purH) gene, partial cds AAAACTTCTTCAGGAAAACGGTGTGGATGTCATCGGCATTTCAGAAGTGACCGGATTTCCTGAA ATTATGGACGGACGGTTAAAAACACTCCATCCTAATATTCACGGCGGACTGCTTGCCGTAAGAG ACAATGAAGAGCATATGGCGCAGATCAATGAGCACGGCATTGCACCGATTGACCTTGTGGTCGT CAACCTTTATCCGTTTAAAGAAACGATTTCAAAAGAAGACGTAACATACGATGAAGCGATAGA AAACATTGATATCGGCGGTCCCGGCATGCTGCGCGCCGCATCGAAAAACCATCAGGATGTGAC GGTCATCACAGATCCGGCCGATTACAGCTCCGTGCTCAATGAGATGAAAGAACACGGCGGCGT TTCGCTCAAAAGAAAACGCGAGCTTGCGGCCAAAGTATTCCGCCATACTGCGGCATACGACGC ATTAATCGCTGATTACTTAACACGCGAGGCCGGTGAGAAAGACCCTGAGCAATTCACTGTTACT TTTGAGAAAAAACAGTCGCTCCGCTACGGTGAAAACCCTCACCAAGAGGCGGTTTTCTACCAAA GCGCACTTCCTGTCTCCGGTTCCATCGCGGCGGCAAAACAGCTTCACGGCAAAGAGCTTTCTTA CAACAATATTAAGGACGCGGATGCGGCCGTTCAAATCGTCCGGGAATTTACAGAACCCGCAGC TGTTGCCGTTAAACATATGAATCCATGCGGAGTCGGTACGGGAGCTTCAATTGAGGAAGCATTC AATAAAGCGTATGAAGCTGATAAAACCTCCATTTTCGGCGGCATCATCGCGCTGAACCGTGAAG TTGATCAGGCAACGGCTGAAGCCCTTCACGGCATCTTTTTAGAAATCA >Seq4 [organism= B amyloliquefaciens subsp plantarum] strain CP 1604 polymerase C (polC) gene, partial cds 59 GATATGGGATTTTTAAATGTGGCGTACAAGCGTCTTTTGAAAACGGAAAAAGCGAAAAATCCG GTCATTGATACGCTGGAACTCGCGCGTTTCCTGTATCCTGAATTTAAAAATCACCGCTTAAATAC GTTATGTAAGAAGTTTGATATCGAATTAACCCAGCATCACCGAGCGGTCTTTGACGCTGAAGCA ACGGGCTACCTGCTGTTGAAAATGCTCAAAGATGCCGCTGAAAAAGACATTTTTTATCATGATC AGCTGAATGAGAATATGGGACAATCCAATGCTTATCAAAGATCAAGGCCTTATCACGCTACATT GCTTGCCGTAAATGAGACCGGCCTTAAAAATCTGTTTAAGCTCGTGTCCATTTCTCATATTCAAT ATTTCTACAGAGTGCCGCGCATTCCGAGGTCGCAGCTTAATAAATACAGAGAAGGTCTGTTAAT CGGCTCTGCCTGTGACAGGGGAGAGGTCTTTGAAGGCATGATGCAAAAATCACCTGAAGAGGT TGAAGATATCGCATCATTCTATGATTATCTTGAAGTGCAGCCGCCGGAAGTATACAGACACCTT CTGCAGCTTGAGCTCGTCCGGGATGAAAAAGCGCTGAAAGAAATCATCGCCAACATCACGAAG CTCGGGGAAAAATTGAATAAGCCGGTCGTTGCCACCGGAAATGTTCACTATTTAAACGATGAGG ACAAAATTTACCGGAAGATCTTAATATCTTCCCAAGGCGGCGCCAACCCGTTAAACCGGCACGA ACTGCCTAAA >Seq5 [organism=Bacillus velezensis] strain CP 1604 GroEL (groEL) gene, partial cds TTACATGGTGACTGACTCTGATAAGATGGAAGCGGTTCTTGACAATCCTTACATCTTAATCACA GACAAAAAAATCACAAACATTCAAGAAATCCTTCCTGTGCTTGAGCAAGTTGTACAGCAAGGC AAACCATTGCTTCTGATCGCTGAAGATGTTGAAGGTGAAGCTCTTGCTACACTCGTTGTCAACA AACTTCGCGGCACATTCAACGCTGTTGCCGTTAAAGCTCCTGGCTTCGGTGACCGCCGTAAAGC AATGCTTGAAGACATCTCTGTTCTTACAGGCGGAGAAGTAATCACAGAAGACTTAGGCCTTGAC CTGAAATCTACTGAAATCGGACAATTGGGACGCGCTTCTAAAGTTGTGGTAACGAAAGAAAAC ACAACAATCGTAGAAGGCGCCGGCGACACTGAAAAAATCGCAGCTCGCGTTAACCAAATCCGC GCTCAAGTGGAAGAAACAACTTCTGAATTCGACAGAGAAAAATTACAAGAGCGTCTTGCGAAA CTTGCCGGCGGCGTAGCTGTCATCAAAGTCGGCGCTGCGACTGAAACTGAGCTGAAAGAGCGT AAACTTCGCATCGAAGACGCCCTCAACTCAACTCGCGCAGCTGTTGAAGAAGGTATCGTATCCG GCGGTGGTACAGCGCTTGTCAACGTATACAACAAAGTCGCTGCAGTGGAAGCTGAAGGCGATG CGCAAACAGGTATCAACATCGTGCTTCGCGCGCTTGAAGAGCCGATCCGTCAAATCGCACACAA TGCAGGACTTGAAGGATCTGTCATCGTTGAGCGCCTGAAAAATGAAAAAATCGGCGTAGGCTTC AACGCTGCA >Seq6 [organism= B amyloliquefaciens subsp plantarum] strain CP 1604 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATA AAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAC GGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGAC 60 GGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAAC AAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGC TCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAA CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGT GTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGA CGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCT AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAG CCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCG Hình ảnh kháng loại vi sinh vật kiểm định Hình ảnh hoạt tính kháng S hydrophilum 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái Việt Nam Thứ tự chủng trình bày bảng 3.1 61 Hình ảnh hoạt tính kháng X oryzae 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái Việt Nam Thứ tự chủng trình bày bảng 3.1 Hình ảnh thử nghiệm tính an tồn chất kháng nấm kháng khuẩn tách chiết từ chủng CP 1604 ĐC TN Hình ảnh hạt ngơ nảy mầm sau ngày 62 ĐC TN Hình ảnh hạt thóc nảy mầm sau ngày ĐC TN Hình ảnh lúa sau ngày phun chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy chiết thô chủng CP 1604 63 ĐC TN Hình ảnh ngơ sau ngày phun chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy chiết thô chủng CP 1604 ĐC TN Hình ảnh lạc sau ngày phun chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy chiết thô chủng CP 1604 64 ... PHƢƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16. 04 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 6042 0107 LUẬN... chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1 604 39 3.3.1 So sánh hiệu tách chiết chất kháng nấm chất kháng khuẩn 39 3.3.2 Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn. .. kháng nấm kháng khuẩn 24 2.2.8 Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn 25 2.2.9 Xác định đặc tính sinh hóa lý chất kháng nấm kháng khuẩn 26 2.2.10 Thử nghiệm tính an tồn chất kháng nấm kháng khuẩn