2.1 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát điều kiện nhân sinh khối cấp II của vi khuân Bacillus amyloliquefaciens
chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae ching DXT1.
Khao sát nguyên liệu lam chất mang tạo chế phẩm dang bột chứa vi khuẩn
Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumonia chủng DXT1.
Đánh giá hiệu quả chế phẩm dang bột chứa vi khuan Bacillus amyloliquefaciens chủng ĐXT6 và Klebsiella pneumonia chủng ĐXTI với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên hạt cà chua sau 28 ngày tồn trữ trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2023 đến thang 08 năm 2023.
Thi nghiém duoc tién hanh tai phòng thí nghiệm Bộ môn Bao vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
2.3 Vật liệu thí nghiệm
2.3.1 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Dụng cụ: dia petri (đường kính 80 mm), ống eppendorf, bình tam giác thủy tinh (250 mL), ống nghiệm, pipet (GLISON, FRANCE), thước do, dụng cụ cấy, que cấy.
Các thiết bị may móc: tủ cay khử trùng (IIAC2 — 4E8, Esco, Singapore), nồi hap khử trùng (MC40L, ALP, Japan), cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện, máy lắc
(SSL1, Stuart, Anh), máy NanoVueTM Plus (SCIE-PLAS LTD, Biochrom, Anh), May
lắc Vortex — ZX3 (Velp, Y).
15
2.3.2 Vật liệu nghiên cứu
Các vi khuẩn được cung cấp tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật.
Bảng 2.1 Danh sách các vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu
Chung vi
STT re a Loai
1 DXT6 Bacillus amyloliquefaciens 2 ĐXTI Klebsiella pneumoniae 3 CXT3 Ralstonia solanacearum
Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng ĐXT6 (A), vi khuan Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI (B) va vi khuẩn Ralstonia solanacearum chủng CXT3 (C) 2.3.3 Hóa chất và thành phan môi trường
Hóa chất: cồn 70%, cồn 96%, agar, peptone (Trung Quốc), glycerol (Trung Quéc), NaCl (Trung Quốc), cao nam men (Việt Nam), chitosan (Việt Nam), CaCO; (Trung Quốc),
CMC (Japan).
Thanh phan môi trường
Mật ri đường: Công ty TNHH Thiên Thao Hân. Thành phan: sucroza 44%, glucoza
13%, fructoza 10%, axit amin 3%.
Cám gạo: Công ty TNHH Xây dựng Dich vụ môi trường nguồn sống xanh. Thanh phần: protein, vitamin Bó, vitamin E, canxi, đường, chất xơ tiêu hóa được, calori.
Bột bắp: Công ty cô phan bột — thực phẩm Tài Ký.
16
Cao nam men: Công ty TNHH ICFood Việt Nam. Thành phan: Total nitrogen > 9%, amino nitrogen > 3%, độ am < 6%, sodium chloride < 2%, pH 5,3 - 7.2.
Biochar: Công ty TNHH MTV xuất khẩu than tự nhiên va than sinh học.
Talc: Công ty TNHH Sản xuất Thương mại Nguyên Liệu Công Nghiệp Miền Nam (Simico). Thành phan: 60% SiOa, 30% MgO.
Humic: được sản xuất và phân phối bởi Công ty TNHH Sản xuất Thương mại
Dịch vụ công nghệ sinh học Abio Việt Nam.
2.3.4 Một số môi trường thí nghiệm
Môi trường WA (Water Agar): Agar 20 g, nước cat 1000 mL. Hap khử trùng ở
lứG.
Môi trường LB (Luria Broth): Peptone 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, agar 20 g, nước cat 1000 mL. Hấp khử trùng ở 121°C.
Môi trường bột bap + mật rỉ đường: Mat ri đường 7 g, bột bắp 2 g, nước cất 1000 mL. Hấp khử trùng ở 121°C.
Môi trường cám gạo + mật rỉ đường: Mật ri đường 7 g, cam gạo 5 g, nước cất 1000 mL. Hap khử trùng ở 121°C.
Môi trường khoai tay + mật rỉ đường: Mật rỉ đường 7 g, khoai tây 200 g, nước
cất 1000 mL. Hap khử trùng ở 121°C.
Môi trường cao nam men + mật rỉ đường: Mật rỉ đường 7 g, cao nam men 5 g,
nước cat 1000 mL. Hap khử trùng ở 121°C.
17
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Khảo sát khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều
kiện phòng thí nghiệm
2.4.1.1 Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn
Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 trong
diéu kién phong thi nghiém
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu tố gồm 2 vi khuẩn. Với 5 môi trường (bột bap + mật ri đường, cám gạo + mật ri đường, khoai tây + mật ri đường, cao nấm men + mật ri đường va LB) và 4 mức thời gian (12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ), 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL gồm 20 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức là 3 ống nghiệm.
|Inmn= pm w
Hình 2.2 Môi trường nhân sinh khối cấp II. Bột bắp + mật ri đường (A),
cám gạo + mật rỉ đường (B), khoai tây + mật rỉ đường (C),
cao nắm men + mật rỉ đường (D) va LB (E)
18
Phương pháp thực hiện: Hút | mL dung dịch khuẩn có giá trị ODaoo là 0,3 ở môi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trường nhân sinh khối cấp II sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (Nguyễn Thị Ngọc
Sương va ctv, 2016).
Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (OD600) tại thời điểm 12 gid, 24 gid, 36 gid, 48 giờ sau khi nhân sinh khối.
2.4.1.2 Khảo sát nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp của khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều
kiện phòng thí nghiệm
Bồ trí nghiệm
Dựa trên thí nghiệm mục 2.4.1.1 chọn môi trường và thời gian tối ưu đề khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến nhân sinh khối của vi khuẩn.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 2 vi khuẩn.
Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 3 nghiệm thức ở mức nhiệt độ là 25°C, 30°C và 35°C, mỗi nghiệm thức là 3 ống nghiệm.
Phương phỏp thực hiện: Hỳt 1 mL dung dịch khuẩn cú giỏ trị ODứoo là 0,3 ở mụi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trường nhân sinh khối cấp II tối ưu ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B. amyloliquefaciens chủng ĐXT6 và K. pneumoniae chủng ĐXTI. Sau đó lắc 150 vòng/phút ở các mức nhiệt độ 25°C, 30°C và 35°C (Nguyễn Thị Ngọc Sương và ctv, 2016).
Chỉ tiờu theo dừi: Do mật độ quang (ODứp) sau thời gian nhõn sinh khối tối ưu ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B. amyloliquefaciens chủng DXT6 va vi khuẩn
K. pneumoniae chủng ĐX T1.
2.4.1.3 Khảo sát mức pH nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens ching DXT6 và Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI trong điều
kiện phòng thí nghiệm
19
Bồ trí thí nghiệm
Dựa trên thí nghiệm ở mục 2.4.1.1 và mục 2.4.1.2, từ đó chọn môi trường, thời
gian và nhiệt độ tối ưu dé khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sinh khối của vi khuẩn.
Thí nghiệm bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố, gồm 2 vi khuẩn.
Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 4 nghiệm thức ở mức pH là 6; 6,5; 7 và 7,5 và mỗi nghiệm thức là 3 ống nghiệm.
Phương pháp thực hiện: Hut 1 mL dung dịch khuẩn ở môi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trường nhân sinh khối cấp II tối ưu ở mục 2.4.1.1 với vi khuẩn 8. amyloliquefaciens chủng DXT6 và K. pneumoniae chủng ĐXTI. Sau đó lắc 150 vòng/phút với nhiệt độ tối ưu ở mục 2.4.1.2 (Nguyễn Thi
Ngọc Sương và ctv, 2016).
Chỉ tiờu theo dừi: Do mật độ quang (ODứoo)sau thời gian nhõn sinh khối tối ưu ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B. amyloliquefaciens chủng DXT6 va vi khuẩn
K. pneumoniae chủng ĐXT 1.
2.4.2 Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột của vi khuẩn
Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐX T1
Nguyên liệu dùng làm chat mang dang bột chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens chủng PXT6 và K. pneumoniae chủng DXT1 bao gồm: Cám gạo, tale, biochar và humic được lựa chọn với các tiêu chí đễ tìm, giá thành rẻ, giúp vi khuẩn duy trì mật số lâu nhất và hiệu quả phòng trừ bệnh trên hạt ca chua ở điều kiện phòng thí nghiệm (Đặng Hoài An và ctv, 2017).
Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 2 vi khuẩn. Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 7 nghiệm thức: Chất mang cám gạo bồ sung 10% chitosan (Cám); chất mang cám gạo bồ sung 10% tale và 10%
chitosan (Cám + talc); chất mang tale bổ sung 10% chitosan (Talc); chất mang biochar bổ sung 10% chitosan (Biochar); chất mang biochar bổ sung 10% talc và 10% chitosan (Biochar + talc); chất mang humic bồ sung 10% chitosan (Humic); chất mang humic bổ sung 10% tale và 10% chitosan (Humic + talc), mỗi nghiệm thức là 3 túi zip.
20
Hình 2.3 Chế phẩm chất mang sau khi trộn. Chất mang cám gạo bé sung 10%
chitosan (Cám) (A); chất mang cám gạo bé sung 10% tale và 10% chitosan (Cám + talc) (B); chất mang talc b6 sung 10% chitosan (Talc) (C); chat mang biochar bổ
sung 10% chitosan (Biochar) (D); chất mang biochar bổ sung 10% tale và 10%
chitosan (Biochar + talc) (E); chat mang humic bổ sung 10% chitosan (Humic) (F);
chất mang humic bổ sung 10% tale và 10% chitosan (Humic +talc) (H)
Phương pháp thực hiện
Hỗn hợp chat mang thực hiện theo quy trình của Vidhyasekaran và Muthamilan (1995) với công thức: 1.000 g chất mang + 10 g CMC + 15 g CaCO3 và bồ sung chất phụ gia có cải tiến với các chất mang khác nhau.
Sau đó, phân phối từng loại hỗn hợp chất mang sau khi trộn vào các đĩa petri (5 g/đĩa) và hấp khử trùng 2 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ.
Vi khuẩn sau khi nhân sinh khối ở điều kiện tối ưu được tiến hành đo mật độ quang (ODsứo). Sau đú, dựa vào kết quả ở đường chuẩn dộ pha huyền phự vi khuẩn ODsoo = 0,3 (Võ Thi Phương Trang, 2013). Bơm 2 mL huyền phù vi khuẩn đối kháng vào đĩa petri chứa hỗn hợp chất mang và trộn đều hỗn hợp. Sau đó cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 40°C trong thời gian 24 giờ. Và tồn trữ trong túi zip ở điều kiện nhiệt độ
phòng 28 + 29C.
21
Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (ODsoo) của vi khuan B. amyloliquefaciens chủng DXT6 và K. pneumoniae chủng ĐXTI sau 7, 14 và 28 ngày sau tồn trữ (Cân 1 g chế phẩm cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cat đã khử trùng, lắc trong 24 gid).
2.4.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng ĐXTI với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua sau 28 ngày tồn trữ trong điều kiện phòng thí nghiệm 2.4.3.1 Đánh giá hiệu quả chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 phòng vi khuẩn Ralstonia
solanacearum trén hat ca chua
Bồ trí thi nghiệm
Thí nghiệm phòng bệnh được bố trí theo kiểu hoàn toản ngẫu nhiên đơn yếu tố. Với 3 lần lặp lại (LLL), với mỗi LLL là 16 nghiệm thức, trong đó có 14 nghiệm thức chế phẩm, 1 nghiệm thức đối chứng nước cat và 1 nghiệm thức đối chứng bệnh.
Với 7 chế phẩm (Cám, Cam + talc, Talc, Biochar, Biochar + talc, Humic, Humic + talc) chứa vi khuan B. amyloliquefaciens chủng DXT6 và 7 chế pham (Cám, Cam + talc, Talc, Biochar, Biochar + talc, Humic, Humic + talc) chứa vi khuẩn K. pneumoniae chủng DXT1 với mỗi nghiệm thức là 3 dia petri, mỗi dia petri có 10
hạt cà chua.
Phương pháp thực hiện: Theo phương pháp Silva và ctv (2003).
Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây. Ủ hạt trên giấy thâm vô trùng được làm 4m đặt trong đĩa petri, giữ ở nhiệt độ phòng. Huyền phù vi khuẩn R. solanacearum được nhân sinh khối trong môi trường LB ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ, Sau đó, dựa vào kết quả ở đường chuẩn dé pha huyền phù vi khuan về mật độ quang ODsoo là 0,3 (Hong và ctv, 2012). Tiếp theo pha loãng chế phẩm, cân 1 g chế phẩm cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất đã khử trùng, lắc đều và tiến hành đo mật độ quang ODứũo tại thời điểm 28 ngày sau tồn trữ chế phẩm.
Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vào dung dịch chế phẩm chứa vi khuẩn đối kháng đã chuẩn bị trong 30 phút. Hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô
22
trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuẩn bệnh trong 30 phút. Hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, đặt vào đĩa môi trường WA ở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo đõi: Do chiều dai thân (mm), chiều dai rễ (mm), khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg) tại thời điểm 7 ngày sau khi đặt vào dia petri.
Chiều dai thân (mm): đo từ gốc đến ngọn. Chiều dài rễ (mm): đo từ gốc cho đến đỉnh rễ dài nhất. Khối lượng tươi (mg): cân khối lượng tat cả các cây. Khối lượng khô (mg): cân khối lượng khô của cây sau khi sấy ở 70°C đến khi đạt trọng lượng không đổi.
2.4.3.2 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens chủng ĐXT6 va Klebsiella pneumoniae chủng DXT1 trừ vi khuẩn
Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm trừ bệnh được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 2 dong vi khuẩn. Với 3 lần lặp lai (LLL), với mỗi LLL là 16 nghiệm thức, trong đó có 14 nghiệm thức chế phẩm, 1 nghiệm thức đối chứng nước cất và 1 nghiệm thức đối chứng bệnh. Với 7 chế phẩm (Cám, Cám + talc, Talc, Biochar, Biochar + talc, Humic, Humic + talc) chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens chủng ĐXT6 và 7 chế pham (Cam, Cam + talc, Talc, Biochar, Biochar + talc, Humic, Humic + talc) chứa vi khuẩn
K. pneumoniae chủng DXT1 với mỗi nghiệm thức là 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri có 10
hat ca chua.
Phuong phap thuc hién: Theo phuong phap Silva va ctv (2003).
Chuẩn bị hạt giống, huyền phù vi khuẩn R. solanacearum va pha loãng dung dịch chế pham tương tự mục 2.4.3.1.
Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vào huyền phù vi khuẩn bệnh đã chuẩn bị trong 30 phút. Hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào dung dịch chế phẩm chứa vi khuẩn đối kháng trong 30 phút. Hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, đặt vào đĩa môi trường WA, đặt ở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo đõi: Do chiều dai thân (mm), chiều dai rễ (mm), khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg) tại thời điểm 7 ngày sau khi đặt vào đĩa petri.
23
Chiều dài thân (mm): đo từ gốc đến ngọn. Chiều dai rễ (mm): đo từ gốc cho đến đỉnh rễ dài nhất. Khối lượng tươi (mg): cân khối lượng tat cả các cây. Khối lượng khô (mg): cân khối lượng khô của cây sau khi sấy ở 70°C đến khi đạt trọng lượng không đổi.
2.5 Xử lý số liệu
Các số liệu được tổng hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel
2019.
Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1.
24
Chương 3