Nghiên cứu điều kiện lên men và thu hồi một số hoạt chất sinh học của chủng nấm cordyceps militaris FNA5

Nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ các chủng nấm ... Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của chủng nấm trong hệ thống bình lên men 5 lít

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOẠT CHẤT SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps militaris FNA5

Giáo viên hướng dẫn: TS Phí Quyết Tiến

TS Phạm Thanh Huyền Sinh viên: Nguyễn Thị Thu Hiền

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía Thầy cô, bạn bè và người thân

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, em xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Phí Quyết Tiến, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; TS Phạm Thanh Huyền, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là hai Thầy cô đã tạo điều kiện, tận tâm hướng dẫn em từ những bước đi chập chững đầu tiên, những bước tiếp cận đầu tiên trong nghiên cứu khoa học

Em xin được gửi lời cảm ơn tới các Thầy cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học, các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến giúp em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị làm việc tại Phòng Công nghệ lên men và các bạn sinh viên đã dành thời gian quý giá của mình để giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập để đạt được kết quả tốt nhất

Và cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, giúp em vượt qua rất nhiều khó khăn cả trong công việc, cuộc sống và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp một cách thuận lợi nhất

Hà Nội, tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về chủng nấm Đông trùng hạ thảo 3

1.1.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo 3

1.1.2 Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 6

1.2 Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo 7

1.2.1 Cordycepin 7

1.2.2 Adenosine 9

1.2.3 Polysaccharide 9

1.2.4 Các hợp chất khác 10

1.3 Giá trị dược liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con người 12

1.4 Ứng dụng công nghệ lên men chìm nấm Cordyceps spp để sản xuất sinh khối và exopolysaccharide (EPS) 14

1.5 Thu hồi sinh khối và hoạt chất từ Cordyceps spp 17

1.6 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong và ngoài nước 18

1.6.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới 18

1.6.2 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam 19

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Chủng giống 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 20

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp bảo quản giống 21

2.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 21

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm 22

2.2.3.1 Nhiệt độ lên men 22

2.2.3.2 pH môi trường lên men 22

2.2.3.3 Tỷ lệ tiếp giống 23

2.2.4 Phương pháp xác định các chất có hoạt tính dược học của nấm Đông trùng hạ thảo 23

2.2.4.1 Xác định Cordycepin 23

2.2.4.2 Xác định Polysaccharide 24

2.2.5 Nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ các chủng nấm 25

2.2.5.1 Phương pháp tách chiết Cordycepin 25

2.2.5.2 Phương pháp tách chiết Polysaccharide 26

3.1 Đặc điểm sinh học các chủng nấm ký sinh côn trùng 27

3.2 Lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp 28

3.3 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 31

3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển của chủng nấm 32 3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 33

3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu 34

3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ 36

3.4.4 Ảnh hưởng của thể tích 38

3.5 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của chủng nấm (trong hệ thống bình lên men 5 lít) 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng phân loại khoa học 3

Bảng 1.2 Mô tả hình thái một số loài nấm thuộc chi Cordyceps 5

Bảng 3.1 Đặc điểm sinh học của các chủng nấm ký sinh côn trùng 27

Bảng 3 2 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm C militaris FNA5 trên các môi

trường khác nhau theo thời gian nuôi cấy 28

Bảng 3 3 Khả năng phát triển của chủng C militaris FNA5 trên các nhiệt độ

khác nhau theo thời gian (đường kính khuẩn lạc, cm) 33

Bảng 3 4 Lượng sinh khối thu được chủng C militaris FNA5 trên các giá trị

pH khác nhau theo thời gian 35

Bảng 3 5 Lượng sinh khối thu được chủng C militaris FNA5 trên các giá trị

nồng độ khác nhau theo thời gian 37

Bảng 3 6 Lượng sinh khối thu được chủng C militaris FNA5 trên các giá trị

thể tích khác nhau theo thời gian 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm Đông trùng hạ thảo loài Cordyceps militaris 4 Hình 1.2 Một số hình thái của các chủng nấm thuộc chi Cordyceps 5 Hình 1.3 Hình thái tự nhiên một số loài nấm :A- C sinensnis; B-C gunnii; C-C barnesii; D- C gracilis; E- C liangshanensis; F-C militaris 6

Hình 1 4 Cấu trúc hóa học của Cordycepin và Adenosine 8

Hình 3.1 Hình ảnh bề mặt khuẩn lạc chủng FNA5 trên đĩa thạch sau 15 ngày nuôi cấy 28 Hình 3.2 Hình thái túi bào tử lúc mới nẩy mầm và bào tử khi trưởng thành chủng FNA5 sau 10 ngày nuôi cấy (SEM, x 3.500 và 7.500 lần) 29

Hình 3 3 Hình thái khuẩn lạc chủng C militaris FNA5 trên các môi trường

rắn theo thời gian nuôi cấy 29

Hình 3 4 Biểu đồ đường kính khuẩn lạc của chủng C militaris FNA5 trên

các môi trường khác nhau theo thời gian (đường kính khuẩn lạc, cm) 31

Hình 3.5 Biểu đồ sự ảnh hưởng của các môi trường khác nhau tới khả năng

phát triển của chủng C militaris FNA5 theo thời gian nuôi cấy 31

Hình 3.6 Biểu đồ sự ảnh hưởng của các môi trường khác nhau tới khả năng

sinh EPS của chủng C militaris FNA5 theo thời gian nuôi cấy 31 Hình 3.7 Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa CNLM của dịch sau lên men chủng C militaris FNA5 trên môi trường MPA

theo thời gian nuôi cấy 32 Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng nấm FNA5 trên đĩa petri sau 7 ngày 33

Hình 3 9 Khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm C militaris FNA5 ở

các giá trị pH khác nhau 35

Hình 3 10 Hàm lượng EPS thu được chủng C militaris FNA5 trên các giá trị

pH khác nhau theo thời gian 36

Hình 3 11 Khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm C militaris FNA5 ở

các tỷ lệ giống 37

Hình 3 12 Hàm lượng EPS thu được chủng C militaris FNA5 trên các giá trị

nồng độ khác nhau theo thời gian 38

Hình 3 13 Khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm C militaris FNA5 ở

các thể tích khác nhau 38

Hình 3 14 Hàm lượng EPS thu được chủng C militaris FNA5 trên các giá trị

thể tích khác nhau theo thời gian 39

Hình 3 15 Chu kỳ sinh trưởng của chủng C militaris FNA5 trong thời gian

18.5 ngày 40 Hình 3 16 Kết quả đo phổ xác định hàm lượng cordycepin trong dịch lên

men của chủng nấm C militaris FNA5 41

DANH MỤC VIẾT TẮT

EPS Exopolysaccharide (Extracellular polysaccharide)

Polysaccharide ngoại bào

Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thảo đã được các nhà khoa học nghiên cứu và thu được rất nhiều thành tựu có giá trị Với công nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong việc nuôi cấy nhân tạo các chủng

nấm thuộc chi Cordyceps và thương mại hóa các sản phẩm của chúng.Hiện

nay, với phương pháp lên men được sử dụng chủ đạo, các sản phẩm thương mại sinh khối nấm ký sinh đã được sản xuất rất thành công ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ Các chất chiết xuất sau quá trình lên men chứa đầy

đủ các hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự như nấm ký sinh nguồn gốc tự nhiên

Ở Việt Nam việc nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo vẫn còn gặp nhiều khó khăn cả về cơ sở vật chất cũng như kiến thức Chúng ta sử dụng chủ yếu dựa trên khai thác tự nhiên hay nhập khẩu từ Trung Quốc, nguồn gốc

và chất lượng không rõ ràng, giá cả đắt đỏ và không đáp ứng được nhu cầu cho xã hội

Để góp phần vào nghiên cứu và phát triển nâng cao thị trường sản xuất nấm dược liệu Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu điều kiện lên men và thu hồi một số hoạt chất sinh học của chủng nấm Cordyceps militaris FNA5” Với mục đích tìm ra được điều kiện

nuôi cấy phù hợp nhằm tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học bởi chủng

nấm Cordyceps militarisFNA5 Đồng thời đóng góp một phần nhỏ bé trong

việc xây dựng nền công nghiệp dược ở trong nước

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Xác định được một số điều kiện lên men nấm Cordyceps militaris

FNA5 và điều kiện thu hồi một số dược chất polysaccaride, cordycepin từ sinh khối và dịch lên men của nấm nhằm ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

a Đối tượng nghiên cứu

- Chủng nấm Cordyceps militaris FNA5phân lập tại Việt Nam, nhận từ

bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

b Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu một số điều kiện lên men (môi trường, tỷ lệ tiếp giống, sục

khí, pH…) chủng nấm Cordyceps militaris FNA5 quy mô 5 lít/mẻ để

sinh tổng hợp cordycepin, polysaccharide

- Nghiên cứu điều kiện tách chiết thu hồi các chất có hoạt tính sinh học cordycepin, polysaccharide

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chủng nấm Đông trùng hạ thảo

1.1.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo

Hàng ngàn năm nay, Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) được coi là thần

dược trong y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc.Trong y học cổ truyền Trung Quốc, “Đông Trùng, Hạ Thảo” dùng để chữa các bệnh về phổi và hô hấp, thận, gan, tim mạch; trị bệnh yếu sinh lý và cao huyết áp; trị rối loạn

miễn dịch và chống ung thư (Zhou et al., 1998a,b).Tại viện Nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc), nấm Đông trùng hạ thảo đã được dùng để chữa liệt dương có hiệu quả tốt Vì vậy, nấm đông trùng hạ thảo được người Trung Quốc xem như một loại dược tảo quý, chỉ dùng cho vua chúa và người giàu

Nấm Cordyceps là một giống nấm túi, được các nhà khoa học Trung

Quốc phát hiện lần đầu tiên ở vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu

quý này thực chất là ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes hoặc Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc ký sinh (Bảng 1.1.)

Bảng 1.1 Bảng phân loại khoa học Giới (Regnum) Fungi

Ngành (phylum) Ascomycota

Lớp (Class) Ascomycetes

Bộ (Ordo) Hypocreales

Họ (Familia) Clavicipataceae

Chi (Genus) Cordyceps

Loài (Species) C militaris

Đông trùng hạ thảo còn có tên gọi khác là Trùng thảo hay Hạ thảo đông

trùng Chi nấm Cordycepsgồm khoảng 400 loài đã được miêu tả, chỉ riêng Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006)

Tuy nhiên cho đến nay người ta chỉ nghiên cứu nhiều nhất được về 2 loài

Cordyceps sinensis ( Berkeley, 1843) và Cordyceps militaris Link

Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C militaris là một loài

nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông ào tử nấm theo gió d nh vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử h nh thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ

và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh m chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ Đến cuối hè hoặc

thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí (Kobayasi et al., 1982; Kamble et al., 2012) Do đó,nó có tên gọi là nấm Đông trùng hạ thảo Các quả thể nấm C militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng et al., 2011) (Hình 1.1)

Hình 1.1 Nấm Đông trùng hạ thảo loài Cordyceps militaris

Đông trùng hạ thảo ở ngoài tự nhiên , người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 –

11 cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3–5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất Chất đệm nấm hình que cong

mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, có nhiều sợi nấm nên khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà (Đái Duy an và Lưu Tham Mưu, 2009) (Hình 1.2)

Hình 1.2 Một số hình thái của các chủng nấm thuộc chi Cordyceps Bảng 1.2 Mô tả hình thái một số loài nấm thuộc chi Cordyceps

C sinesis

Phần cơ thể giống như nhộng tằm, có chiều dài từ 3-5 cm, đường kính từ 3-8 mm, màu vàng đạm tới vàng nâu

Chất nền hình trụ mảnh, chiều dài 4-7 cm, đường kính khoảng 3 mm, với đỉnh nhọn

Chất nền hình trụ, mập mạp

và thô, 4-14 cm chiều dài và khoảng 4mm, với bulgy vô trùng hoặc phân nhánh đỉnh

C barnesii

Cơ thể ấu trùng cong hình thận, ngắn, 1,5-2 cm chiều dài , đầu nhỏ với một cặp răng

Chất nền duy nhất, thanh mảnh và cong, 2-6 mm chiều dài và khoảng 2mm đường kính

C liangshanensis

Cơ thể ấu trùng giống như một con tằm, dày, chiều dài 3-6 cm, đường kính 6-10

mm, bề mặt bên ngoài màu nâu, nâu sẫm

Chất nền như sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, 10-

30 cm chiều dài, đường kính 1-2 mm

C militaris

Môi chất dinh dƣỡng không

có cơ thể ấu trùng

Chất nền phẳng, hơi cong khoảng 5 cm chiều dài, màu vàng cam đến màu đỏ da cam

Hình 1.3 Hình thái tự nhiên một số loài nấm :A- C sinensnis; B-C gunnii; C-C barnesii; D- C gracilis; E- C liangshanensis; F-C militaris

1.1.2 Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên

Các chủng thuộc chi Cordyceps đƣợc thu mẫu ở các vùng khác nhau

trên toàn thế giới Đông trùng hạ thảo đƣợc tìm thấy vào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000 mét thuộc các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam… Mao và cộng sự (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa cho 13 loài nấm thuộc chi

Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm các loài: Cordyceps barnesii Thwaites, C.capiata (Holmsk.:Fr.) Link., C crassispora Zang, C gunii (Berk.) Berk., C.hawkesiiGray, C kyushuensis Kobayasi, C martialis Gray,

C militaris (L.:Fr.) Link., C nutans Pat., C ophioglossoides (Ehrenb.) Link.,

C sinensis (Berk.) Sacc., C sobolifera (Hill.) Berk Et Br., C tubeculata

(Leb.) Maire

Tuy nhiên theo một số nghiên cứu cho thấy, các thành viên của chi nấm

Cordyceps còn có thể đƣợc tìm thấy ở Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt

Nam (John et al., 2005) Như vậy, có thể thấy thành phần loài nấm Đông

trùng hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều loài

có phạm vi phân bố rộng, các loài có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng vùng

Quả thể của nấm C militaris dùng làm thực phẩm, dùng trong các món

hầm, súp, trà ở các nước Đông Nam Á như Hongkong, Đài Loan, Trung

Quốc Liều lượng an toàn khoảng ít hơn 2.5 g kg thể trọng (Che et al., 2003)

Quả thể và sinh khối nấm cũng được sử dụng làm thuốc và bồi bổ sức khỏe

như nước uống, viên nhộng, rượu, trà… (Wang et al, 2006) Các loại thuốc

từ nấm này dùng duy trì chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hòa giấc

ngủ, viêm phế quản mạn tính (Das et al., 2010) Hiện có hơn 30 loại sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ C militaris trên thi trường (Huang et al.,

2010;Park et al., 2001; Kim et al., 2005; Shin et al., 2007; John & Matt, 2008; Đái Duy an et al., 2009)

1.2 Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo

Trong nấm Cordycepscó các nhóm chất quan trọng là cordycepic acid,

cordycepin và polysaccharide có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh ung thư

và các bệnh do virus Ngoài ba thành phần trên, khi phân tích nấm người ta còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị là N-acetylgalactosamine, adenosine, ergosterol và ergosterol ester, bioxanthracenes, hypoxanthine, polysaccharide và exopolysaccharide, chitinase, cicadapeptins, và myriocin, các chất có hoạt tính sinh học là saccharide (trehalose và polysaccharide), nucleoside (adenosine, inosine và cordycepin), manitol và sterol (ergosterol)

1.2.1 Cordycepin

Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ loài C militaris (Cunningham

et al., 1950) Cordycepin là một hợp chất quan trọng trong nấm đông trùng hạ thảo (Mina et al., 2005), chúng cũng được tìm thấy ở loài C sinensis và C kyushuensis Cordyceps tự nhiên chứa lượng cordycepin vào khoảng 0,006- 6,36 mg/g Trong sinh khối sinh nấm nuôi và quả thể của Cordyceps, hàm

lượng cordycepin ở giai đoạn đầu sau khi được tách và nuôi thường thấp với hàm lượng từ 0,006-1,64 mg/g Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong

tự nhiên, nồng độ cordycepin trong quả thể C militaris cao hơn C sinensis

với hàm lượng lần lượt là 2,65 và 1,64 mg/g, trong khi trong nuôi cấy trong các bình lên men hàm lượng chất này thu được là 1,59 mg g tương đương với

C sinensis trong tự nhiên (Lo et al., 2013)

Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng

của nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đường ribose

Cordycepin được phân lập lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris

Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared), cordycepin được xem như là một hợp chất có hoạt tính sinh học được ly trích

từ quả thể và sợi nấm Cordycepin có công thức C10H13N5O3 và có phân tử lượng 251, điểm nóng chảy tại 230-231oC, độ hấp thu cực đại tại 259 nm Có thể hoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhưng không hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên cứu đã sử dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung môi

Các nhà khoa học thường sử dụng saline để khử trùng và đệm

phosphate để hòa tan cordycepin (Xuanwei et al., 2009) Cordycepin có khả

năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus Gần đây, cordycepin cũng cho thấy khả năng điều hòa sản sản phẩm interleukines trong tế bào lympho T

(Mina et al., 2005) Cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thông qua

Hình 1 4 Cấu trúc hóa học của Cordycepin và Adenosine

methyl hóa acid nucleic, ức chế sự phát triển của Clostridium paraputrificum

và Clostridium pefringens nhưng không có tác động nào tới Bifidobacterium spp và Lactobacillus spp do Ahn và cộng sự đã chứng minh năm 2000 (Lu et al.,2012; Seok et al.,2009)

1.2.2 Adenosine

Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và được cho là phong phú

ở tất cả các loài thuộc chi Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 đến 14,15 mg/g Khi thu nhận nấm Cordyceps spp.trong tự nhiên, nồng độ adenosine là 2,45 ± 0,03 mg/g trong quả thể và ở nấm C militaris cao hơn C sinensis, ở C sinensis hàm lượng chỉ có 1,643±0,03 mg g, trong khi đó, hàm lượng trong sợi nấm C militaris lên men là 1,592±0,03 mg/g gần tương tự C sinensis trong tự nhiên (Lo et al., 2013) Adenosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch(Shashidhara et al., 2013)

1.2.3 Polysaccharide

Trong nấm Cordyceps chứa một lượng lớn polysaccharid, khoảng 3-8%

khối lượng, đây là một trong những hợp chất sinh học chínhvà được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản xuất thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc phòng, chữa bệnh cho người và với cấu trúc phức tạp gồm cyclofuran (đường 5C, mạch vòng), beta-glucan; beta-mannan; và phức hợp polysaccharide có cả đường 5C và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh, dùng cả cầu nối alpha- và beta-)

Các Polysaccharide chính trong nấm Cordyceps là một dạng glucans

với các mối liên kết glycosidic chứa các liên kết: (1/3) – (1/6) – β glucan và (1/3) -1 – glucan Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharide đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích được thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các

polysaccharide(Hui et al., 2011) Các polysaccharide có khả năng chống lại

hoạt động của các tế bào ung thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo từ đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid glucuronic

Trong một số loài nấm, polysaccharide liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide- protein hoặc polysaccharide- peptide

cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn (Hardeep et al., 2014; John và Matt, 2008; Lu et al., 2012) Cấu trúc 1/3- β- glucans có khả năng kháng khối u

được biết nhiều nhất, theo các nhà nghiên cứu cho biết những glucan có được hoạt tính sinh học này là do trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm các đơn

vị như acid glucuronic, xylose, arabinose, fucose hoặc ribose Heteroglycan là một nhóm lớn polysaccharide lớn hoạt tính sinh học đa dạng được phân loại

là galactan, fucan, xylan, mannan (John et al., 2008; Hardeep et al., 2014; Lu

et al., 2012)

1.2.4 Các hợp chất khác

Acid Cordycepic

Acid Cordycepic, một isomer của acid quinic, được nghiên cứu đầu tiên

ở Cordyceps sinensis năm 1957 Cấu trúc tinh thể của acid cordyceptic được

xác định là D-mannitol Mannitol là hợp chất sinh học chính có nhiều hoạt tính quan trọng như kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho Chất này tồn tại trong tự nhiên chủ yếu ở rễ, thân và lá cây; được tìm thấy nhiều trong nấm ăn, cà rốt

và rêu Hàm lượng acid cordyceptic trong Cordyceps khoảng 7-29%

Mannitol có cấu tạo gồm một alcohol và một đường, hoặc một polyol; tương

tự như xylitol hay sorbitol Tuy nhiên, mannitol có xu hướng loại bỏ ion hydrogen trong nước làm dung dịch trở nên acid Công thức hóa học của mannitol là C6H14O6, trọng lượng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 166oC, tỷ trọng 1,489 (20oC) và nhiệt độ sôi 290-295oC (467 kPa) Mannitol có nhiều đặc tính quan trọng đã được sử dụng trong y học và thực phẩm, hàm lượng

mannitol có trong quả thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm

có hàm lƣợng acid cordyceptic cao hơn so với trong quả thể (Zhoua et al.,

2009)

Protein và acid amin

Hàm lƣợng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm

18 acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin, cystein và tryptophan Các acid amin có hàm lƣợng cao nhất là glutamat, arginin và acid aspartic và có dƣợc tính cao nhất là arginin, glutamat,

tryptophan và tyrosin (Xuanwei Zhoua et al., 2009) Khi nghiên cứu họ protein trong C militaris cho thấy bộ gen C militaris chứa 61 họ protease

nhƣng hầu hết là serin protease và metallopeptidase, 12 gen mã hóa trypsin,

167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid hydrolase Hơn

nữa, C militaris sở hữu hầu hết các gen cần thiết cho hoạt động biến dƣỡng

adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu ribonucleotid triphosphat reductase

và deoxyadenosin kinase (Zheng et al.,2011)

Ergosterol

Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu của vitamin D2 Hàm lƣợng ergosterol ở C militaris nuôi cấy rất cao (10,68mg/g),

cao hơn nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có 1,44 mg/g và chỉ đứng

sau C.sinensis tự nhiên phân lập ở Tây Tạng (Xuanwei Zhoua et al., 2009)

Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm immunoglobin A

Acid béo và nguyên tố kim loại

Acid béo bao gồm carbon, hydro, và oxy và là thành phần chính của lipid, phospholipid và glycolipid, chúng đƣợc phân loại thành acid béo no và

không no Ở Cordyceps, lƣợng acid béo no đƣợc tìm thấy là 57,84% Acid

linoleic chiếm hàm lƣợng cao nhất 38,44%, tiếp đó là acid oleic 17,94%.Các

acid béo nó chiếm 42,16% bao gồm C14, C15, C16, C17, C18, C20 và C22 Acid palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86%

và 15,78% Các acid béo không no có chức năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch, chứa một loạt các hợp chất dinh dưỡng như các acid amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin tan trong nước như 1, B2 và B12

và các nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi,

Se, Al, Si,Ti, Cr, Ga) (John et al., 2005)

Nucleotid

Nucleotid (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là chất có nhiều

trong Cordyceps, có tác dụng kháng khối u, phóng thích các tín hiệu dẫn

truyền thần kinh, chống co giật… Trong đó, hàm lượng guanosin thường cao nhất Hàm lượng nucleotid trong Cordyceps nuôi cấy cao hơn hẳn Cordyceps tự nhiên Hàm lượng các nucleotid trong tự nhiên thấp có thể

do sự thoái biến các nucleotid trong quá trình ủ đông Khí hậu ấm và ẩm ướt

là điều kiện làm tăng nucleotid trong Cordyceps khi nuôi trên môi trường rắn (Xuanwei Zhoua et al., 2009)

1.3 Giá trị dược liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con người

Nấm Cordyceps có rất nhiều công dụng như là chống ung thư, chống di

căn, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ thận Cụ thể, polysaccharide đảm nhiệm chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, chống di căn khối u, điều hòa miễn dịch, hypoglycaemic, steroidogenic và hypolipidaemic Cordycepin đảm nhiệm chống ung thư, trừ sâu, chống nhiễm khuẩn

Ergosterol ức chế ung thư, điều hòa miễn dịch (Shrestha et al., 2010; Zhoua et al., 2009)

Hiệu quả chống ung thư

Khả năng ức chế sự phát triển của các khối u được phát hiện ở nhiều

chi của loài Cordyceps Các thành phần hoạt tính sinh học có tác động chống

ung thư chủ yếu là polysaccharide, sterol và adenosine Trong đó, sterol và

adenosine là các chủ đề nghiên cứu nóng nhất về khả năng chống ung thư Cho tới nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể biết chính xác cơ chế ức chế sự

phát triển của tế bào ung thư của Cordyceps, cơ chế này có thể là tăng cường

chức năng của hệ thống miễn dịch và miễn dịch tự nhiên; ức chế có sự chọn lọc tổng hợp RNA, từ đó ảnh hưởng tới tổng hợp protein; hoạt động chống oxy hóa và chống các gốc tự do; chống đột biến; làm nhiễu quá trình sao chép

của virus cảm ứng khối u; cảm ứng methyl hóa acid nucleic (Shashidhara et

al., 2013)

Tác động điều hòa miễn dịch

Các tác động chính của Cordyceps lên hệ thống miễn dịch vào các tế

bào như đáp ứng tăng sinh lymph, tế bào giết tự nhiên (NK), và kích thích tạo thành: ngưng kết tố thực vật (PHA) interleukin-2 (IL-2) và tác nhân hoại tử tế bào ung thư (TNF-α) trên các tế bào đơn nhân ở người, đây là kết quả sự sản xuất của cytokine Các tác động trị liệu của nấm, như ngăn chặn bệnh tự miễn, dị ứng cũng có liên quan đến tác động điều hòa miễn dịch (Xuanwei

Zhoua et al., 2009)

Khả năng điều hòa cơ thể, chống lão hóa, oxy hóa

Các thử nghiệm trên động vật cho thấy, Cordyceps có tác dụng bảo vệ

gan của bệnh nhân, chống nhiễm virus A, viêm gan B mãn tính, viêm gan C,

xơ gan Các hoạt chất của nấm hỗ trợ tăng các tế bào có chức năng điều hòa, đưa trạng thái HBeAg-dương tính về HBeAg-âm tính, tăng cường chức năng

gan và ức chế xơ gan (Zhou et al., 2009) Ngoài ra, C sinensis có nhiều ảnh

hưởng đến hệ thống tim mạch, chẳng hạn như tần số âm tính, cơ tim giảm tiêu thụ ôxy, cải thiện cơ tim thiếu máu cục bộ, chống đông tụ tiểu cầu, loạn nhịp

Dịch chiết và tế bào nấm C sinensis cũng cho thấy tác động lên hệ thần kinh

như giảm đau, chống co giật và thanh nhiệt Trên hệ thống hô hấp, dịch chiết

từ C sinensis có tác dụng làm giãn cuống phổi nhờ quá trình tăng cường tiết

adrenaline từ tuyến thượng thận và co khí quản nhờ histamine Đồng thời, tác dụng tới hormone, corticosterone trong hệ nội tiết của người (Klaunig, 2004)

Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong công trình nghiên cứu của Won và Park (2005) Ahn và cộng sự (2000) nhận định nấm ĐTHT có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số

virus, vi khuẩn và nấm Ngoài ra, nấm ĐTHT C militaris còn có tác dụng

kìm hãm sự oxy hoá lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig, 2004)

Trong những năm gần đây, Cordyceps trở thành nguồn nguyên liệu rất

quan trọng cho làm thuốc và thực phẩm chức năng Giá cả của chúng tăng lên rất nhanh, có rất nhiều người đã canh tác chúng Hiện tại, sự phát triển của

Cordyceps và các chế phẩm của chúng chủ yếu tập trung vào ba hướng: thực

phẩm ăn kiêng, thực phẩm chức năng và phát triển tính thuốc Hầu hết các

hoạt chất sinh học chiết xuất từ Cordyceps như cordycepin, cordycepic acid,

và polysaccharide đều là các chất chống lão hóa và tác động tới điều hòa giấc ngủ cũng đã được cấp phép như một nguồn thuốc mới bởi SFDA của Trung

Quốc Vì vậy, sử dụng Cordyceps và cả dịch chiết, chúng ta có thể phát triển

rất nhiều sản phẩm nhờ công nghệ hiện đại, các sản phẩm này có rất nhiều chức năng chủ yếu tập trung vào các phương diện: tăng cường thể chất, chống lão hóa, bảo vệ tim mạch, cải thiện giấc ngủ, tăng ngon miện, tăng cường

miễn dịch (Shashihara et al., 2013)

1.4 Ứng dụng công nghệ lên men chìm nấm Cordyceps spp để sản xuất

sinh khối và exopolysaccharide (EPS)

Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định sinh khối nấm Cordyceps

spp có chứa nhiều hợp chất có giá trị như: 14-19 acid amin khác nhau, 11 loại bioxanthracen, beauvericin, chất béo, cordycedipeptide, cordyceamide, adenosine, cordycepin, exopolysaccharide… Một trong những chất có hoạt tính sinh học cao đang được quan tâm là expolysaccharide, được chứng minh

có khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chống hạ

đường huyết, chống ôxi hóa và kháng tế bào ung thư (Xiao et al., 2004; Yang

et al., 2013)

EPS là thành phần chính trong quá trình tạo thành tế bào nấm

Cordyceps spp nên sự tích lũy EPS trong môi trường lên men có mối tương

quan chặt ch với sinh khối nấm tạo ra (Cui, Zhang, 2010) Phương pháp lên men tạo quả thể trên giá thể nhân tạo đòi hỏi thời gian nuôi cấy dài ngày, tốn diện tích, dễ bị nhiễm tạp Ngược lại, phương pháp lên men chìm có ưu điểm thu nhận sinh khối trong thời gian ngắn trong không gian nhỏ, tránh nhiễm

tạp (Kim et al., 2002; Cha et al., 2007) Tuy nhiên, do sản lượng sinh khối

thấp nên các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men nhằm nâng cao hàm lượng sinh khối và tổng hợp

expolysaccharide của các chủng Cordyceps spp

Năm 2002, Kim et al công bố chủng nấm C militaris trong nghiên cứu

có hàm lượng sinh khối và EPS cao nhất, đạt lần 12,73 g/L và 7,3 g/L trên thiết bị lên men KF-250 quy mô 5 Lít có thành phần môi trường gồm 60 g/L sucrose; 10 g/L polypeptone; 0,5 g/L KH2PO4 Kết quả ghi nhận ở pH 6,0; nhiệt độ 25oC; lưu lượng khí 2 vvm; tốc độ khuấy 150 vòng/phút; 10 ngày lên men Hình thái hệ sợi có sự biến đổi mạnh khi tại hai điều kiện chỉnh pH và

không chỉnh pH trong quá trình lên men (Kim et al., 2002)

Các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố kết quả tối ưu khả năng sinh

trưởng của chủng C jiangxiensis JXPJ 0109 và tổng hợp EPS trong lên men

chìm Các kết quả công bố cho thấy, hàm lượng sinh khối khô đạt cực đại (14,5 g L) trên môi trường lên men gồm 15 g/L maltose; 10 g/L glycerol; 10 g/L tryptone; 10 g/L cao nấm men; 1 g/L KH2PO4; 0,2 g/L MgSO4; 0,5 g/L CaCl2, pH 5,0 ở nhiệt độ 26°C sau 8 ngày Khi sử dụng môi trường tối ưu có thành phần 20 g/L maltose; 8 g/L glycerol; 5 g/L tryptone; 10 g/L cao nấm men; 1 g/L KH2PO4; 0,5 g/L CaCl2; pH 7,0 ở 28°C thì hàm lượng EPS đạt 3,5

g L sau 10 ngày lên men Đây là báo cáo đầu tiên trên thế giới đánh giá chi

tiết về ảnh hưởng của từng yếu tố tới khả năng tạo sinh khối và EPS của loài

C jiangxiensis (Xiao et al., 2004)

Do các sản phẩm trao đổi chất trong quá trình lên men nấm Cordyceps

spp rất phong phú nên chủng giống có vai trò quyết định đến chất lượng và hàm lượng sản phẩm tạo thành Kim & Yun (2005) đã khẳng định lập luận

trên khi so sánh quá trình tối ưu thu nhận EPS từ chủng C militaris và C sinensis trên quy mô bình tam giác và thiết bị lên men 5 lít Với môi trường

tối ưu gồm 40 g/L sucrose; 5 g/L cao ngô; pH 8,0; nhiệt độ 30°C, sinh khối

khô, EPS, cordycepin từ chủng C militaris đạt cực đại (22,9 g/L và 5 g/L) sau 16 ngày nuôi cấy Trái lại, chủng C sinensis có khả năng sinh trưởng và

tổng hợp EPS thấp hơn (20,9 g L và 4,9 g L) trên môi trường tối ưu gồm 20 g/L sucrose; 25 g/L cao ngô; 0,78 g/L CaCl2; 1,73 MgSO4.7H2O; pH 4,0; nhiệt độ 20°C Hàm lượng cordycepin thu nhận cùng điều kiện trong nghiên

cứu của chủng Cordyceps sp.gấp 2,1 lần so với chủng C sinensis (Kim và

Yun, 2005) Nhóm nghiên cứu của Cui và Zhang (2010) đã nâng cao khả năng sinh EPS ở 3 điều kiện lên men: lắc, tĩnh và hai giai đoạn (140 giờ lắc,

130 giờ tĩnh), hàm lượng EPS đạt 3,2 g/L sau khi tối ưu quá trình lên men hai giai đoạn Đồng thời gấp 2,3 lần so với điều kiện tĩnh và 1,6 lần so với lên men trong điều kiện lắc

Nhằm tăng khả năng sinh trưởng và tổng hợp EPS, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng một số chất kích thích quá trình sinh trưởng của các chủng

Cordyceps spp Tác giả Yang et al (2000) cho rằng acid có tác động mạnh đến tốc độ sinh trưởng của chủng C militaris Báo cáo của Park et al (2002)

đã chứng minh hiệu quả tổng hợp EPS được nâng cao khi bổ sung dầu thực vật trong lên men chìm Ngoài ra, một số chất hoạt hóa bề mặt như Tween 80 hay glycerol cũng được chứng minh làm tăng hiệu quả dẫn truyền chất dinh dưỡng từ môi trường lên men lên thành tế bào nấm (Liu và Wu, 2012)

1.5 Thu hồi sinh khối và hoạt chất từ Cordyceps spp

Một yếu tố đóng vai trò quan trọng mang ý nghĩa quyết định trong quá trình lên men chính là thu hồi, tách chiết sản phẩm tạo thành Hiện nay có rất nhiều phương pháp để tách chiết các chất có hoạt tính sinh học cao từ

Cordyceps spp như sử dụng nước, dung môi Nước được sử dụng để tách chiết polysaccharide từ nấm C sinensis với tỷ lệ nước: sinh khối = 2,5:1, pH

7,5-8,0 trong 24 giờ (Sun, Zhang, 2003) Wang và cộng sự (2005) cho rằng

khi sử dụng sóng siêu âm kết hợp với nước với tỷ lệ quả thể nấm C militaris:

nước = 1:10, lặp lại 3 lần quá trình tách chiết trong 90 phút cho hiệu quả tách chiết cordycepin và polysaccharide cao Phương pháp trên khá hiệu quả khi thay đổi tỷ lệ nước nóng lên 25-30% khi tách chiết chất chống oxy hóa Ngoài

ra, methanol và ethanol cũng được chứng minh có tác dụng hiệu quả trong tách chiết nucleoside, polysaccharide, protein Trong đó, yếu tố ảnh hưởng mạnh đền hiệu suất tách chiết cordycepin là tỷ lệ cồn và thời gian Khi tối ưu

tỷ lệ mẫu: ethanol 20% = 1:33 kết hợp sóng siêu âm thu nồng độ cordycepin

đạt cực đại (Song et al., 2007) Chiết xuất bằng ethanol có hiệu quả chống oxy hóa mạnh, tăng cường miễn dịch Tuy nhiên, dịch chiết xuất sinh khối C sinensis với methanol lại thể hiện độc tính ức chế tế bào ung thư mạnh

Hàm lượng các chất như carbohydrates, adenosine, ergosterol,

cordycepin được chiết xuất từ Cordyceps spp với dung môi ethyl acetate có

hàm lượng khác biệt so với khi tách chiết bằng nước và cồn Những nhóm hợp chất này thể hiện tác động mạnh trong chống ôxy hóa, đáp ứng miễn dịch

tế bào, ức chế tế bào ung thư Hiệu suất thu hồi khi sử dụng ethyl acetate trong tách chiết các chất thấp hơn nhiều so với nước và cồn Tuy nhiên, hàm lượng chất ergosterol thu được lại cao hơn khi chiết bằng dung môi ethyl acetate, đây là nhân tố chính trong tác động gây độc thế bào bạch cầu tủy

HL60 với hàm lượng ED đạt 50 ± 25 µg/mL sau 2 ngày điều trị (Zhang et al.,

2005) Nhìn chung, quá trình tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ

Cordyceps spp kết hợp sử dụng sóng siêu âm cho kết quả thu hồi sản phẩm

cao và đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới

Hiện nay, tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng CO2 siêu tới hạn đang là một công nghệ mới được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ hóa chất và thực phẩm Các chất thu được trong công nghệ này có độ tinh sạch cao, ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư trực tràng, gan và đặc biệt không cần phải sử dụng các loại dung môi- nguyên nhân gây ô nhiễm môi

trường (Shin et al., 2003)

1.6 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong và ngoài

nước

1.6.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới

Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thảo đã được các nhà khoa học nghiên cứu và thu được rất nhiều thành tựu có giá trị cao Từ năm 1998, ở Trung Quốc đã có những nghiên cứu đi sâu vào các hoạt chất sinh học có

trong Cordyceps trong đó chủ yếu tập trung vào các hợp chất polysaccharide,

adenosine, cordycepin, cordycepic acid Các nước khác như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan… cũng nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các sản phẩm từ

các chủng nấm thuộc chi Cordyceps và thu lại hiệu quả kinh tế cao Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định sinh khối nấm Cordyceps spp có chứa

nhiều hợp chất có giá trị như: 14-19 acid amin khác nhau, 11 loại bioxanthracen, beauvericin, chất béo, cordycedipeptide, cordyceamide, adenosine, cordycepin, exopolysaccharide… Một trong những chất có hoạt tính sinh học cao đang được quan tâm là expolysaccharide, được chứng minh

có khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chống hạ

đường huyết, chống ôxi hóa và kháng tế bào ung thư (Xiao et al., 2004; Yang

et al., 2013)

Với công nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong việc

nuôi cấy Cordyceps trong phòng thí nghiệm và phát triển nền công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ nấm Cordyceps Ví dụ, Công ty Biofact life (Malaysia)

đã kết hợp công nghệ tiên tiến của Nhật và các nước khác nuôi cấy thành

công nấm Cordyceps trên môi trường nhân tạo để tạo ra hai hoạt chất chính là

cordycepin và adenosine được tạo ra từ hệ sợi nấm với giá trị cao Các nước như Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản, Malaysia đã sản xuất được nấm Đông trùng hạ thảo trên quy mô công nghiệp từ những năm 1995, thế kỷXX

và bán trên thị trường với giá khá cao, ước tính lợi nhuận lên tới hàng tỷ đô

la

1.6.2 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam

So với thế giới, các nghiên cứu về tác dụng của của nấm đông trùng hạ

thảo Cordyceps ở Việt Nam chưa được công bố nhiều Phần lớn những gì mà

các nhà nghiên cứu Việt Nam có được về nguồn dược liệu quý hiếm này đều chỉ dừng lại ở việc phát hiện các chủng của đông trùng hạ thảo sẵn có trong tự nhiên Một trong số ít các nghiên cứu về tác dụng của nấm đông trùng hạ

thảo Cordyceps ở Việt Nam là nghiên cứu của Đái Duy an và cs Theo

nghiên cứu của tác giả Đái Duy an và cs thì đông trùng hạ thảo là một loại dược liệu quý hiếm, có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh virus, ung thư, HIV AIDS, đái tháo đường và suy giảm tình dục Trần Minh Trang và cs đã

tiến hành nghiên cứu tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy nấm C sinensis, kết quả nhóm tác giả đã chỉ ra exopolysaccharide có tiềm năng kích

thích sự tăng sinh P MC (tế bào máu ngoại vi) Nghiên cứu này tạo cơ sở và

tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng miễn dịch ở mức in vitro

Đoàn Minh Quân và cs đã tiến hành nghiên cứu tách chiết ergosterol và thử nghiệm hoạt tính kháng phân bào của cao ether dầu hỏa từ sinh khối

nấm Cordyceps spp tại Việt Nam, kết quả cho thấy ergosterol dạng tinh thể

và dạng cao PE có khả năng ức chế sự phân bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng giống

Chủng nấm C militaris FNA5 thuộc chi Cordyceps nhận được từ bộ

sưu tập chủng giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật như các nguồn đường (glucose, saccharose ), các loại acid amin, nguồn nitơ, các hóa chất, dung môi,… là hóa chất tiêu chuẩn của các hãng Merck (Đức), Sigma (Mỹ) cung cấp Hóa chất dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Fermentas (Đức), Qiagen (Mỹ), BioRad (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Fluca (Nhật),

Chameleon (Nhật) cung cấp

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

Các loại dụng cụ cơ bản như: que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, giấy đo pH, thước đo, pipet… Và các loại máy móc thiết bị như: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh, cân phân tích, tủ sấy, tủ lạnh âm, máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ), máy ổn nhiệt (Labnet, Mỹ), máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy đo OD, máy đo pH, và các loại thiết

bị khác dùng trong nghiên cứu do Nhật Bản, Thụy Sĩ, Anh, Đức và Việt Nam sản xuất

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu: