Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Khảo sát các bệnh hại chính do nấm gây ra trên chi lan Dendrobium tại khu vực thành phố Hồ Chí Minh

Định danh cấp độ loài bằng phương pháp sinh học phân tử dựa vào vùng trình tự ITS cho 3 mẫu nam từ 3 chi nam đã xác định được tên khoa học của 3 mẫu nam này là loài nấm Colletotrichum gl

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

w*wx«%«%%%

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHAO SAT CÁC BỆNH HAI CHÍNH DO NAM GAY RA TREN

CHI LAN Dendrobium TAIKHU VỰC THÀNH PHO HO CHÍ MINH

SINH VIÊN THUC HIỆN : LE VĨNH KHAI

NGÀNH : BẢO VE THỰC VATKHÓA : 2019 — 2023

Thành phố Hồ Chi Minh, tháng 4/2023

KHẢO SÁT CÁC BỆNH HẠI CHÍNH DO NÁM GÂY RA TRÊN

CHI LAN HOÀNG THẢO (Dendrobium) TẠI

LOI CAM ON

Trong thời gian thực hiện dé tài, ngoài sự nổ lực và cố gang của ban thân, tôicòn nhận được nhiều sự giúp đỡ của mọi người Nay tôi xin bày tỏ lời cám ơn chânthành đến:

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu nhà Trường Đại học Nông Lâm

Tp.HCM, Ban Chủ nhiệm khoa Nông học, cùng toan thể giảng viên đã giảng dạy, tạomôi trường học tập tốt nhất đề tôi tiếp thu kiến thức trong suốt những năm qua và đủ

điều kiện dé làm đề tài tốt nghiệp

Tôi gửi lời cám ơn đến thầy PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc (Bộ môn Công nghệsinh học) đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi cảm ơn các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Bệnh học va chân đoán

phân tử, Viện CNSH và Môi Trường đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu.

Tôi xin cám ơn anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Bệnh cây, Bộ môn Bao

vệ Thực vật, Khoa Nông học đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu này.

Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ và những người thân trong gia đình đã tạođiều kiện vật chất lẫn tinh than dé con có được thành quả như ngày hôm nay

Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 02 năm 2024

Sinh viên

=

Lé Vinh Khai

1

TÓM TAT

Đề tài “Khảo sát các bệnh hại chính do nam gây ra trên chi lan Hoàng Thảo(Dendrobium) tại khu vực Thành Phố Hồ Chi Minh” được tiến hành tại Viện nghiên

cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, trong

khoảng thời gian từ tháng 5/2023 đến tháng 2/2024 Mục tiêu của đề tài là mô tả cáctriệu chứng gây bệnh, định danh các nam gay bénh, tinh tần suất xuất hiện các chinam, xác định tính chính xác của chi thị phân tử

Kết quả thu được: trong quá trình thu thập mẫu bệnh phát hiện 3 triệu chứngbệnh gây hại trên lan Dendrobium sp bao gồm cháy đầu lá, đốm lá, đen thân Thuđược thập được 120 mẫu bệnh từ các địa điểm khác nhau thuộc khu vực thành phố Hồ

Chí Minh.

Phân lập và định danh bằng đặc điểm hình thái cho thấy có tất cả 80 mẫu namthuộc 3 chi khác nhau bao gồm Colletotrichum spp., Pestalotiopsis spp., Fusariumspp., tuy nhiên tần suất xuất hiện các chi nam là khác nhau với tỉ lệ tương ứng là

38,75%, 33,75%, 27,50%.

Định danh cấp độ loài bằng phương pháp sinh học phân tử dựa vào vùng trình

tự ITS cho 3 mẫu nam từ 3 chi nam đã xác định được tên khoa học của 3 mẫu nam này

là loài nấm Colletotrichum gloeosporioides, Pestalotiopsis vismiae, Fusarium

oxysporum.

Kết qua khảo sát chỉ thi phan tử bằng các môi B-tubulin và ApMat cho namColletotrichum gloeosporioides cho kết quả lần lượt vào band 545bp và 910bp chothay không có sự khác biệt về mặt chỉ thị so với các nghiên cứu trước

1H

MỤC LỤC

Trang

Lộ: XI NI Se ii

ee | iii

MUG TG sosseetiesodkisooisbstiniosltögsssasfE3og4otgtdtsitrzsdobkitoieslinbot2lSekst2sEtxsH384008633000632 x4tlidueastoreai iv

DANH SÁCH CHỮ VIET TẮTT -222-++2222+e+rttrErkkrrrrrrrrkrrrrrrrrrrrrrrrrreee viiTRATES BˆCH ING so sang ng nHữnghg nh ghHhhhugh.GingiGi.3ã-G0L8:4G016:30-G0000501408i00g048 viiiDANH SÁCH CÁC HÌNH -222222222222222112272 2 e ixGIÚP THÍ Grraueensebanuodbeererrointretrrtoittteptid9f 6906000000000 0070550020000nb0SSEgI 1

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 2-22 S+S2£££E+£E2EE+EEtzEzzExerxezrrrree 3

1.1 Tổng quan về hoa lan endrobiuim -2-75257255s+cccscscscssscseecce-ce- 31.1.1 Giới thiệu về lan 2endrobiuim -52©525c+ccscssessesseeseeeesseeeee 31.1.2 Đặc điểm thực vật học - +2 5s 2212 12212121121121211 21121111121 xe 31.1.3 Yêu cầu sinh thái đối với lan endrobiurn 2-©225555+cs+csc5z2 5

114 Ky thuất cảnh tae lat! LDEHiNHDGDIHIHH canssnaansidibniiiiriidioiiigdgtESdiSuisSitEAnESSeiittssE 7

1.2 Sơ lược về tình hình hoa lan Dendrobium trên dia bàn Tp.HCM 81.3 Triệu chứng, tác nhân và biện pháp phòng trừ một số bệnh do nam trên lan và

biện phap phone TƯÙ sscsssnsnsssssssesee G02 D0 11611003161333160514385401355.L415568533338331330/85354U53138E8/G8188 9 123.1 Bệnh đen that Gây GŨÏLissesesssesdddoidiressedrdtidreostoipissavEiiriitogwoeoroosvissgee 10

IV) Ti en 10

1.3.4 Bệnh thối bach eo ceccceeccceccececcsesececesececsecsesecsecseseesesevseceesseeecseeseeeesesseeeees Te1.3.5 Bệnh đốm vòng cánh hoa 2-22 52222222E22E22EE22E222122E22222212222zxe2 13L6 Bệuhđmgieánhhdqm, SseSSeseseiesenrseesee 141.3.7 Bệnh thối đen ngọn -©2¿222E22E22222121121121121121121121221 2 2e 14

IV

lá TTnggimTR ĐỮỚN «-.essseeisseeoesiesnesosisodiiostedfoAnsbstiraoednadgtrnurek 151.4.1 — Giới thiệu vé rDNA va ITS once ccccceececcccccccecsesecsesecsessessesesseseseteseeseeesseesees 15

1.4.2 So lược lịch sử nghiên cứu rDNA eee eeeecceeceeceeseeeceesceeseeseeeneeseeeeess 16

1.4.3 Ý nghĩa của ITS —rDNA trong phân loại nấm -2- 5255225522 161.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR - 2-2252 2E2SE22E22E22E2E2E2121 2122212 17

L9 RST Si ngueaediniidiiiRihRiiinoidtntoEDGHESHEGEENGDENQOIGSEEHRGBGISHNSGASERSAAGEEAEHEHHISMSRSRE 17

1.5.2 Nguyên tắc phản ứng PCR -2-©2222+222222E2212221 2212221 212Ercrvee i1.5.3 Cách tiễn hành một phan ứng PCR -2- 22 52222+22222++2zzzzzzsez 171.5.4 Ưu nhược điểm của phương pháp PCR -2-2-©5222+22z2zz+cse2 181.5.5 Giới thiệu về cây phát sinh loài -2- 2¿52222++222E++2E2E+zzxzxrerxee 19

Chương 2 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU - 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2-2 ©222+2++2E+£Ez2EzzEzxrzxrzxezsee 20

2.1.2 Dia điểm nghiên cứu 2-2: 222S22222E22E225212121211211212112121 2e 20

22 ‘Vathéu vadung eu nghiÊH/CỮU»xsssesssedesaosibosotoiossÐlsrltleiogssl3i2i-020058080nhassen 20

2.2.1 Vật liệu, dụng cụ dé chuẩn đoán, lay mau trên đồng ruộng 202.2.2 Vat liệu, dung cụ dé phân lập, định danh tại phòng thí nghiệm 20

PIN (oto ai in e 21 2A PHƯƠHØ8 phap HPEHIỂTHGlUasszusegttitiiiitiieilAEEEGIDRGSSEHEIGSEGHOGOOEGHESEOANSSOGGSMSESERR 21

A a a 21

242 Phương pháp phâhlẬP:::-:< Ÿ.anneeeeessdioeeesboaaiiinddisdddtoaoagdre 24

2.4.3 Kiểm chứng và phân lập lại tác nhân theo quy tắc Koch 25QAA Thương philip Ty trib DONA tông Si eoiiidiiieiiidiisoddedmeasagoai 262.4.5 Dinh danh các mau nam bang hình thái bào tử va vùng trình tự ITS 262.4.6 Khảo sát chỉ thị phân tử các loài nam gây bệnh trên lan Dendrobium 28

2.4.7 Xử lí số liệu 52s 2S 2E21221211211211211211112111211 211 e 29

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-©22222222222222222E222222EzExzzxee 30

3.2 _ Thu thập và phân lập tác nhân từ các mẫu bệnh trên cây hoa lan Dendrobium

tat TH seo Bko net n6 cm EE NH2 S1ESGI33N3GSu8594BBSESSXOYENSHINSESSESISISSESEEXEEEERE.EEESE 32

3.2.1 Kết quả phân lập mau bệnh 2 2+22+2E222EE+£2+2EE2ZE+222z2Ezzzzrxez 323.3 Định danh nam gây bệnh dựa vào hình thái bao tử và vùng trình tự ITS 353.3.1 Dinh danh nam gây bệnh dựa vào hình thái bao tử -+ 353.3.2 Tan suất xuất hiện của các chi nấm + 2 +Ss+E£E££E+E£EEzEeErxrreree 383.3.3 Định danh nắm gây bệnh dựa vào vùng trình tự ITS 5-52 393.4 Kết quả khảo sát chỉ thị phân tử các loài nam gây bệnh 2-2 44KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, 2- 22222221222 2212212221271211221 2112112212112 1c ve 46TÀI LIỆU THAM KHAO - 2-©22222222222E22E22E122E222122122222212712221221 22222 47

BI EITL] TU Ut Gee eee rece eee eee ee eee ee 51

vi

Nông Nghiệp & Phát Triển Nông ThônOatmeal Agar (Môi trường bột yến mạch)

Polymerase chain reaction Potato Dextrose Agar (Môi trường thạch đường khoai tây) Ribosome deoxyribonucleic acid

Thanh phó Hồ Chí MinhTrung Tâm Khuyến Nông

B-tubulin

Water Agar (Môi trường thạch nước cat)

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 2 1 Kí hiệu vườn, mau, vị trí thu mẫu 2252 522SS22E£E22EzEz2zzzzzzsxe2 23

Bang 3 2 Kết qua tra cứu độ tương đồng trên Genbank bằng trình tự Nucleotit của các

MAU ¡0⁄60 ằ +-n 42

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hinh 1 N:cš: 02 2/72/7777; NA An nmm 4

Hinh 1 AI ¡009 2//2/2777.Nnn 4

THỉnh: 1: 3 Hoadlan GHHODTHHÍI tan san ga nndtntlngS18S5x18118800104840353.0603401804800000138000163309:039833Suutlostses 5 Hình 1 4 Triệu chứng bệnh đốm lá 2: 2£ 2SE+SE+SE£EE£EE2EE£EEE2EE2E2E22522522322222Xe2 11 Hình 1 5 Triệu chứng bệnh than thư eecceccecceeeeseeseeesecseeeaeeacenseeneeeseeseesees 12 Hình 2 1 Các địa điểm thu mẫu tại Tp.HCM 2¿©2¿22+2E+2E22E2EZEzEzzzzze2 sỹ Hình 3 1 Triệu chứng của bệnh cháy đầu lá 2: 2¿©22+2++2E+2E++£E+22z+zxzzzzzzxez 30 Hinh 3 3 Triệu chứng cũa bệnh đồm 1 eceninniaeiaeoesaeirinasdisespsesssessogsoE l Hinh:3) 3 Tew Chie DEHH:0efitHHDceseeasevseanereoiedsroieoEtdtHHRSETRIESEERARUSERdsufgogoie&orepdsgr.cE) Hình 3 5 Lá lan 7 ngày sau chủng so với đối chứng và triệu chứng ban đầu 32

Hình 3 6 Thân lan 7 ngày sau chủng so với đối chứng và triệu chứng ban đầu 32

Hình 3 7 Hình thái tản nắm và bào tử của một mẫu phân lập thuộc chi Colletotrichum spp sau khi tái phân lập so với mẫu phân lập ban đầu - 2-2222: 33 Hình 3 8 Hình thái tản nam và bao tử của một mẫu phân lập thuộc chi Pestalotiopsis spp sau khi tái phân lập so với mẫu phân lập ban đầu - 2-2 2222222 34 Hình 3 9 Hình thái tản nam và bao tử của một mẫu phân lập thuộc chi Fusarium spp sau khi tái phân lập so với mẫu phân lập ban đầu ¿2222 22222+sz+zzzzzzz+s+2 34 Hình 3 10 Đặc điểm hình thai của mẫu Collectotrichum spp thuộc nhóm I 36

Hình 3 11 Đặc điểm hình thái của mẫu Collectotrichum spp thuộc nhóm II 37

Hình 3 12 Hình thái tản nấm và bao tử chi nam Pestalotiopsis Spp - 38

Hình 3 13 Hình thái tan nắm và bao tử của chi nam Fusarium Spp 38

Hình 3 14 Biểu đồ thé hiện tần suất xuất hiện của các chi nắm - 2-5 s54 39 Hình 3 15 Kết quả điện di DNA bang cặp môi ITS với nam Colletotrichum sp 39

Hình 3 16 Kết quả điện di DNA bang cặp môi ITS với mẫu nắm Pestalotiopsis sp 40

Hình 3 17 Kết quả điện di DNA bang cặp môi ITS với mẫu nam Fusarium sp 40

Hình 3 18 Cây phát sinh loài dựa trên mỗi ITS của mẫu nam LBC18 phân lập với một số mẫu trên ngân hàng Gen Các giá trị bootstrap sau 1000 lần lặp lại là thể hiện dưới dang phan c0 43

Hình 3 19 Cây phát sinh loài dựa trên môi ITS của mẫu nam LTD15 phân lập với một

số mẫu trên ngân hang Gen Các giá tri bootstrap sau 1000 lần lặp lai là thé hiện dướidang phat tram 08 0a 5 43Hình 3 20 Cây phát sinh loài dựa trên môi ITS các mẫu nắm THM24 phân lập với một

số mẫu trên ngân hang Gen Các giá tri bootstrap sau 1000 lần lặp lai là thé hiện dướiDIRE PVA HINH Land Ho họ gh SH 0070 Eg.021801204ck804.06n1150010200128001 1.00.461:82 u02 5010) 44Hình 3 21 Kết quả điện di DNA bang cặp mỗi Bt(2a/B12b -2-5525522522225e2 44Hình 3 22 Kết quả điện di DNA bang cặp mỗi AM-E/AM-R 2: 55222z2552 45

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Hoa và cây kiếng là nhóm cây trồng chủ lực của thành phố, mang lại giá trịkinh tế cao, có đóng góp không nhỏ vào giá trị sản xuất nông nghiệp của thànhphó Theo thống kê của Sở NN&PTTN Tp.HCM, tổng diện tích hoa, cây kiểng phục vụdịp Tết 2020 đạt 1.027,5 ha, giá trị sản lượng hoa cây kiểng Tết 2020 đạt 1.661 tỷđồng, trong đó giá trị sản lượng hoa lan đem lại đạt 215,4 tỷ đồng Đến năm 2022 diệntích sản xuất hoa và cây kiếng trên địa bàn Tp.HCM ước đạt 2.325 ha, trong đó diệntích hoa lan chiếm khoảng 370 ha Hoa lan là một trong những cây hoa kiểng quantrọng của thành phó, có diện tích lớn và giá trị sản lượng nông nghiệp cao

Năm 2022, thành phố đã xuất khâu được 200.000 cây kim ngân, lan mokara,dendrobium với kim ngạch xuất khâu 500.000 đô la Mỹ với thị trường xuất khẩu chủyếu Campuchia, Mỹ, Nhật Bản, Hà Lan, Canada Hiện hoa lan chiếm gần 16% diệntích hoa kiếng thành phố và mỗi héc ta mang về cho nông dân mỗi năm doanh thu từ

mà nó đem lại thì các loại sâu bệnh hại cũng gây ra những tác hại ảnh hưởng vẻ đẹp cũng như giá trị của cây đặc biệt là các loại bệnh do nâm gây ra.

Do đó, đề tài: “Khao sát các bệnh hại chính do nam gây ra trên chi lan HoangThảo (Dendrobium) tại khu vực Thành phố Hồ Chí Minh” đã được thực hiện Đề tài

được đặt ra nhằm xác định rõ thành phần và các bệnh hại phổ biến trên lan

Dendrobium từ đó góp phần vào công tác nghiên cứu các thành phần bệnh hại, các

biện pháp trừ bệnh hiệu quả.

Mục tiêu nghiên cứu

M6 tả các triệu chứng bệnh trên lan Dendrobium.

Xác định một số loại nam gây bệnh phổ biến trên lan Dendrobium dựa vào đặc

điểm hình thái học và sinh học phân tử

Tính tần suất xuất hiện của một số chi nam gây bệnh trên lan Dendrobium

Xác định tính chính xác của một số chỉ thị phân tử trên nắm gây bệnh

Yêu cầu

Quan sát, thu thập các mẫu bệnh

Phân lập, làm thuần các mẫu nắm

Định danh các loại nắm gây bệnh

Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2023 đến tháng 2/2024 trên đối tượng là chi

lan Dendrobium.

Mẫu bệnh được thu thập tại các quận, huyện tại Tp.HCM.

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm RIBE 302 — 304 Bệnh học

và Chân đoán phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường

Đại học Nông Lâm TP.HCM.

Chương | TONG QUAN TAI LIEU1.1 Tống quan về hoa lan Dendrobium

1.1.1 Giới thiệu về lan Dendrobium

Dendrobium thuộc lớp một lá mầm (Monocotyledones), bộ lan (Asparagales),

họ Phong lan (Orchidaceace) Theo dạng thân, người ta thường chia ra 2 nhóm: Dạng

thân đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở vùng nóng, chịu 4m và siênghoa; Dạng thân thong (Dendrobium nobile) chịu khí hậumát mẻ Ở Việt Nam,Dendrobium hay được gọi là lan Hoàng Thảo hay Đăng Lan có đến 100 loài

Các loài Dendrobium đều là thực vật phụ sinh, sống bám trên thân cây hoặc đá

Rễ lan là rễ khí sinh, có một lớp mô hút 4m day bao quanh gồm những lớp tế bào chết

chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xám bạc Dendrobium thuộc nhóm đa thân, có

hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thé hoặc nam sâu trong đất gọi là thân rễ(căn hành) Giả hành là những đoạn phình to, giúp dự trữ nước và chất dinh dưỡng Lá

có gân song song moc xen kẽ nhau và gắn vao giả hành nhờ cuốn và bao lấy thân (ĐàoThanh Vân và Đặng Thị Tế Nga, 2008)

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Rễ: thường được hình thành từ căn hành Cấu tạo của rễ chia làm 3 tầng: Tầngngoài, tầng giữa và tầng trong Tầng ngoài là lớp vỏ rễ, tác dụng chủ yếu là hút và giữnước; tầng giữa là thịt rễ, phần lớn là tổ chức tế bào sống, chứa rất nhiều nam rễ cộng

sinh; tang trong là gân rễ có sự liên kết tương đối dẻo dai Khi sống bám vào cànhhoặc thân cây, bề mặt của lớp rễ có phủ lớp mạc làm nhiệm vụ hút và giữ nước rất tốtcho nên cây chịu hạn tốt, ở đầu rễ luôn luôn có màu xanh của diép lục dùng dé quanghợp nên rễ lan thường chui ra khỏi chậu Hệ rễ khí sinh phát triển rất phong phú, mọcrất đài, to, khỏe và giữ cho cây khỏi bị gió lung lay, vừa làm cột chống đỡ cho thânvươn cao (Lê Đặng Trung Tuyến, 2007)

Hình 1 1 Rễ lan Dendrobium

Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân có hệ thống nhánh nằm ngang bò daitrên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ Giả hành là những đoạn phình to,bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mắt dự trữ chất dinh dưỡng để

nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra giả hành còn

chứa diệp lục tô nên có thể quang hợp được (Nguyễn Công Nghiệp, 2004) Hình dạng

và kích thước của giả hành rất đa dạng: Hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên

nhau tạo thành thân có lá mọc xen kẽ (Dương Công Kiên, 2002).

Lá: hình dạng của lá thường là hình đai hoặc hình mũi mác, lá có gân song

song, phién lá hẹp, thuôn dài, mau lá thường là mau xanh đậm hoặc xanh sang Day lá

to ra tạo thành bẹ bao quanh giả hành, giữa bẹ lá và phiến lá có một lằn ngang (cô lá)

là nơi phiến lá sẽ lia ra khỏi thân khi gia

Hoa: cau trúc của một đóa hoa lan là phía bên ngoài cùng là 3 cánh đài, thường

có màu sắc và kích thước giống nhau Một cánh đài nằm ở phía trên hay phía sau củahoa gọi là cánh đài lý, hai cánh đài nằm ở 2 bên gọi là cánh đài cạnh Nằm kề bêntrong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa, chúng giống nhau về hình dạng, kíchthước, màu sắc So với 2 cánh hoa hai bên sườn, cánh hoa nằm ở phía trên hay phíadưới có hình dạng và màu sắc khác han với các cánh còn lại gọi là cánh môi (Đào

Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Hình 1 3 Hoa lan Dendrobium

1.1.3 Yêu cầu sinh thái đối với lan Dendrobium

s* Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất nhiều đến sự tăng trưởng của lan Dendrobium Nhiệt độtác động lên cây lan thông qua con đường quang hợp Nhiệt độ quá cao cây sẽ mấtnước, quang hợp và hô hấp giảm Nhiệt độ quá thấp làm nước trong tế bào kết tinh vàphá vỡ cấu trúc tế bào Phần lớn các cây này thích hợp với nhiệt độ ban đêm vào

khoảng 10 — 16°C và ban ngày vào khoảng 21 — 32°C Dendrobium thích hợp với khí

hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Vì đa dạng về chủng loại nên mỗi loài Dendrobium cầnmột nhiệt độ nhất định khác nhau:

- Nhóm Dendrobium ưa lạnh: sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ lýtưởng là 15°C, những giống này được lấy từ các vùng cao nguyên của Việt

Nam và Myanmar trên độ cao 1000 m, các loài này khó ra hoa ở vùng nhiệt

độ cao.

- Nhóm Dendrobium ưa nóng: trồng tại Tp HCM và các tỉnh phía Nam, nhiệt

độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 25°C Tuy nhiên, các giống

Dendrobium lại có thé chịu được nhiệt độ cao hơn nhiều

- Nhóm Dendrobium trung gian: có thé sống được ở cả vùng lạnh và vùng

nóng, nhiệt độ thích hợp của loài này là 20°C (Đào Thanh Vân và Đặng Thị

s* Anh sáng

Dendrobium là giéng ưa sáng nên có thê trồng trong điều kiện ánh sáng trựctiếp hay khuếch tán Cường độ ánh sáng cho Dendrobium là 70%, cường độ ánh sángquá cao cây sẽ sinh trưởng yếu Tùy vào giống Dendrobium sẽ có thời gian chiếu sángdai hay ngắn khác nhau Nếu trồng các loài Dendrobium ra hoa quanh năm thì cần thờigian chiếu sáng từ sáng sớm đến chiều Nếu trồng các loài Dendrobium ra hoa theomùa thì chú ý ra hoa ngày ngắn hay ngày dai

Thiếu ánh sáng với các loài thuộc giống này sẽ gây ra sự thoái hóa rõ rệt, câychậm phát triển, số lượng hoa cũng rất ít Trái lại, thừa ánh sáng đối với các loài thuộcgiống Dendrobium, chỉ làm cho cây xấu đi vì lá quá vàng hoặc các giả hành tro trui,

nhưng cây sẽ thích nghi dan và đảm bao ra hoa nhiều và đẹp (Hồ Lâm Thanh, 2018)

s* Nhu cầu dinh dưỡng

Dinh dưỡng đóng vai trò rất quan trọng đối với lan Khi cây đầy đủ đinh dưỡngthì cây sẽ sinh trưởng và phát triển tốt, ra nhiều hoa, hoa to, bền đẹp Ngược lại, khithiếu dinh dưỡng cây sẽ còi cọc, kém phát triển, không có hoặc cho ít hoa

6

Cây lan cần 13 chất dinh đưỡng khoáng thuộc nhóm đa lượng (N, P, K), trunglượng (Ca, Mg, S), vi lượng (Fe, Cu, Zu, Mn, B, Mo, CI) Ngoài ra, dé lan sinh trưởngphát triển tốt cần bo sung các vitamin như vitamin BI, BS, B6, B12 trong việc tạo chồitạo rễ và các chất kích thích tố như AIA, NAA, IBA kích thích nảy mam, chồi, ra hoa

(Phạm Công Bình, 2005).

1.1.4 Kỹ thuật canh tác lan Dendrobium

s% Giống

Chọn cây có thân lá cứng cáp, khoẻ mạnh, không có đốm, dấu hiệu bệnh, càng

đủ lá ở thân tơ càng tốt Chậu cây cần khô không đọng nước Nguồn gốc giống rõ

rang Sau khi mua về, cây được đặt ở vi trí thoáng mát, phun thuốc phòng trừ nam

bệnh cho cây con trước khi đem trồng (Pham Đình Tri, 2018)

s% Giá thé

Dendrobium trồng ở Việt Nam thích hợp chậu đất nung Giá thé rất phong phú,phổ biến là vỏ dừa, cũng có thé trồng bằng than với dén cong Thông thường vào mùanăng thích hợp trồng bằng giá thể vỏ dừa, nhưng mùa mưa hay bị dư nước làm hư rễ

va rụng lá, cần hạn chế tưới Nếu trồng bằng than với dớn cong phải tưới thật nhiều

nước và tưới nhiều lần (2 — 3 lần/ngày) trong mùa nắng mới đủ nhu cầu của cây (Phạm

Công Bình, 2005).

s* Cách trồng

Kỹ thuật trồng lan bằng chậu: Chuẩn bị chậu (chậu đất nung hoặc chậu nhựa),kích thước chậu cân đối với khả năng phát triển của cây, có nhiều lỗ thoáng Cho giáthé vào chậu Giá thé có kích thước lớn nên đặt dưới đáy chậu, chiếm khoảng 1/5 thétích chậu Giá thé có kích thước vừa và nhỏ nên đặt ở giữa và phía trên Giá thé được

bỏ vào thấp hon mặt chậu khoảng 1 - 2 cm (nếu trồng lan đa thân thì cắm cọc nhỏ vàomép chậu) Buộc có định cây lan vào cọc sao cho hướng phát triển của cây về sau quayvào giữa chậu (trồng lan đa thân) Khi trồng không chôn gốc cây sát đáy chậu mà délưng chừng giữa lớp chat trồng Có thé phủ lên mặt chậu 1 lớp xo đừa hay đớn dé tăng

âm độ cho cây.

Sau khi trồng xong cần mang chậu lan vào chỗ mát, nơi có độ 4m cao, tướinước, bón phân hoặc phun phân bón lá và chất kích thích ra rễ Khi thấy cây lan ra rễ

non, đưa dần chậu lan ra chỗ có ánh sáng và đưa lên giàn ((Phạm Đình Trí, 2018)

“+ Tuoi nước

Tuoi nước cho lan phải vô cùng thận trọng Yêu cầu người trồng phải thườngxuyên kiểm tra giá thé xem còn 4m hay đã khô dé có chế độ tưới nước thích hợp cholan Nước tưới cho lan có nồng độ pH từ 5,5 — 7 Nên tưới nước vào sáng sớm hoặcchiều mát Tưới nước vào buổi trưa sẽ làm cháy lá, hoa (Đào Thanh Vân và Đặng Thị

Tố Nga, 2008)

¢ Bon phân

Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng can rất nhiều phân bón

và có thé ding nhiều dạng phân bón khác nhau Riêng các loại Dendrobium thân thonghấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng

Nguyên tắc chung dé bón phân:

Thời kỳ sinh trưởng: thân lá phát triển mạnh cần phân bón có lượng đạm cao,lân và kali thấp

Trước khi ra hoa: cần phân bón có lượng lân và kali cao, đạm thấp Cụ thể:

Phân NPK với tỷ lệ 6 — 30 — 30, 10 - 55 — 10.

Trong quá trình hoa nở: cần phân bón có lượng kali cao, lân và đạm thấp

Bón phân cho lan bằng phương pháp bón phun qua lá

Sau một kỳ ra hoa, cây có một thời kỳ nghỉ, giai đoạn này hạn chế tưới nước vàbón phân cho đến khi bắt đầu ra chồi mới (Phạm Đình Trí, 2018)

1.2 Sơ lược về tình hình hoa lan Dendrobium trên địa bàn Tp.HCM

Thành phó Hồ Chi Minh (Tp.HCM) là đô thị lớn cả nước, là vùng kinh tế trongđiểm của phía Nam; với khí hậu nhiệt đới gió mùa (nhiệt độ bình quân 28°C, ẩm độ79%) và có nhiều tiềm lực về khoa học kỹ thuật, cùng đội ngũ nghệ nhân tay nghề cao

đã đưa Tp.HCM là đầu mối cung cấp hoa lan cho cả nước và xuất khâu, vừa là thị

trường tiêu thụ hoa lớn nhất nước

Hoa lan thuộc họ Orchidaceae, là loài hoa khá phong phú về chủng loại, mỗiloại có đặc điểm sinh trưởng và phát triển khác nhau, trong đó tại Tp.HCM tập trung

02 chủng loại hoa lan phát triển hàng hóa là Dendrobium và Mokara

Lan Dendrobium trên dia bàn Thành phố có 2 dạng chính: Dendrobium mau vàDendrobium nang

- Dendrobium mau: kích thước hoa lớn, cánh hoa tròn, cánh môi lớn Cánh

hoa kín hoặc hở, không có hương thơm Phát hoa ngắn, ít hoa (10 - 12

hoa/phát hoa).

- Dendrobium nắng: kích thước hoa nhỏ hơn dạng thường, cánh hoa có nhiềukiểu (thẳng, xoăn, cong ), cánh hoa nhỏ, và hầu hết đều có hương thơm.Phat hoa rất dai, nhiều hoa (20 - 30 hoa/phát hoa) Cây rất siêng ra hoa vahoa lâu tàn Cây chịu được ánh nắng trực tiếp (Câm nang kỹ thuật trồng lan

Dendrobium Mokara, TTKN Tp.HCM).

1.3 Triệu chứng, tác nhân và biện pháp phòng trừ một số bệnh do nam trên lan

và biện pháp phòng trừ

Nam là những loài thực vật bậc thấp gần giống tảo, nhưng không có diệp lục,

thường sinh san bằng bao tử, ding sợi nam làm phương thức dinh đưỡng và ký sinh

Nắm là nguyên nhân gây bệnh chủ yếu nhất trong bệnh xâm nhiễm đối với thựcvật và đối với cây lan Nam gây bệnh cho cây lan (cả phong lan, địa lan, thạch lan) ởhầu hết các giai đoạn phát triển và nhiều nhất là giai đoạn cây con Nắm phát triểnmạnh vào mùa mưa, 4m ướt và nhất là thời gian giữa mùa mưa và mùa nắng Bào tửnam có khả năng nay mam từ 1°C-2°C đến 30°C-36°C, sinh trưởng được trong khoảngnhiệt độ từ 4°C-36°C và thích hợp nhất là từ 20°C-25°C Nam thích hợp với ánh sángtán xạ Tùy theo từng loài nắm khác nhau có những yêu cầu về ánh sáng khác nhau

Phạm vi bào tử nây mam có pH: 3-8 và tốt nhất là pH 4,5-6,5 Nắm phát triểnmạnh trong điều kiện day du chat dinh dưỡng (Phan Thúc Huân, 2005)

1.3.1 Bệnh đen thân cây con

s* Triéu chứng

Vết bệnh xuất hiện ở gốc thân hoặc cổ rễ, màu nâu, sau đó lớn dan làm khô top

đoạn thân gần gốc và cô rễ, thân gốc có màu đen Các lá phía trên chuyển sang màuvàng, cong queo dị hình Cây con thường chết sau 2-3 tuần bị nhiễm bệnh Trong cănhành thường có một dai mau tím hoặc màu hồng nhạt Các giống lan đều bị bệnh, hạinặng ở giống Dendrobium (Đào Thanh Vân và Dang Thị Tố Nga, 2008)

“+ Nguyên nhân gây bệnh

Do nam Fusarium oxysporum gây ra (Đào Thanh Vân và Dang Thị Tố Nga,

2008).

«+ Biện pháp phòng trừ

Nên tách những cây bị bệnh riêng và phòng trừ cho những cây còn lại bằngcách phun hay nhúng cả cây vào thuốc trừ nam Nếu cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thốirồi phun thuốc điệt nắm Các loại thuốc điệt nam: Carboxin 1/2000 (1g thuốc hoàtrong 2 lít nước) Zineb: 3/2000; Benlat: 1/2000 (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga,

(Đào Thanh Vân va Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Trên những lá già (lá non ít bị bệnh hon) lúc dau thấy xuất hiện các cham màuvàng ở cả hai mặt lá Các chấm lan rộng dần sau chuyền thành màu đen (Phan Thúc

Huân, 2005).

10

Hình 1 4 Triệu chứng bệnh đốm lá

“+ Nguyên nhân gây bệnh

Do nam Cercospora sp gây ra (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008)

“+ Biện pháp phòng trừ

Bệnh thường phát sinh phát triển trong mùa mưa ở những vườn lan có độ âmcao và những vườn có hiện tượng thiếu lân, do đó có thể chăm sóc chu đáo kết hợp vớiphun thuốc trừ nam dé hạn chế bệnh này (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Phun các loại thuốc diệt nam vi dụ Zinneb 80 BHN nồng độ 1800 Điều chỉnh

độ pH của phân, 15-20 ngày tưới 1 lần với lượng nước nhiều để rửa acid Tăng cường

bón lân cho cây (Phan Thúc Huân, 2005).

1.3.3 Bệnh than thư

s* Đặc điểm triệu chứng

Vết bệnh thường hình tròn, nhỏ, màu nâu vàng, xuất hiện từ mép lá, chót láhoặc giữa phiến lá, kích thước trung bình từ 3-6 mm Giữa vết bệnh hơi lõm màu xámtrắng, xung quanh có gờ nhỏ, màu nâu đỏ, trên mô bệnh có nhiều cham nhỏ mau đen là

đĩa cành của nam gây bệnh Bệnh thường hai nặng trên giống Oncidium (Đào ThanhVân và Đặng Thị Tố Nga, 2008)

lãi

“+ Nguyên nhân gây bệnh

Do nam Colletotrichicm gloeosrioides gây ra (Đào Thanh Vân va Dang Thị Tố

Nga, 2008).

«+ Biện pháp phòng trừ

Bệnh phát triển mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước Thường cắt bỏ lávàng rồi phun thuốc diét nam 1 hoặc 2 tuần phun 1 lần Trong mùa mưa cần phun 5-7ngày/ lần (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008)

1.3.4 Bệnh thối hạch

s* Đặc điểm triệu chứng

Trên gốc thân vết bệnh màu vàng nhạt sau chuyên sang màu vàng nâu, thân câyteo top, lá vàng Do gốc rễ bị ton thương nên thân lá thường ran rim, cây lan sinh

trưởng kém, bệnh nặng làm cây chết Bệnh thối hạch hại nhiều giống lan, hại nặng

giống Oncidium và giống Cattleya (chú ý phân biệt với các bệnh nắm khác: Trên mô

bệnh thường có nhiều hạch nắm non màu trắng, hạch già màu nâu) (Đào Thanh Vân và

Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Đầu tiên thấy lá cây chuyển sang màu vàng Nhồ cây lên quan sát thấy rễ binhiễm bệnh trở nên xốp, mềm nhữn và có màu nâu, bệnh lan dần lên sốc và thân, khi

bị nặng cây sẽ chết (Phan Thúc Huân, 2005)

“+ Nguyên nhân gây bệnh

Do nam Sclerotium rolfsii gây ra (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tô Nga, 2008).Nguyên nhân gay hại chính do nấm Sclerotium Rolfsii, là một loại nắm kiểu kýsinh, không phát hiện được bào tử, chỉ thay dang kết cấu của sợi nam và hạch nam.Đây là một loại nắm da bào sợi nam phát triển, không màu, đường kính sợi nam từ2,5-10,54 Hạch nắm có dạng hình cầu, lúc đầu có màu trắng, sau chuyên thành màu

12

nâu nhạt, rồi màu nau sam Đường kính hạch nam từ 0,1- 0,2mm Hach nam nay mam

ở nhiệt độ 10-35°C thích hợp nhất là 25°C-30°C (Phan Thúc Huân, 2005)

“+ Biện pháp phòng trừ

Ở các vườn lan có độ 4m quá cao, hoặc các chậu treo sát nhau bệnh này phát

triển mạnh, lây lan nhanh Do đó phải hạn chế độ am kết hợp với phun thuốc trừ nam(Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Trước khi trồng phải xử lý khử trùng giá thé bằng cách: Fomalin 40% dùng0,05 lít pha loãng với 6 lít nước tưới lên 10 chậu có sẵn giá thê trong chậu (loại chậu

có đường kính 15-17cm) trước khi trồng 10 ngày phủ kín, trước khi trồng 3 ngày phải

bỏ lớp phủ ra để cho Fomalin bay hơi, hoặc dùng Captan 5g/m2, hoặc trong điều kiệnkhông có thuốc có thê xử lý bằng nước đun sôi 100°C, sau một ngày giá thể nguội cóthể đem trồng (Phan Thúc Huân, 2005)

Khi phát hiện vườn lan bị bệnh thối gốc và rễ: lấy tất cả những chậu, những cây

bị bệnh để riêng ra một nơi, những cây bị nặng thì tốt nhất là đem thiêu hủy, cònnhững cây bị bệnh nhẹ nên để cách ly riêng không để lây lan sang cây khác, dùngthuốc Fomalin 0,15% với liều lượng 0,005 lít tưới vào 10 chậu vòng quanh gốc câylan, hoặc dùng Zineb 80 BHN nồng độ 1/800 phun vào gốc, nếu bệnh nặng thì mộttuần phun 2-3 lần Nếu bệnh nhẹ một tuần phun một lần (Phan Thúc Huân, 2005).

1.3.5 Bệnh đốm vòng cánh hoa

s* Đặc điểm triệu chứng

Vết bệnh nhỏ màu đen hơi lõm, hình tròn có vân đồng tâm Bệnh hại nụ hoa,cuống hoa, đài hoa, cánh hoa làm mắt vẻ đẹp của hoa và hoa bị rụng sớm Trên môbệnh thường có lớp nắm mối màu den, trời mưa vết bệnh thường phát triển làm thối lá.Bệnh hại nặng trên giống Dendrobium (Đào Thanh Vân và Dang Thị Tố Nga, 2008)

“+ Nguyên nhân gây bệnh

Do nam Alternaria sp gây ra (Đào Thanh Vân va Đặng Thị Tố Nga, 2008)

s* Biện pháp phòng trừ

Dùng thuốc diệt nấm phun khi bệnh mới chớm xuất hiện, tránh tình trạng phòng

trừ muộn ảnh hưởng đến chất lượng của hoa (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga,

2008).

13

1.3.6 Bệnh đốm gi cánh hoa

s* Đặc điểm triệu chứng

Vết bệnh ban đầu là một cham nhỏ màu nâu hơi lôi lên, về sau lan rộng ra thànhmột đốm lớn màu nâu nhạt, có ranh giới rõ ràng giữa mô bệnh và mô khoẻ Bệnh làmhoa mat vẻ đẹp, mat giá trị thẩm mỹ hang hoá (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tổ Nga,

2008).

“+ Nguyên nhân gây bệnh

Do nam Curvularia eragostidis gây ra (Đào Thanh Vân và Dang Thị Tổ Nga,

Các lá non đang xanh tốt bị chuyền sang màu nâu vàng Khi bệnh nặng có thé

rút các lá non bị bệnh ra khỏi cây một cách đễ dàng Khi rút lá lên quan sát, ở gốc lá bịnhiễm bệnh có màu nâu tím đậm và thối Bệnh phát triển nặng sẽ lan xuống thân câylàm cho cây chết Cùng nguyên nhân gây bệnh trên còn có dạng bệnh bắt đầu pháttriển từ lá Trên sốc lá xuất hiện một vài đốm nâu, các vết bệnh lan nhanh, lá chuyểnsang màu đen, nhiễm sang các lá khác và rễ Có trường hợp có thé nhiễm từ rễ sang lá.Phan thân bị bệnh chuyên thành màu nâu tím Những cây bị bệnh tăng trưởng chậm và

có thể bị chết (Phan Thúc Huân, 2005)

“+ Nguyên nhân gây bệnh

14

Do nấm Phytophthora palmivora gây ra (Đào Thanh Vân và Dang Thị Tố Nga,

những chậu lan bị bệnh cách ly khỏi vườn lan (Phan Thúc Huân, 2005).

1.4 Tống quan về ITS -rDNA

1.4.1 Giới thiệu về rDNA va ITS

rDNA, viết tat của Ribosomal DNA, là một phan của DNA chứa các gene mãhóa ARN ribosomal (rRNA) ARN ribosomal là một thành phan quan trong cuaribosome, cơ cau tạo nên các tiêu phân tử protein trong tế bao rDNA chứa các gene

mã hóa ARN ribosomal cần thiết cho quá trình sản xuất các tiểu phân tử ARN

ribosomal.

rDNA thường được tô chức thành các nhóm lặp lại liên tục, gọi là "nhóm generDNA", tạo thành các cụm được gọi là "cụm gen rDNA" trên các nhiễm sắc thể Cáccụm gen rDNA có thé có từ một vài đến hàng trăm bản sao của gene ARN ribosomal,tùy thuộc vảo loài và loại nhiễm sắc thể (Szer và ctv, 2007)

Vùng trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) là một phan quan trong trong

DNA ribosomal (rDNA) được sử dung rộng rãi trong việc phan loại và xác định loài

trong sinh học phân tử Ving ITS nằm giữa các gene rRNA (ARN ribosomal), baogồm gene mã hóa ARNr 18S va 28S, và thường chứa các phần không mã hóa giữachúng Vùng này thường biến đổi nhanh giữa các loài khác nhau, cho phép nhà nghiêncứu phân biệt giữa chúng và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng

15

Sự đa dạng và biến đổi của vùng trình tự rDNA-ITS đã làm cho nó trở thành

một công cụ mạnh mẽ trong việc phân loại và xác định loài, đặc biệt là trong lĩnh vực

thực vật học và nắm học Các phân tích phân tử của vùng ITS cung cấp thông tin cầnthiết để xây dựng các cây phát sinh phức tạp và hiểu biết sâu hơn về sự da dang sinh

học của các nhóm sinh vật (White và ctv, 1990).

1.4.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu rDNA

Nghiên cứu về DNA ribosomal (rDNA) đã đóng vai trò quan trọng trong việchiểu sâu hơn về tiến hóa và mối quan hệ di truyền giữa các loài Điều này bắt đầu từ

những năm 1960, khi các nhà khoa học như Robert Holley, Marshall Nirenberg va Har

Gobind Khorana giải mã mã hóa genet học, mở ra cánh cửa cho việc nghiên cứu

rDNA Trong những năm tiếp theo, công nghệ DNA tái tổ hợp đã phát triển, điều nàycho phép nhà khoa học như Paul Berg thực hiện các thí nghiệm đầu tiên về tái tổ hợp

gene.

Trong thập kỷ 1970, công nghệ PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát

minh bởi Kary Mullis, mở ra cánh cửa cho việc nhân bản và phân tích rDNA một cách

hiệu quả Điều này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc nghiên cứu di truyền học

và sinh học phân tử, cho phép các nhà khoa học xây dựng cây phát sinh chủng loài và phân loại loài dựa trên trình tự rDNA.

Công nghệ nhanh chóng tiếp tục phát triển trong những thập kỷ sau, với việc sửdụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và trình tự hóa tự động, tạo điều kiện cho các nghiêncứu về đa dang sinh học và tiễn hóa của các loài dựa trên rDNA (Alberts và ctv, 2002).1.4.3 Ý nghĩa của ITS — rDNA trong phân loại nắm

Trong phân loại nấm bệnh, vùng trình tự rDNA-ITS (Internal TranscribedSpacer) đóng vai trò quan trọng như một dấu vết phân tử cho việc xác định và phânloại các loài nam Điều này là do các vùng ITS thường biến đổi nhanh giữa các loàikhác nhau, tạo ra sự đa dạng đi truyền mà có thể được sử dụng để phân biệt giữa

chúng.

Khi một mẫu nam được phân lập từ một mẫu môi trường, việc phân loại nó cóthể trở nên khó khăn nếu chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái ngoại hình Sự đa dạng di

16

truyền của vùng ITS cho phép nhà nghiên cứu xác định mối quan hệ di truyền giữa cácloài nam dựa trên trình tự gen của chúng.

Bằng cách so sánh các trình tự ITS từ mẫu nam không xác định với các cơ sở

dữ liệu đã biết, nhà nghiên cứu có thể xác định loài nắm đó thuộc về nhóm nào và tìm

ra mối quan hệ di truyền giữa chúng Điều này giúp trong việc phân loại chính xác cácloài nắm và hiểu biết về sự đa dạng sinh học của chúng (Schoch và ctv, 2012)

1.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

1.5.1 Khái niệm

PCR là viết tắt của Polymerase Chain Reaction Đây là một kỹ thuật sinh họcphân tử được sử dụng để nhân bản một đoạn cụ thể của DNA hàng triệu lần trong mộtquá trình lặp lại Phương pháp này đã có một ảnh hưởng sâu rộng trong nhiều lĩnh vựckhoa học và y học từ khi được phát triển bởi Kary Mullis vào những năm 1980 (Mullis

và ctv,1986).

1.5.2 Nguyên tắc phản ứng PCR

Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là nhân bản một đoạn cụ thể của DNAbằng cách sử dụng một enzyme gọi là DNA polymerase và một loạt các nucleotide(dNTP) trong điều kiện nhiệt độ và các chất liệu phản ứng phù hợp Quá trình nàyđược thực hiện qua một chu trình lặp lại gồm ba giai đoạn: giải nhiệt, phản ứng và giaiđoạn gia nhiệt Trong giai đoạn giải nhiệt, DNA mẫu được nung nóng để tách đôi

thành hai sợi Trong giai đoạn phản ứng, enzyme polymerase sử dụng mỗi sợi này như

là một khuôn mẫu dé tông hợp một sợi mới của DNA bằng cách thêm các nucleotidephù hợp Trong giai đoạn gia nhiệt, nhiệt độ được tăng lên để làm mát enzyme, sẵnsang cho chu trình lặp lại tiếp theo (Mullis & Faloona,1987)

1.5.3 Cách tiến hành một phản ứng PCR

PCR là một chuỗi các phản ứng gồm nhiều chu kỳ nỗi tiếp nhau Mỗi chu kỳgồm ba bước (Nguyễn Văn Thanh, 2009):

Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phan cần thiết cho

sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ "chảy" Tm của

phân tử, thường là 94°C - 95°C trong vòng 30 giây 1 phút Tại nhiệt độ này các phân

17

tử ADN mạch kép tách nhau ra hoàn toàn, tạo nên các sợi đơn để dùng làm khuôn chocác đoạn mỗi và ADN polymerase Đây là giai đoạn biến tính.

Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mối), cho phép các đoạn

mối bat cặp với khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40°C 70°C, tuỳ thuộc vào Tm của các mối sử dụng và kéo đài từ 30 giây đến 1 phút Đây là

-giai đoạn lai.

Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72°C giúp cho ADN polymerase chịu nhiệthoạt động tốt nhất Thời gian tuỳ thuộc độ dai của trình tự ADN cần khuếch đại,thường kéo dai khoảng 30 giây hay hơn nữa Đoạn ADN nam giữa hai mỗi được tổnghợp Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dai

Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa được nâng lên 94°C, nhưng lầnnay chỉ trong vòng 30 giây dé cho các mau ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban đầu

và sợi mới được tổng hợp) tách nhau ra Các sợi đơn này trở thành khuôn cho một chu

kỳ tổng hợp ADN khác

Tóm lại, một chu kỳ gồm ba bước: biến tính (đun nóng) để tách các sợi ADNkép thành sợi đơn dé làm khuôn, lại hoá (gắn kết) các đoạn môi vào sợi khuôn và kéodài (tổng hợp) bằng ADN polymerase, sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lạilàm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân

1.5.4 Ưu nhược điểm của phương pháp PCR

Việc ứng dụng rộng rãi kỹ thuật PCR có nhiều lý do:

Rất nhanh chóng Chỉ tốn khoảng 3 giờ là có thể khuếch đại một trình tự mongmuốn đã biết so với các kỹ thuật công nghệ di truyền "cô điển" phải mat một tuần hay

hơn nữa.

Đơn giản: PCR có thê được thực hiện trong một ống nhỏ với các thành phần tốithiểu va chỉ việc trộn chúng lại với nhau Các phương pháp tạo dòng gen điển hìnhkhác cần có các vật liệu mắc tiền như các mang và các nucleotid triphosphate đượcđánh dau phóng xa và các kỹ thuật đặc biệt PCR có thé được thực hiện trên các mẫu

có chứa ADN tương đối thô, ví dụ vết máu chưa được xử lý cho việc phân tích pháp y.Điều này ngược với các phương pháp về thao tác gen là cần phải có ADN cả khuôn

18

mẫu lẫn vector tương đối tinh khiết Các yếu tô trên cho thấy rằng PCR là một sự thay

đổi đáng kế so với các phương pháp cô điển cho việc khuếch đại các trình tự đặc biệt

Nhay: Phan ứng PCR cực nhạy vì có thé chi can ding một phân tử ADN làm

khuôn cũng thu được sản phẩm

Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng các ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật PCRđòi hỏi phải biết rõ trình tự ADN khuôn mẫu Đây là một điểm giới hạn của kỹ thuậtnày, nghĩa là nó vẫn phải dựa vào nền tảng của các kỹ thuật công nghệ di truyền chứkhông han là thay thé các kỹ thuật nay Do vậy người ta không sử dụng kỹ thuật nàytrong các kỹ thuật tạo dong gen thiết kế Trong một vài trường hợp phương pháp PCRkhông áp dụng được với các đoạn ADN kích thước lớn hơn 3 kb (thường 1 kb là tốtnhất) Ngoài ra khả năng ngoại nhiễm đối với phương pháp này là rất lớn (Nguyễn

Văn Thanh, 2009).

1.5.5 Giới thiệu về cây phát sinh loài

“+ Khái niệm cây phát sinh loài

Cây phat sinh loài là một khái niệm trong sinh học tiến hóa và sinh học phân tử,biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các loài và tô tiên chung của chúng dưới dạngmột biểu đồ đồ thị Trong cây phát sinh loài, mỗi nút trên cây thể hiện một loài hoặcmột tô tiên chung của một nhóm loài, và các nhánh biểu diễn sự phân chia và tiến hóa

của các loài qua thời gian (Hillis, D M., 1996).

s* Một số phương pháp xây dựng cây phát sinh loài

Phương pháp nhóm k-mer: Sử dụng các chuỗi ngắn (k-mer) từ dữ liệu gen để

xây dựng cây phát sinh (Maddison và ctv,1997).

Phương pháp tiếp cận kể từ vị trí cơ sở (Sanger sequencing): Sử dụng dit liệutrình tự cơ sở dé so sánh và xây dựng cây phát sinh (Felsenstein, 1981)

Phương pháp tiếp cận tiếp theo thế hệ (NGS): Sử dụng dữ liệu trình tự từ côngnghệ trình tự hóa thế hệ tiếp theo dé xây dựng cây phat sinh với độ phân giải cao hơn

và quan sát được nhiều biến thé gen hơn (Ronquist & Huelsenbeck, 2003)

Phương pháp dựa trên dữ liệu gen toàn bộ (Whole-genome sequencing): Sử

dụng đữ liệu trình tự toàn bộ gen của các loài đề xây dựng cây phát sinh (Drummond

& ctv, 2012).

19

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 2 năm 2024

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

2.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu, dụng cụ dé chuẩn đoán, lấy mẫu trên đồng ruộng

Số ghi chép, bút, thước, điện thoại, máy tính bỏ túi, giấy báo, túi giấy, túi nylông, nhãn,dao nhỏ, kéo cắt cành, kính lúp, chai nước sạch, lọ rửa chứa cồn êthanol,

thùng đá, tai liệu tham khảo,

2.2.2 Vật liệu, dụng cụ dé phân lập, định danh tại phòng thí nghiệm

s* Nguồn mẫu phân lập và nghiên cứu

Các bộ phận phận của cây bị nhiễm bệnh cho thấy các triệu chứng của các bệnhkhác nhau được xác định và được thu thập tại các quận huyện Tp.HCM gồm Thủ Đức,

Hóc Môn Bình Chánh.

“+ Dụng cụ, thiết bị máy móc

Dụng cụ: dia petri, ống nghiệm, que cấy, bông gòn thấm nước, kẹp giấy, giấy,viết, đầu tuýp, micropippet, ống nghiệm, ống đong, đèn côn, bình thủy tinh, kính lúp,

gang tay, lam kính, la men

Thiết bị: cân điện tử, bếp điện, lò vi sóng, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi,máy PCR, nỗi hấp khử trùng, tủ cấy, tủ say, tủ ủ nhiệt, tủ lạnh, laptop, máy anh

Hóa chat: cồn 96°, cồn 70°, nước cAt,

s* Thanh phan môi trường

Môi trường WA:

20

- 20g Agar

- 1000 mL nước cất

- M6i trường WA hap tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút

Môi trường PDA:

- 200 g Khoai tây

- 20 g Dextrose (glucose)

- 20g Agar

- 1000 mL nước cất

- _ Môi trường PDA hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút

Môi trường OMA:

- 50g Bột mạch

- 20g Agar

- 1000 mL nước cat

- _ Môi trường OMA hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút

2.3 Nội dung nghiên cứu

Quan sát và mô tả triệu chứng bệnh trên lan Dendrobium.

Phân lập, làm thuần các mẫu nắm

Định danh nắm gây bệnh dựa trên hình thái bào tử và vùng trình tự ITS

Khảo sát chỉ thị phân tử các loài nắm gây bệnh

Tinh tần suất xuất hiện của một số chi nắm gây bệnh

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu

Thu thập và bảo quản mẫu bệnh theo phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vậtcủa Roger Shivas và Dean Beasley (2005) Thời điểm thu mẫu cây bệnh thích hợp nhất

là ở giai đoạn đầu hoặc giữa của bệnh, theo một số nguyên tắc sau:

- Nhận dạng được cây ký chủ.

- Su dụng túi giấy dé lấy giữ mẫu bệnh

21

- _ Đóng, gói mẫu cần thận dé tránh va đập và hơi nước ngưng tu.

- Su dụng bút chì dé viết nhãn

- Quy ước đặt tên mẫu: mã hóa theo vị trí vết bệnh, địa điểm thu thập, ngày

thu thập.

Các mẫu bệnh trên lan Dendrobium được lẫy tại vị trí có triệu chứng đặc trưng

của bệnh thu thập từ 3 khu vực là Thủ Đức, Hóc Môn, Bình Chánh tại 4 vườn ở

TP.HCM, mỗi vườn thu 30 mẫu bệnh (Hình 2.1) Thu thập và bảo quản mẫu theo

phương pháp quản lí mẫu bệnh thực vật của Roger và cs (2005) sau đó chuyên vềphòng thí nghiệm dé tiến hành phân lập Kí hiệu vườn, mau, vi trí thu mẫu được thé

hiện tai Bảng 2.1.

Hình 2 1 Các địa điểm thu mẫu tại Tp.HCM

22

Bảng 2 1 Kí hiệu vườn, mẫu, vị trí thu mẫu

STT Mã Địa chỉthu Vitridinh vi Số Vị trí Ki hiệu mẫu

vườn mẫu bằng GPS mẫu thu bệnh

bệnh/ mẫu

vườn

| TD Lê Văn Chí, 10,86689°B, 30 La, LID1-LTD22;

Linh Trung, 106,78207° D Than TTD23-TTD30 Thủ Đức,

3 BCI Duong Hoang 10,66961°B, 30 La, LBC11-LBC123;

Phan Thai, 106,56698° D Than TBC124-TBC130 Binh Chanh,

Thanh phố Hồ

Chí Minh.

4 BC2 TânQuý Tây, 10,67154°B, 30 La, LBC21-LBC225;

Binh Chanh, 106,59395° Ð Than TBC226-TBC230

Thành phó Hồ

Chí Minh

Cách thu thập và xử lý mẫu bệnh

- Đôi với lá, hoa: nên lây mẫu có bé mặt khô ráo, nếu trong điêu kiện mưa

âm, bề mặt lá ướt thì có thé dùng giấy báo thấm khô trước khi kẹp mẫu giữacác lớp giấy báo hoặc các loại giấy thấm nước khác Khi ép và làm khô mẫu

cân chú ý rải lá ra sao cho không trùng lên nhau.

23