Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập và định danh các vi khuẩn chịu mặn có khả năng phân giải lân từ vùng trồng lúa khu vực đồng bằng sông Cửu Long

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài phân lập dòng vikhuẩn có khả năng chịu mặn vùng trồng lúa khu vực Đồng bằng sông Cửu Long vàđánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với hạt lúa trong

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

kwxkxwww%*%

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

PHAN LAP VÀ ĐỊNH DANH CÁC VI KHUAN

CHIU MAN CÓ KHẢ NANG PHAN GIẢI LAN

TU VUNG TRONG LUA KHU VUC

DONG BANG SONG CUU LONG

SINH VIÊN THUC HIEN — : NGUYEN THỊ KIM UYEN

NGANH : BAO VE THUC VAT

KHOA : 2019 - 2023

Thành phó Hồ Chí Minh, tháng 8/2023

PHAN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC VI KHUAN

CHIU MAN CÓ KHẢ NANG PHAN GIẢI LAN

TU VUNG TRONG LUAKHU VUC

DONG BANG SONG CUU LONG

Tac gia

NGUYEN THI KIM UYEN

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài em đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ từ thầy

cô, các anh chị, bạn bè và gia đình đây là động lực giúp em hoàn thành khóa luận tốt

nghiệp và em xin gửi lời cảm ơn này đên:

Em xin chân thành cảm ơn quý Thay, Cô giáo của Trường Đại học Nông LâmThành phố Hồ Chí Minh nói chung, cùng Quý Thay, Cô giáo của Khoa Nông học nóiriêng đã truyền đạt những kiến thức cho em trong khoảng thời gian học tập tại trường

Em xIn chân thành cảm ơn cô Võ Thị Ngọc Hà và chị Phạm Kim Huyền đã tận

tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện khóa

luận tốt nghiệp

Cảm ơn bạn Đỗ Trần Đăng Khoa, các bạn cùng làm đề tài trong phòng thínghiệm PV105 và tất cả bạn bè xung quanh đã ủng hộ và giúp đỡ em trong suốt thờigian thực hiện đề tài

Cuối cùng con xin gửi lời biết ơn chân thành nhất đến Cha, Mẹ đã sinh thành,nuôi nang, quan tâm giúp đỡ, hỗ trợ con và luôn là chỗ dựa vững chắc, ủng hộ tinhthần cũng như tạo mọi điều kiện cho con trong suốt quãng thời gian học tập và hoanthành khóa luận tốt nghiệp này

Thành phó Hồ Chí Minh, thang 8 năm 2023

Sinh Viên

Nguyễn Thị Kim Uyên

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và định danh các vi khuẩn chịu mặn có khả năng phângiải lân từ vùng trồng lúa khu vực Đồng bằng sông Cửu Long” được tiến hành tạiphòng thí nghiệm bệnh cây Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từtháng 2/2023 đến tháng 8/2023 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài phân lập dòng vikhuẩn có khả năng chịu mặn vùng trồng lúa khu vực Đồng bằng sông Cửu Long vàđánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với hạt lúa trong điều kiện stress mặn

nhân tạo.

Thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải lân và tang sinh IAA của các chủng vi

khuẩn, đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng trên hạt lúa trong điều kiện stress mặnnhân tạo, được bồ trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi nghiệm thức

là 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri

Phân lập được 11 dòng vi khuẩn chịu mặn nội sinh và ngoại sinh từ khu vựctrồng lúa ở tỉnh Tiền Giang và Bến Tre Đánh giá khả năng chịu mặn tối đa của các vi

khuẩn phân lập trong phòng thí nghiệm trên môi trường Luria Broth cho thấy có 3chủng có khả năng chịu mặn ở nồng độ 14% NaCl, 8 chủng có khả năng chịu mặn ởnồng độ 10% NaCl Có 7 chủng gồm TGLD3, TGLRI, TGLR, BTLD2, BTLD3,

BTLD4, BTLRI có khả năng phân giải lân sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch

PVK, 6 chủng gồm TGLR1, TGLD3, BTLD2, BTLD3, BTLD4, BTLRI có khả năngtổng hợp IAA được muôi cấy trong môi trường LB — L lỏng sau khoảng 3 — 5 ngày

Các chủng có khả năng phân giải lân và tăng sinh IAA được thí nghiệm trên

giống lúa OM 5451 trong điều kiện ngập mặn nhân tạo 1% NaCl cho thấy chủng

BTLD3 có chiều dai trung bình rễ cao nhất (91,7 mm), gấp 1,84 lần so với DC2 (stress

mặn 1%) Chủng BTLD2 có trung bình chiều dài rễ thấp nhất (71,7 mm) nhưng vẫngấp 1,54 lần so với DC2 Ở điều kiện ngập mặn nhân tạo 2% NaCl, chủng BTLD3 cóchiều dài trung bình rễ cao nhất(41,2 mm), gap 3,64 lần so với DC (stress mặn 2%).Ngoài ra, ở điều kiện không mặn nghiệm thức có bổ sung khuẩn (BTLD3) có chiều daitrung bình rễ lúa cao gấp 1,1 lần so với đối chứng không bổ sung khuẩn

Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn lên chiều dai mam và rễ kéo dai trong 7 ngày

đầu sau khi đặt hạt cho thấy: Sau khi đặt hạt thì nghiệm thức ngâm hạt với mật số 107

CFU/mL có ảnh hưởng đến chiều dai mầm tốt nhất, kế đến là nghiệm thức ngâm hạtvới mật số 108 CFU/mL và 105 CFU/mL Nghiệm thức ngâm hạt với mật số 10°

CFU/mL có ảnh hưởng đến chiều dài mầm tốt nhất, kế đến là nghiệm thức ngâm hạt

với mật số 105 CFU/mL và 10’ CFU/mL

MỤC LỤC

Trang

NGUYÊN THỊ KIM UY EN x eneevnooiieroiiindsiiinelidizssidrlgtpiiegxgxestsisseosrrresosine iLOI CAM ƠN -52- 2221 21221221221221221221221221211112121211212121111121212121121 re iiTÓM TẮTT 2222 2222152122112211211211221121111121121121121111121121121111211121111211 1 re iii

MỤC LUC 0 eeecscessessesssessessessecssesssssnessesnssssssessisssssnessssnssseesssnstiesssssistsnssietsessseesesseseeees V

DANH MỤC CÁC CHU VIET TẮTT - 252+S<+SE2EE2EE2EE2EEEEE2EE22122122122122322x viiil# J2 195w UƯƠỚ/ỚỚợớợƠƠƠƠƠ ẲẲ ẢẲ"Ẳ"ẲẢẢ ixDANH MỤC CÁC HINH 0 c.cccsscsssssesessessesececsevsececseveeceveseeececseseesecsevessevssvessevseveseveeees x

GIỚI THIBU ooo cce ccc ecccecesesecseesessesssssesessessestesessessessieisessissisississssesssseseesisstsseseeeseeeeees 1

MUG THỂ ong ng erepueerere eer eer sere verreeenre seen cee ee enee eer ree 2

T1 ————=—— -—-——-—-.— 2Giới hạn đề tài 2-5 Ss St S2232E1252212112111211211121121111111111111112112121211 112121 xe 2

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU - 22s sseestsse+ssezssersserse 3

1.1 Đo điềm và tính chất cña đốt ruấn 22g td

1z2 Tình hình xâm nhập man ở Việt Nati sesesdisetbdtiieiiiioSA GESLDĐSEEĐIESLISSEESEEĐHHGSEUEH2S588 5

1.3 Tình hình xâm nhập mặn trên thé giới - 2 + 2+ 2+S+EE+Ez+E+EE+EEZE2EE2EzcEerxrrr 5

1.4 Cơ chế phan ứng của thực vật trong điều kiện mặn 2 2+22222z+2z22zzzcz22 61.5 Mối quan hệ giữa vi sinh vật và thực vật ¿2+ 2+2222+222E22E2222E22E22222222 22-2 8

1.6 Vi sinh vật kích thích sinh trưởng ở thực vật (PGPMI) ¿5 S-<<+c<sccssxsxss 9

Nhóm vi khuẩn vùng sinh quyền và vi khuẩn nội sinh (PGPR) - 2-22 111.7 Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về vi sinh vat tăng chống chịu mặnCUA Go] Ni 121.7.1 Một số nghiên cứu trong nước - 2 222222222E2EE2EE2E122E22E2212E2EErrrrrres 181.7.2 Một số nghiên cứu trên thế giới - 2-22 2+2E22222EE2E22EE22E22EE22E2222223222222222 13Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 15

2.1.NÔI.duïig-nghiÊH6ỨÙ: coi led da He g0 2x608846 846 4dnggeio gu anng2ke 15

2.2 Thoi gian va dia GiGi 15

2.3 Vật liệu, dung cu, thiết bị thí nghiệm oo ccc ccsecseesessessessessesseesesseseesaeeeeaee 15

2-3-1 V'IÐL.LICUH6HHGHE/G:ssesassiesedsestiksosudt.pbussdisfsdbiaoli2mieblidesteilusxSla.iE8.-S00agi-EEKnuj04.018ue/15g09i 15

2.3.2 Hóa chất 25s: 222 tt 22 Hee l6

733 T1iênh phần triểi/ÍTHỆNG «se oan nhọn 2t hữu Hước ti 208352210007602000010 1m 0 17

2.4 Phương pháp thực hiện thí nghiệm nghiên cứu - - 5-5552 ++*c+£+xcscsces 17

2.4.1 Thu thập và khử trùng mau ¿2© 2522222 2E2EE22E221 2122121212221 re i?2.4.2 Phân lập vi khuan va xác định khả năng chịu mặn tối da của các chủng vi khuẩn

HH NAB (TƯ chang nong gõ ca Nga Bi HỒ GEN GIAS0130L0020830308AA44089030S0G5338018156NGLGSGHH.GGIĐNGGASRSISGEHEEGD4EG083910/0E 18

2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc thuầnn -+©55++c5sce2 192.4.4 Xác định khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn phân lập được (TCVN

Bop 1) cotaggczuz 20

2.4.5 Xác định khả năng tổng hợp 3 — indol — axetic (IAA) của chủng vi khuan phân

lập bằng phương pháp Salkowski (Glickmann & Dessaux, 1995) -. - 202.4.5.1 Phương pháp định tính khả năng tăng sinh IAA của các chủng vi khuẩn 20

2.4.5.2 Dựng đồ thị đường chuẩn 2 22222222222122122512212112212212211221 22.222 ze pal2.4.5.3 Phương pháp định lượng khả năng tăng sinh IAA của các chủng vi khuẩn phân

TẬP (Ho nunnng0 0n B3 ác g3 nV1G0500138680%348103035881188918563348838081%.055883086154199304S401358E.BDS143088500188 21

2.4.6 Khao sát khả năng kích thích sinh trưởng trên hạt lúa từ các chủng vi khuẩn có

khả năng phân giải lân va tang sinh 3 — indol — axetic (LAA) -+-<-<>+ 22

2.4.8 Khao sát ảnh hưởng của vi khuân lên khả năng nảy mam và kích thích tăng

trưởng cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm 2-22 2+22+22z+2++zzzzzxzz2 23

2.5 KU LY 08.454 24

Chương 3 KET GUA VA THAO LUẬN sscsesuorscsssxecsrsercoricssnerciernusnrsestierinssasaeceneennte 25

3.1 Kết qua do pH và độ mặn đất mau oo eee cccece cece esseesseesesstessessessseeseesseeeees 25

3.2 Kết quả khả năng chịu mặn tối đa của các chủng vi khuẩn phan lập được 26

3.3.1 Đặc điểm hình dang khuẩn lạc - 2 2 22S2+EE+EE2EE+EE£EE2EE2EEzEEerxerxrrrrred a3.5 Kết quả thí nghiệm xác định khả năng tổng hợp 3 — indol — axetic (IAA) của vikhuẩn bằng phương pháp Salkowski (Glickmann and Dessaux, 1995) 313.5.1 Kết quả định tính khả năng sinh tổng hợp IAA -2 22©52222+25+22zzcsz+2 313.5.2 Kết quả thí nghiệm định lượng IAA - 22¿2222222222E2E22E2E22E+2E2Ezzzzzze2 32

vi

3.6 Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên hạt lúa từ các chủng vikhuẩn có khả năng phân giải lân và tăng sinh 3 — indol — axetic (IAA) trong điều kiện

s90 8/18 ¡90 2800001 33

3.8 Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn BTLD3 lên khả năng nay mam và kích thíchtăng trưởng cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm - 2-52 552+25252 373.8.1 Ảnh hưởng lên chiều đài mầm - 2-22 222S22E22EE£2E£2EE2EE222E22E2222222z22ze 373.8.2 Ảnh hưởng lên chiều đài rễ 2 22 ©2222222E2EE2EE22EE22E2E221223222122122222xee 39KẾT T.UẤN VA BO NGHĨ ke ggenannenenteoeosaekgrsoiGngtsdttcsgitgigtosgtdftepstBos3enstinxe 41

ee Al

TÀI LIEU THAM KHẢO -2 ©22222222E+2222E2EEE22221222122212222122721222122222 22 42

55009922 47

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

ABA Axit phytohormone abscisic

Ctv Cộng tác viên

ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long

EC Electrical Conductivity (Độ dẫn điện)

PGPM Plant growth promoting microorganisms

(Vi sinh vật kích thích sinh trưởng ở thực vật)

PGPR Plant growth-promoting rhizobacteria

ESP Exchange Sodium Percentage

(Phan trim natri trao déi)

viii

DANH MỤC CAC BANG

Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu và địa CRU et TS 16Bang 3.1 Giá trị pH và độ mặn trên đất mẫu thu thập được -2- s52 25Bảng 3.2 Kết quả khả năng chịu mặn tối đa của các chủng vi sinh vật phân lập được 26Bang 3.3 Đặc điểm hình dang khuẩn lạc 2-22 22+2E22E22E22E22E222222222222222222e2 a9Bang 3.4 Kết qua khảo sát khả năng phân giải lân các chủng vi sinh vật phân lập được

a a wet a nel 29

Bang 3.5 Kết qua đường kính vòng phân giải lân (mm) - 2: 22522222222z22zz222 29

Bang 3.6 Két qua thi nghiệm định lượng 3 — indol — axetic ([AA) của vi khuẩn bang

phurong phap SalkOwSki 0 32

Bang 3.7 Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng vi sinh vậtlên tỉ lệ nay mam của hạt lúa sau 10 ngày gieo -2-52252s2csscccscseescecss-s . 33Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng vi sinh vậtlên chiều dài rễ lúa sau 10 ngày gieo 2 2¿©2222122E22EE22E22E12212221271223222122 34Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn đến khả năng chịu mặn của cây0lúa sau 8 ngày gieo ở điều kiện stress mặn 2% 2- 2+2+22+S2+E££E2EE2E.ZEzEzzzrxcra 36Bang 3.10: Chiều dài mầm (mm) sau khi hạt lúa được xử lý với vi khuẩn BTLD3 ởcác thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau khi đặt hạt - 5c 5S+2cxeSr.crrrrrrrrrrrrrreee 37Bảng 3.11 Chiều dài rễ lúa (mm) sau khi hạt lúa được xử lý với vi khuẩn BTLD3 6

các thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau khi đặt hate eccecsecseeseesesseeseeseestesteneeneeeee 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ khái quất cơ chế chống chịu mặn của thực vật (Eva va ctv, 2020) 8Hình 2.1 Cách đặt hạt trên giấy tham Whatman (A) và sau khi cuộn lại (B) 24Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram của một số chủng tiêu biểu -2-©222 522: 28Hình 3.2 Các dòng vi khuẩn không phân giải lân (A) TGLD2, dòng vi khuẩn phân giải

lân (B) TGLR2, (C) BTLD4 và (D) BTLD3, (E) BTLRI - 5-5: 31

Hình 3.3 Kết quả định tính màu sắc của các chủng (A) TGLRI,( B) TGLD3, (C)BTLD3 , (D) BTLD2 sau khi phản ứng màu với thuốc thử Salkowski tiêu biéu .31Hình 3.4 Thang chuẩn độ IA A 2- 22 SS2222S£EE2EE2E22E2212212122122121212112121 21212 Xe, 32Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa hàm lượng IAA và

Big) ODL maaan eee ee ee 32

Hình 3.6 Tác động tích cực đến sy phát triển rễ lúa của chủng vi khuẩn so với đối

C01) ee ee ee 35

Hình 3.7 So sánh tác động tích cực của chủng vi khuan lên chiều dài rễ Ita 35Hình 3.8 Tác động tích cực đến sự phát triển rễ lúa của chủng vi khuẩn so với đốihứng trong điều kiện stress mặn 2% NaC ccenccennsnccrncasnconeninnennsrnacnnchunerastiorinanisenannsase 37

vào nội đồng Xâm nhập mặn làm thiệt hại đến sản xuất nông nghiệp, nuôi trồng thủy

sản, nguồn nước sinh hoạt của người dân không còn, dẫn đến kinh tế bị giảm sútkhông phát triển (IPCC WGII AR5, 2014)

Cây Lúa là một trong ba loại cây lương thực phổ biến trên thế giới, đặc biệt ở

các quốc gia châu Á (FAO, 1998) Ở Việt Nam, lúa gạo là nguồn lương thực chínhcung cấp cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu (Vietnam Food Association, 2021).Theo thống kê của Cục Trồng trọt văn phòng phía Nam (Bộ Nông nghiệp và Phát triểnnông thôn), tính đến ngày 20/3/2020 Tổng diện tích lúa vùng ĐBSCL bị ảnh hưởng

do hạn mặn làm thiệt hại năng suất là 41.207 ha; trong đó vụ Thu Đông, Mùa và lúa

Tôm là 16.959 ha; lúa Đông Xuân 2019 - 2020 là 39.066 ha Trong đó, diện tích bị

thiệt hại ngoài kế hoạch khuyến cáo xuống giống của Cục Trồng trọt và các tỉnh là11.850 ha (Bến Tre 5.287 ha; Kiên Giang 2.844 ha; Sóc Trăng 3.719 ha), diện tích cònlại xuống giống trong kế hoạch bị thiệt hại là 27.216 ha

Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng hoạt động của vi sinh vật đất đóng vai tròquan trọng trong việc định hình, làm tăng độ phi và cải tạo dinh đưỡng cho đất Các visinh vật này được tìm thấy ở tầng sinh quyền và tế bào rễ cây, chúng có khả năng chịumặn và tăng cường chống chịu cho cây trong môi trường mặn (Numan, 2018) Ngoài

ra, nhiều loại vi khuẩn vùng rễ thúc day tăng trưởng giúp đỡ thực vật liên kết củachúng bang cách sản sinh ra nội tiết tô thực vật, các enzym phá vỡ hormone ethylengây stress trên thực vật và làm tăng sự hiện diện của các khoáng chất như phốt pho và

sat Nói cách khác, các vi sinh vật giúp cải thiện dinh dưỡng thực vật và sản xuât các

hop chất thúc đây sự tăng trưởng đồng thời giúp phá vỡ các tác nhân gây ức chế tăng

trưởng Vì vậy, vi khuẩn vùng rễ còn có tác dụng giúp tăng sự hấp thu dưỡng chất từđất, điều này có ý nghĩa cực kì quan trọng đối với thực vật trong điều kiện nhiễm mặn

(Shuipys, 2020).

Chính vì thé đề tài: “Phân lập và định danh các vi khuẩn chịu mặn có khảnăng phân giải lân từ vùng trong lúa khu vực Dong bằng sông Cứu Long” đượctiến hành nhằm tuyên chọn các dòng vi khuẩn tốt nhất phục vụ sản xuất nông nghiệp

và bảo vệ môi trường.

Mục tiêu

Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng chịu mặn vùng trồng lúakhu vực đồng bằng sông Cửu Long

Yêu cầu

Phân lập được vi khuẩn chịu mặn vùng trồng lúa khu vực ĐBSCL va khả năng

chịu mặn tối đa

Xác định được khả năng phân giải lân va IAA của vi khuẩn, và ảnh hưởng của

vi khuẩn đến sự nảy mam và phát triển của lúa giống OM5154 trong điều kiện nhiễm

mặn nhân tạo trong phòng thí nghiệm.

Giới hạn đề tài

Mẫu được thu thập tại 2 khu vực trồng lúa ở các tỉnh Tiền Giang, Bến Tre

Đánh giá sự ảnh hưởng của vi khuẩn đến sự nảy mam và rễ của hạt giống lúatrong điều kiện phòng thí nghiệm

điện của đất, có đơn vị là dS/m (1dS/m = 0,64%o) Các loại muối hòa tan muối phổbiến nhất hiện nay trong đất mặn là clorua, sunphat, canxi, natri và magié, Natri va

clorua là các ion chiếm ti lệ nhiều nhất trong các loại đất mặn Nhiều đất mặn có chứa

lượng đáng kê của thạch cao [CaSOu2H›O] Ngoài ra đất chứa nhiều muối hòa tan (1 —

1,5% hoặc hơn) như những loại muối tan là NaCl, NazSOx, CaCh, CaSO¿, MegCh,NaHCO: Những loại mudi nay có nguồn gốc khác nhau (nguồn gốc lục địa, nguồngốc biển, nguồn gốc sinh vật), nhưng nguồn gốc nguyên thủy của chúng là từ cácthành phần khoáng của đá núi lửa Trong quá trình phong hóa đá, những muối này bịhòa tan di chuyên tập trung ở những dang dat trũng không thoát nước (Lê Xuân

Phương, 2009).

Dat mặn là một van đề toàn cầu có ảnh hưởng đến khoảng 20% diện tích đất

tưới tiêu và làm giảm năng suất cây trồng đáng kể (Qadir va ctv, 2014) Theo Trung

tâm phòng tránh và giảm nhẹ thiên tai, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn: Xâmnhập mặn là hiện tượng nước mặn với nồng độ mặn bằng 4%o xâm nhập sâu vào nộiđồng khi xảy ra triều cường, nước biển dâng hoặc cạn kiệt nguồn nước ngọt Quá trìnhhình thành đất mặn ở đây chủ yếu do muối được tích tụ và đi chuyên theo mao dẫn rồitích tụ ở tầng đất mặt, sau đó chảy tràn trên mặt đất theo kiểu rửa trôi (Abrol và

Bhumbla, 1979).

Theo báo cáo tổng hợp tình hình hạn hán, xâm nhập mặn khu vực miền nam

2019 — 2020 của Cục phòng chống thiên tai, mùa mưa năm 2019 trên lưu vực sông MêCông xuất hiện muộn, thời gian mùa mưa ngắn, tổng lượng dòng chảy năm chỉ ở mức

trung bình — thấp Dòng chảy về Đồng bang từ đầu mùa khô đến nay giảm nhanh, đangxuống ở mức rất thấp so với tài liệu trung bình nhiều năm (TBNN) từ 1980 đến nay.

Dựa vào nguồn sốc, đất nhiễm mặn được chia thành 2 loại là sơ cấp và thứ cấp.

Nhiễm mặn sơ cấp là nhiễm mặn thông qua các quá trình tự nhiên như phong hóa vật

lý, phong hóa hóa học và vận chuyển muối từ đá mẹ, trầm tích hoặc nước ngầm Nướcngầm hòa tan các muối có trong đá bên trong lòng đất và được dâng đến gần mặt đấtthông qua mao dẫn và bốc hơi của đất gây nhiễm mặn đất mặt Những vùng không tiêutrong thời gian dài cũng xảy ra hiện tượng này Đất cũng có thê bị nhiễm mặn do nướcbiển ở những vùng ven biến khi lũ lụt, sóng thần hoặc do triều cường trong thời gian

dài hình thành trầm tích biển Nhiễm mặn thứ cấp bắt nguồn từ các hoạt động của conngười như tưới tiêu trong nông nghiệp Sự khan hiếm nước trong môi trường khô hạnđòi hỏi phải sử dung nước mặn ít hoặc mặn dé đáp ứng nhu cầu nước cho cây trồng.Việc sử dụng nước kém chất lượng này không hợp lý, đặc biệt là trên các loại đất có

hệ thống thoát nước kém dẫn đến sự mao dẫn và bốc hơi của đất làm giảm giá trị tàinguyên đất (Daliakopoulos và ctv, 2016; Zaman và ctv, 2018)

Richards và ctv (1954) đã mô tả khả năng sinh trưởng của cây trồng qua 5 mức

độ mặn khác nhau dựa trên ECe của đất (Zaman và ctv, 2018):

- Không mặn (2 dS/m, nồng độ muối hòa tan: 0 - 1,28%): Ảnh hưởng củamặn gần như không đáng kẻ

- Mặn ít (từ 2 - 4 dS/m, nồng độ muối hòa tan: 1,28 - 2,56%): Năng suất của

cây trồng nhạy cảm với mặn bị hạn chế.

- Man vừa (từ 4 - 8 dS/m, nồng độ muối hòa tan: 2,56 - 5,12%): Năng suấtcủa nhiều cây trồng bị hạn chế

- Man trung bình (từ 8 - 16 dS/m, nồng độ muối hòa tan: 5,12 - 10,24%):Chỉ những cây trồng chịu mặn mới duy trì được năng suất

- Rat mặn (16 dS/m, nồng độ muối hòa tan: > 10,24%): Chỉ một vài cây

trông chịu mặn cho năng suât đạt yêu câu.

1.2 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hai vùng chịu ảnh hưởng nặng nề nhất của hiện tượng xâm nhập

mặn là Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) và Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).Riêng mùa khô 2015 - 2016, diễn biến xâm nhập mặn tại ĐBSCL được đánh giá lànặng nề nhất trong 100 năm qua và được dự báo còn dién biến xấu hơn trong nhữngnăm tiếp theo (Cục Thông tin khoa học và Công nghệ Quốc gia, 2016)

Theo số liệu thống kê của Trung tâm Khí tượng Thủy văn Quốc gia, hạn mặn

mùa khô 2019 — 2020 đã xảy ra nghiêm trọng hơn năm 2016 Với ranh mặn 4 g/l xâm

nhập sâu 57 km theo sông Hàm Luông sâu hơn trung bình nhiều năm 24 km Vào

tháng 1 năm 2020, xâm nhập mặn tiếp tục lắn vào cửa sông Cửu Long 45 — 66 km sâuhơn mùa khô 2016 từ 6 — 7 km Tháng 5 năm 2020, phạm vi mặn tiếp tục vào sâukhoảng 100 — 110 km trên sông Vàm Cỏ, vào sâu 50 — 71 km đối với sông Tiền, vào

sâu 70 km đối với sông Hậu và vào sâu 65 km đối với sông Cái Lớn

Tình hình xâm nhập mặn vẫn còn đang diễn biến phức tạp và mức độ mặn ngàycảng nghiêm trong hơn, Nguyễn Duy Khang va ctv (2008) đã dùng mô hình MIKE 11

dự báo sự xâm nhập mặn với nồng độ 2,5 g/l vào đất liền có thé lên đến 20 km vào

năm 2030 và 50 km vào năm 2090.

Đợt hạn - mặn lịch sử đã gây thiệt hại nặng nề cho 9/13 tỉnh thành ven biển, với

độ mặn đạt đỉnh 4%o và có đến 11/13 địa phương trên cả nước công bồ tình trạng thiên

tai hạn hán, xâm nhập mặn: Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, BạcLiêu, Ca Mau, Kiên Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Ninh Thuận (Cục Thông tin khoahọc và Công nghệ Quốc gia, 2016) Hơn nữa, có những nơi ranh giới mặn xâm nhập

sâu vào đất liền lên tới 30 km Theo báo cáo đến ngày 25/3/2016, có đến 170.000 ha

lúa và gần 8.000 ha hoa màu bị thiệt hai (Trung tâm Chính sách và Kỹ thuật phòngchống thiên tai, 2016)

1.3 Tình hình xâm nhập mặn trên thế giới

Đất mặn là một vấn đề toàn cầu có ảnh hưởng đến khoảng 20% diện tích đấttưới tiêu và làm giảm năng suất cây trồng đáng ké (Qadir va ctv, 2014) Theo Trungtâm phòng tránh và giảm nhẹ thiên tai, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn: Xâm

nhập mặn là hiện tượng nước mặn với nồng độ mặn bằng 4%o xâm nhập sâu vào nội

đồng khi xảy ra triều cường, nước biển dâng hoặc cạn kiệt nguồn nước ngọt Quá trình

hình thành đất mặn ở đây chủ yêu do muối được tích tụ và đi chuyền theo mao dẫn rồi

tích tụ ở tầng đất mặt, sau đó chảy tràn trên mặt đất theo kiểu rửa trôi (Abrol và

Bhumbla, 1979).

Người ta ước tính có trên 800 triệu hecta dat va 32 triệu hecta đất nông nghiệpchịu ảnh hưởng của muối trên toàn thế giới (FAO, 2015) Theo Ivushkm và ctv (2019)

đã thực hiện nghiên cứu về điện tích đất bị nhiễm mặn trên toàn thé giới, sử dung công

nghệ viễn thám, cơ sở dit liệu từ Hệ thống Thông tin Dat Thế giới (WoSIS) kết hợp

mô hình hóa Dữ liệu công bố có khoảng 1,1 tỷ hecta đất bị nhiễm mặn, trong đó 1 tỷhecta nhiễm mặn nhẹ (2 - 4 dS/m); 19.800 ha nhiễm mặn trung bình (4 - 8 dS/m); 2.300 ha nhiễm mặn cao (8 - 16 dS/m) (Omuto và ctv, 2020).

1.4 Cơ chế phản ứng của thực vật trong điều kiện mặn

Stress ở thực vật là ảnh hưởng của các điều kiện ngoại cảnh đến sinh trưởng,phát triển hoặc năng suất của cây trồng Căng thăng thực vật thường phản ánh một sốthay đổi đột ngột trong điều kiện môi trường và được chia thanh hai loại chính là:

stress phi sinh hoc va stress sinh học.

- Tác nhân gây stress sinh học ở thực vật là các sinh vật sông, đặc biệt là

virus, vi khuẩn, nấm, tuyến trùng, côn trùng, nhện và cỏ dai gây ra Những tác nhânnảy trực tiếp lay đi chất dinh đưỡng và làm chết cây vật chủ

- Các stress phi sinh học là những tác động vật lý, hoá học như hạn hán

(stress nước), úng nước, nhiệt độ khắc nghiệt (lạnh, sương giá và nóng), độ mặn, độc

chất khoáng và bức xa tia cực tim (UV) tác động tiêu cực đến sinh trưởng, phát triển,năng suất và chất lượng hạt giống của thực vật (He và ctv, 2018) Trong tương lai, tìnhtrạng khan hiém nước ngọt sẽ tăng lên dẫn đến cường độ căng thang phi sinh học cũng

sẽ tăng theo Do đó, cần phải phát triển các chế phẩm hỗ trợ cây trồng hay các giống

cây trồng có khả năng chống chịu với các áp lực phi sinh học để đảm bảo an ninh

lương thực trong tương lai (Audil và ctv, 2019).

Stress mặn

Stress do mặn là một vấn đề khó khăn và ngày càng trở nên nghiêm trọng bởi

sự nhiễm mặn ngày càng gia tăng của đất canh tác trên toàn thế giới (Munns và Tester,2008; Yuan và ctv, 2015) Đất mặn có áp suất thấm thấu cao nên cây không thé hút

được nước nếu không có cơ chế thích nghi, do đó gây nên hiện tượng hạn sinh lý Một

số ion ở nồng độ thấp không độc nhưng ở nồng độ cao lại gây độc Các ion nay lại

cạnh tranh với chất dinh dưỡng trong quá trình hút của rễ làm cho rễ khó hút chất dinh

dưỡng Thanh phần các muối trong đất mặn phổ biến là NaCl, NazSOa, Na2SOu,

NaxCO3, MgCh, MgSO¿, các muối đó nồng độ cao đều gây độc cho cây (Phạm Đình

Thái, 1987).

Ở vùng đất mặn, sự tích tụ của các ion Na" này trong các mô thực vật ức chế

quá trình quang hợp và tăng cường sự hình thành các loại oxy phản ứng (ROS) Những

chất nảy (ROS) có nhiều tác động xấu đến cây trồng như tăng tốc độ phản ứng độc hại,

có thé là đột biến DNA, phân hủy protein và tốn thương mang ( Islam và ctv, 2015;

Sudhrr và Murthy, 2004).

Hầu hết thực vật không thể sống sót khi nồng độ NaCl vượt quá 200 mM

(Flowers và ctv, 2008; Zhou và ctv, 2016) vì độ mặn cao ảnh hưởng đến vòng đời của

chúng như sự nảy mầm của hạt, hình thành cây con, sự phát triển sinh dưỡng va khảnăng sinh san cua hoa (Guo va ctv, 2018) Độc tính của ion còn ảnh hưởng theo chiều

hướng bat lợi đến nguyên sinh chất như làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm của nguyên

sinh chất tăng mạnh nhất là tang mạnh ngoại thâm làm cho tế bao mat chất dinh dưỡng

(Zhao và ctv, 2010; Feng và ctv, 2014).

Phytohormone là những phân tử tín hiệu tồn tại với nồng độ rất thấp (wg, ng) vađóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh trưởng, phát triển ở thực vật Đây là

một trong những đặc điểm đặc trưng của giới thực vật Tuy nhiên việc sản xuất

phytohormone hoặc những chất có cấu trúc tương tự như phytohormone cũng được tìmthấy trong đất và những sinh vật thuộc nhóm prokaryote tương tác với thực vật Nhiềunhóm vi khuẩn có khả năng kích thích sự tăng trưởng ở thực vật, trong đó có nhữngchứng minh dựa trên cơ sở khả năng sinh tổng hợp và tiết các chất điều hòa tăng

trưởng thực vật như auxin (indole — 3 — acetic acid, indole — 3 — pyruvic acid va indole

— 3 — butyric acid), gibberellins va cytokinin, axit phytohormone abscisic (ABA),

phytochrome B (PHYB), axit linolenic (18:3), peroxidase ascorbate (APX),

glutathione S — transferase (GST), protein sốc nhiệt (HSP), proline (Pro), glycine

betaine (GB), polyamine (PA), đóng vai trò quan trong trong quá trình thực vật thích

nghi với áp lực từ môi trường như độ mặn cao, khô han, nhiệt độ thấp hoặc vết thương

cơ học (He và ctv, 2018).

Cảm biến với sự xâm nhập natri là các phản ứng do sự căng thắng của muối gây

ra cho thực vật Thực vật cảm nhận được sự thay đổi về Na” bằng sự thay đổi của áp

suất thâm thấu (ASTT), hay sự ghi nhận bởi chất vận chuyên Protein mocal nhờ vào

khả năng phát hiện 1on hoá trị 1.

Sau chuỗi phản ứng ban đầu, lượng phytohormone thay đổi thông qua cả quátrình sinh tổng hợp và vận chuyển và mức độ biểu hiện gen được thay đổi theo cáchvừa phụ thuộc và độc lập từ phytohormones Cuối cùng, chuỗi tín hiệu do muối tạo radẫn đến các phản ứng thích ứng, chang hạn như điều chỉnh sự tăng trưởng và phát triển,vận chuyên ion va sản xuất các chất hòa tan tương thích dé bù dap cho những thiệt hai

do xâm nhập Na” gây ra (Hình 1.1) (Eva va ctv, 2020).

Xâm nhập mặn

Tiếp nhận [ Na* xâm nhập Bộ phận cảm biến nhận biết Na* )

Ỷ

Tín hiệu đầu tiên ( K*, Ca?*, pH, Phospholopids, ROS, protein kiniases ) +

Tin hiéu tiép theo Í Hormones thực vật, biểu hiện gen } k

te Reta unis Sự chuyển hoa:

Thay đổi sinh Cô lập, vô hiệu

Thích nghĩ trưởng, phát triển hoá ion chất.tan:tương

thích

[ Khả năng chống chịu và sống sót trong điều kiện hạn mặn J

Hình 1.1 So đồ khái quát co chế chống chịu mặn của thực vat (Eva va ctv, 2020)

1.5 Mối quan hệ giữa vi sinh vật và thực vật

Trong môi trường tự nhiên, hệ sinh thái thực vật phong phú cùng với sự đông

đảo và đa dạng vi sinh vật trong đất tạo thành một hệ thống có quan hệ mật thiết, gắn

bó với nhau Từ lâu, người ta đã nhận ra rằng một số vi sinh vật chẳng hạn như nắm,

8

xạ khuẩn hoặc vi khuan cộng sinh có định đạm, đóng vai trò quan trọng đối với năngsuất của cây bằng cách cải thiện dinh dưỡng khoáng Cho đến nay, những dòng vi sinhvật có liên quan đến thực vật và tiềm năng của chúng đối với nền nông nghiệp hiện đạichỉ mới bắt đầu được nghiên cứu gần đây (Richard và ctv, 2017).

Những vi khuẩn vùng sinh quyền sinh lợi cho cây trồng bằng cách cung cấp cácchất dinh đưỡng thiết yếu như nitơ, sản xuất các hormone thúc day tăng trưởng giúpcây phát triển và thậm chí ngăn chặn các mầm bệnh có hại có thé làm tổn thương câytrồng (Jakobsen K và ctv, 2018)

1.6 Vị sinh vật kích thích sinh trưởng ở thực vật (PGPM)

Vi sinh vật thuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật (PGPM) tham gia vào

quá trình trao đổi dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ

PGPM có thé được chia thành hai nhóm chính: vi khuẩn Rhizobacteria kích thích sinhtrưởng thực vật (PGPR) và nam kích thích sinh trưởng thực vật (PGPF) PGPR đượcKloepper và Schroth (1978) nghiên cứu đầu tiên dé mô tả vi khuẩn đất cư trú ở rễ cây

và theo cách tương hỗ giúp tăng cường sự phát triển của cây Nghiên cứu cho thấy

rằng ứng dụng rộng rãi của chúng trong hệ thống nông nghiệp đang nhận được niềm

tin của người trồng (Reddy và ctv, 2014) Các hoạt động của vi sinh vật như hòa tan

com — pound vô cơ, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất hữu cơ, và tiết ra các chất

có hoạt tính sinh học như phytohormone, chelators và kháng sinh giúp ích rất nhiều

trong việc tăng cường sự phát triển của cây trồng (Kapulnik và Okon, 2002)

Kích thích sinh truởng ở thực vật bằng việc sản sinh các enzyme như ACCdeaminase, các hormone thực vật như auxin, cytokinin và gibberellins Giúp cây trồnghap thu hiệu quả các ion sắt, kẽm và các nguyên tổ vi lượng khác nhờ khả năng kíchthích tăng bề mặt hap thu của rễ, tổng hợp các phân từ siderophores, hòa tan phosphate

và các chất khoáng khó tan khác (Kaymak, 2010)

Khả năng hoà tan phosphate

Lân hay phospho (P) là một trong những nguyên tố đa lượng cần thiết cho sựsinh trưởng và phát triển của sinh vật Trong đất chứa khối lượng lớn các hợp chất củaphospho (400 - 1.200 mg/kg dat), tuy nhiên lượng phospho dễ tiêu rất thấp, khoảng

lmg/kg hoặc ít hơn Các dang lân vô cơ trong đất ở dạng khó tan như Cas(POa)›,FePOa, AIPOx Do đó, với hàm lượng này thường không đáp ứng được nhu cầu củacây, nhất là những cây trồng có năng suất cao Hiệu suất sử dụng lân của cây trồngkhông quá 25% trong khi đó một lượng lớn bị cô định trong đất và chuyên thành dạng

khó hấp thu Tùy điều kiện pH của mỗi trường mà phospho có thé tồn tại ở dang ion

H;POx, HPO¿?, hoặc PO¿*, trong đó HaPO¿ va HPO* là dang dé hấp thu nhất (Beever

và Burns, 1980).

Alam và ctv (2002) cho rằng vi khuẩn có kha năng hòa tan phosphate hiệu quahon nấm Trong khi một số loài nắm chỉ hòa tan được 0,1 — 0,5% thì các vi khuẩn đất

có thé phân giải đến 1 — 50% lượng phosphate khó tan Những vi sinh vật (PGPR) có

khả năng hòa tan phosphate như Pseudomonas, Azospirillum, Rhizobium,

Burkholderia, Enterobacter, Azotobacter Các báo cáo cho thấy nhóm vi khuẩn này dé

dàng nuôi cấy trên môi trường nhân tạo Sử dụng những vi sinh vật hòa tan lân đem lại

hiệu quả cao ở những vùng đất thiếu lân, có thể làm tăng sản lượng lên 200 -500 kg/ha,tiết kiệm 30 - 50 kg superphosphate (Thakuria và ctv, 2004)

Sinh tong hợp auxin

IAA (indole — 3 — acetic acid) được xem như là phân từ auxin tự nhiên quan

trọng nhất, có chức năng điều hòa sự phát triển ở thực vật bao gồm quá trình phát sinh

cơ quan, kéo dan tế bào, phân chia, biệt hóa và điều hòa gen Ngoài ra, IAA còn liênquan đến cảm ứng hình thành rễ, ra hoa, quá trình tạo quả, điều hòa hàm lượng ABA

(acid abscisic) ở hoa và quả (Sahasrabuddhe va ctv, 2011).

Các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi khuẩn dat, vi khuẩn biểu sinh, vi khuẩnnội sinh và một số Cyanobacteria đã được phát triển là có khả năng sinh tổng hợp IAA

từ L — Tryptophan Trừ một số loải của các nhóm này như Pseudomonas vàGrobacterium tumefaciens có liên quan đến bệnh thực vật, còn lại thì kích thích sinh

hoa, phát triển thân, lá GA cũng liên quan đến sự tăng trưởng rễ, số lượng rễ tơ, điềuhòa sinh dưỡng và tái sinh chồi ngủ, ngăn sự lão hóa ở nhiều co quan của thực vật GA

còn được biết đến như là một thành phần của thụ quan tín hiệu ánh sáng liên quan đến

sự sinh trưởng và phân chia tế bào, kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dai của

thân, long Trong hơn 50 loại gibberellins được phát hiện thi GA (gibberellic acid) có

hoạt tính sinh học mạnh nhất (Blazquez và ctv, 1999) GA được phát hiện sớm nhấttrong dịch nuôi cay nam Fusarium moniliforme vào năm 1926 bởi Kurosawa

Nhóm vi khuẩn vùng sinh quyén và vi khuẩn nội sinh (PGPR)

Vi sinh vật thuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR) là vi khuẩn

trong đất kích thích sự phát triển của thực vật bằng nhiều cách khác nhau, thường là sự

tiếp hợp với rễ cây, đôi khi trên lá và hoặc trong các mô thực vat (Glick 2012) Một

lượng lớn PGPR bao gồm các loài Pseudomonas, Rhizobium, Azospirillum,

Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia,

Bacillus va Serratia đã được báo cáo dé tăng cường sự phát triển của thực vật(Beneduzi va ctv, 2012; Ahemad va Kibret, 2014) Những vi sinh vật này trực tiếp hỗtrợ trong một số quá trình cơ bản cần thiết cho sự phát triển của thực vật, tạo ra nitơtrong khí quyền (N) (Hirel và ctv, 2011), hòa tan photphat vô cơ (Sharma và ctv, 2013),

cô lập sắt (Fe) (Sayyed và ctv,2013), va tổng hợp phytohormone (Maheshwari va ctv,

2015) Tác động gián tiếp, khi tương tác với rễ cây thông qua rat nhiều cơ chế khác

nhau tạo ra tính kháng của cây chống lại các tác nhân gây bệnh cây Tác động trực tiếplên cây trồng như khả năng cố định nitơ, phân giải lân, sắt, sản sinh ra phytohormone,

enzyme 1 —aminocyclopropane — 1 — carboxylate (ACC), (Glick, 1995; Hayat va ctv, 2010).

PGPR có thé tác động đến sinh trưởng của thực vật bằng hai cơ chế trực tiếp vàgián tiếp hoạt động song song hoặc tuần tự (Glick và ctv, 1995) Kiểm soát mầm bệnh(do khả năng tái tạo các chất hydrogen cyanide, siderophores, kháng sinh, hoặc cạnhtranh cho các chất dinh dưỡng) Tăng khả năng hòa tan các chất dinh dưỡng (lân, kali),

cô định dam, sản xuất ra một số chất dinh dưỡng cho thực vật, cải thiện khả năng

chống chịu stress khô hạn, mặn, nhiễm độc kim loại cho cây trồng Sản xuất

phytohormones như axit indole — 3 — acetic ([AA).

sáng đến hồng đậm trên môi ttrường phân lập có bổ sung đó công-gô trong tế bảo có

những hạt poly — 8 — hydroxybutyrate hiện diện Theo bang phân loại cua Bergey thì

Azospirillum gồm 5 loài Azospirillum lipoferum, Azospirillum _ brasilense,

Azaspirillum irakense, Azospirillum halopraeferens va Azospirillum amzonense, Nhiét

độ phát triển tối ưu nằm trong khoảng 34°C — 37°C và một vài loài có thé phat triển tốt

ở pH=7, một số khác lại phát triển tốt trong điều kiện pH ở mức thấp hơn Chúng đều

có phản ứng oxydase dương tính Hầu hết chúng phát triển tốt trong môi trường có

chứa nguồn gốc carbonhydrate sau: malate, succinate, lactate và pyruvate, Ngoài khảnăng cố định nitơ chúng còn sản sinh ra các hormone ngoại tiết có khả năng điều hòa

sinh trưởng ở thực vật như: IAA, ILA, cytokinin, GA3 Bên cạnh đó, Holguin va Glick

(2001) đã chứng minh được loài A brasilense có thể biểu hiện gene ACC — deaminase,kích thích sự phát triển của cây cai dau và cà chua, ACC — deaminase là enzyme phâncách 1 — aminocyclopropan - tiền chat ethylene, giúp giảm hàm lượng ethylene ở thựcvật Theo Glick và ctv (1998), sự thay đổi nồng độ hormone ethylene ở cây trồng làmột cơ chế hữu hiệu kích thích thực vật tăng trưởng

1.7 Một sô nghiên cứu trong nước và ngoài nước về vi sinh vật tang chong chịu mặn của cây trông

1.7.1 Một so nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu của Nguyễn Khởi Nghĩa và ctv (2017) về phân lập và tuyển chọndòng vi khuẩn chịu mặn có khả năng hoa tan lân từ nền đất lúa trong mô hình canh táclúa — tôm tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Phân lập, tuyên chọn và địnhdanh vi khuẩn hòa tan lân tốt nhất từ 15 mẫu đất nhiễm mặn trong mô hình canh táclúa - tôm ở Bạc Liêu, Cà Mau, Sóc Trăng, Kiên Giang và Bến Tre trên môi trườngNBRIP chứa 1% NaCl Kết quả nghiên cứu cho thấy hai mươi trong tổng số 95 dòng

vi khuân phân lập thé hiện khả năng hòa tan lân rất cao (>1000 mg.L — 1 ) Dòng vi

12

khuẩn ký hiệu BL1 — 10 hòa tan lân cao nhất đạt 2044 mg.L — 1 sau 5 ngày thí nghiệm.Dòng vi khuẩn này hòa tan lân tốt ở nhiệt độ 40°C, dãy độ mặn từ 0,5 — 5% NaCl vàmức pH từ 3 — 5 Thuốc trừ bệnh cây trồng: DA roral, Topsin M và Antracol 70WPkhông anh hưởng đến mật số cũng như hoạt tính hòa tan lân của BL1 — 10 Cho thay

dòng vi khuẩn Burkholderia sp BL1 — 10 có tiềm năng ứng dụng làm phân bón sinh

học cho canh tác lúa trên nền đất nhiễm mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long

Năm 2018, một số cán bộ thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công NghệSinh Học, trường Đại học Cần Thơ đã tiến hành phân lập và nhận điện các dòng vi

khuẩn chịu mặn có khả năng có định đạm và tổng hợp IAA từ đất sản xuất lúa tôm Bạc

Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang Kết quả nghiên cứu cho thấy 116 dòng vi khuẩn chịu

man được phân lập trên môi trường Burk có bổ sung muối 10%o đều có khả năng tổnghop ammonium (NH4+) và tong hợp indole acetic acid (IAA) Trong đó, 2 dòng PL2

PL9 vừa có khả năng cố định đạm vừa có khả năng tổng hợp IAA cao: PL2 tổng hợp

NH4+ đạt 3,73 ug/ml, IAA đạt 45,31 ug/ml; dòng PL9 tổng hợp NH4” đạt 2,71 g/ml,

IAA đạt 46,46 ug/ml, Hai dòng vi khuẩn được nhận diện bằng phương pháp so sánhtrình tự vùng gen 16 rDNA, dòng PL2 được xác định tương đồng dong Bacillusmegaterium va dòng PL9 được xác định tương đồng dòng Bukholderia cenocepacia

Ngién cứu của Hoàng Kim Chi va ctv (2019) trên giống cây nghệ vàng(Curcuma longa L.) cũng cho ra kết quả khả quan về nhóm PGPR Qua sang lọc vànghiên cứu đã xác định được 3 chủng vi khuẩn có khả năng hòa tan phosphate vô cơ

và sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA) từ đất vùng rễ cây nghệ vàng (C

longa L.) tại Hưng Yên là Bacillus sp, PGP — V5, Enterobacter sp, PGP — V20 và

Bacillus sp PGP — V21 Ching vi khuẩn Bacillus sp V21 còn biểu hiện hoạt tính

kháng nam bệnh thực vat, vì vậy có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất các chếphẩm vi sinh kích thích sinh trưởng và bảo vệ thực vật

1.7.2 Một số nghiên cứu trên thế giới

Một số nghiên cứu khi cấy PGPR được phân lập từ cây chịu mặn vào cây trồng

đã thành công trong việc cải thiện sự tăng trưởng và khả năng chống chịu của câytrồngtrong điều kiện mặn (Shukla và ctv, 2012; Khan và ctv, 2016) Nghiên cứu của Ullah

và Bano (2015) cho thấy PGPR chịu mặn được phân lập từ vùng rễ của loài cây chịu

mặn Haloxylon salicornicum, Lespedeza bicolor, Atriplex leucoclada, Suaeda

fruticosa và Salicornica virginica cũng tăng cường sự phát triển cây ngô trong điều

kiện mặn, cây được chủng PGPR biểu hiện sự tích luỹ đường, proline và tăng hoạt tínhcủa enzym chống oxy hóa (ví dụ, SOD, peroxidase, CAT, và ascorbate peroxidase)

cao hơn so với những cây không được chủng Tương tự, một nghiên cứu của Siddikee

va ctv (2010) cho thấy rằng, sau khi chủng vào cây hat cải dầu với các đòng vi khuẩn

của cây chịu mặn, cây trồng biểu hiện sự tăng trưởng đáng kể, thể hiện bằng SỰ gia

tăng 35 — 43% trọng lượng khô và 29 — 47% tăng chiều dai rễ Các nghiên cứu chothấy rằng PGPR được phân lập từ thân rễ của các loài cây chịu mặn có thê được sửdụng làm chế phẩm sinh học hiệu quả cho các loại cây trồng sống khó khăn trong điều

kiện mặn.

Usha và Kanimozhi (2011) phân lập và khảo sát kha năng chịu mặn của vi

khuẩn Azospirillum từ vùng trồng lúa của quận Thajavur An Độ thu được các chủng

(Azo 3, Azo 8, Azo 10) có khả năng chiu mặn tới 700mM.

Mới đây nghiên cứu của Kearl va ctv (2019) về vi khuẩn được phân lập từ vùngsinh quyền và nội sinh rễ của ba loài cây chịu mặn ban địa ở Utah là Salicornia rubra,

Sarcocornia utahensis và Allenrolfea Occidentalis Sau khi phân lập đã được thử

nghiệm về khả năng chịu mặn tối đa và một số dong có thé phát triển tới nồng độ 4MNaCl Các vi khuẩn phố biến nhất được tìm thay trong đất hoặc môi trường khắc

nghiệt: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, (Œamma và

DeltaProteobacteria Cac dòng vi khuẩn phan lập đã được thử nghiệm kha năng kíchthích sự phát triển của cỏ linh lăng trong điều kiện mặn nhân tạo Khi chủng vào cây

cỏ linh lăng non, kích thích sự phát triển của cây với sự có mặt của 1% NaCl và đã ảnh

hưởng đáng kế sự phát triển của cây con

14

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn chịu mặn vùng trồng lúa khu vực ĐBSCL

Xác định khả năng chịu mặn tối da, khả năng phân giải lân và IAA của vi khuẩn

Đánh gia sự ảnh hưởng của vi khuân đên sự nảy mâm va sinh trưởng của giông

lúa trong điều kiện nhiễm mặn nhân tạo

2.2 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2023 đến 08/2023

Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh cây khoa Nông học trường Đại học Nông

Lâm TP.HCM.

2.3 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu đất trồng lúa từ vùng từng ngập mặn tại 2 tỉnh (Tiền Giang, Bến Tre)

thuộc ĐBSCL.

Hạt giống được sử dụng trong thí nghiệm là giỗng OM5451

Quy ước đặt tên mẫu: Mẫu được mã hóa theo địa điểm thu mau, cây thu mẫu, vị

trí thu mẫu và số thứ tự mau, cụ thé:

TGLDI(TG: Tiền Giang, L: lúa, D:đất, 1: mẫu số 1)

Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu và địa điểm thu mẫu

STT Kíihiệu Địa chỉ thu mẫu

1 TGLDI Xã Long Bình Điền, Huyện Chợ Gạo, Tỉnh Tiền Giang

2 TGLD2 Xã Tân Thành, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền Giang

3 TGLD3 Ấp Rach Bun, Xã Tân Điền, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền

Giang

4 TGLD4 Áp Trung, Xã Tân Điền, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền Giang

5 TGLRI Xã Long Bình Điền, Huyện Chợ Gạo, Tỉnh Tiền Giang

6 TGLR2 Xã Tân Thành, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền Giang

7 BTLDI Ấp Tân An, Xã Thạnh Phước, TT Bình Đại, Tỉnh Bến Tre

8 BTLD2 Ap 3, Xã Thạnh Phước, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre

9 BTLD3 Ápó, Xã Thanh Phước, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre

10 BTLD4 Ap 1, Xã Bình Thới, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre

II BTLRI Ap 3, Xã Thanh Phước, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre

Dung cu va thiét bi: dia petri (đường kính 80 mm), ống eppendorf, bình tamgiác, ống nghiệm có nắp, bộ micropipette (Nichiryo, Nhat), ống Falcon, thước do,dụng cụ cấy

Các thiết bị gồm: tủ cấy khử trùng (IIAC2 — 4E8, Esco, Singapore), nồi hấp khửtrùng (MC40L, ALP, Japan), cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện, kính hién vi(CX23, Olympus, Japan), máy lắc (SSLI, Stuart, Anh), Máy Nanovue Plus (Anh),Máy ly tâm Z130M (Hermle - Đức), Máy lắc Vortex - ZX3 (Velp, Ý)

2.3.2 Hóa chất

Môi trường được sử dụng dé nuôi cấy vi khuẩn là môi trường Luria Broth (LB)

Môi trường dùng để giữ nguồn vi khuẩn là Glycerol 40%, Pepton 1%

Môi trường phân giải lân là môi trường Pikovskaya

Môi trường tăng sinh IAA là môi trường LB có bổ sung L-Tryptophan

Môi trường NBRIP đặc

Dung dịch đệm phosphate (1X PBS)

16

Thuốc thử Van Urk Salkowski

Hóa chất nhuộm Gram: Crystal Violet, Lugol, Alcohol, Safranin

2.3.3 Thanh phan môi trường

Môi trường LB (Luria Broth): pepton 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10g, agar

20 g, nước cất 1000 ml

Môi trường long LB (Luria Bertani) bổ sung L — tryptophan: peptone — casein

10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, L — tryptophan 1 g, nước 1000 ml

Môi trường Pikovskaya Agar: Glucoza 10 g, Ca3(PO4)2 5 g, (NH4)2SO4 0,5 g,

KCI 0,5 g, MgSO 7H20 0,1 g, FeSO¿ (vết), MnSO¿ (vết), cao nam men 0,5 g, agar 20

g, nước cat 1000 ml (TCVN 6167:1996)

Dung dịch đệm phosphate (1X PBS): NaCl 8 g, KCI 0,2 g, Na;HPO¿ 1,42 g,

KH»PO, 0,24 g, nước cat 800ml

Thuốc thử Van Urk Salkowski: FeCl; 15 ml, HzSO¿ 98% 300 ml, nước cất 500

Mau được thu thập theo phương pháp của Kearl va ctv (2019) Cây được nhé

lên khỏi mặt đất và các mẫu đất bám trên rễ cây được thu thập vào một túi zip Cácmẫu đất khác nhau được đựng vào các túi zip khác nhau, và đánh dấu theo thứ tự A —B—C (A - nơi thu mẫu, B - loại cây thu mẫu, D — đất) Dùng găng tay mỗi lần thumẫu dé tránh nhiễm chéo giữa các mẫu Dat từ các khu vực không có cây cũng đượcthu thập để làm mẫu so sánh, đối chứng Các mẫu đất thu thập được đều được bảoquản ở 4°C cho đến khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

Đối với vi sinh vật ngoại sinh, mẫu đất thu về được dé khô tự nhiên ở điều kiệnnhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ Dùng 0,5 g đất hoà tan trong 1 ml dung dịch đệm

1X PBS.

Đối với vi sinh vật nội sinh, mẫu rễ được khử trùng bề mặt bằng cách rửa hailần trong nước cất vô trùng, một lần 10 phút trong 70% etanol và hai lần trong dung

dịch đệm 1X PBS vô trùng và đem nghiền nát trong 1X PBS

Phương pháp xác định pH và độ EC

Do pH va EC: Ray đất và hòa nhão 10 gam đất bang 50 ml nước cat dé lắng 1

giờ và đo độ pH bằng máy đo pH (SI Analytictv, Germany), đo EC bằng máy đo EC(SIv Analytictv, Germany) Nhúng kim đo vào mẫu nước đã lắng đất, trên thân máy sẽhiển thị chỉ số pH và EC

Trong tính toán lượng muối có trong đất với ý nghĩa là tổng lượng khoáng hòatan trong đất (bao gồm các cation Ca, Mg, K, Na, NH¿ và các anion Cl, NO3, SOu, COs)

vì tính phức tap va tốn kém của việc do các ion nên các nhà khoa hoc xác định độ mặn

từ phép đo độ dẫn điện (EC, Hệ số chuyển đổi từ EC sang (%o hoặc %), chính sựchuyền đổi này làm lệch giá trị thật của lượng muối trong đất vì quan hệ giữa EC vàchất tan không phải là quan hệ tuyến tính

Cách chuyền đổi của FAO (Food and Agriculture Organization) như sau:

1dS/m = 0,64 %o = 0,064%

mg/l =640*ECe (dS/m)

2.4.2 Phân lập vi khuẩn và xác định kha năng chịu mặn tối đa của các chủng vi

khuẩn phân lập được

Sau khi nghiền mẫu và thu được dịch, cấy trên đĩa môi trường canh thạch LBchứa IM( 6%) NaCl Cay chuyền nhiều lần dé thu được mẫu khuẩn lạc thuần Sau đókhuẩn lạc được cấy sang các dạng môi trường có tăng nồng độ NaCl 2M( 10%), 3M

(14%) để xác định khả năng chịu mặn tối đa của các chủng vi khuẩn phân lập được

Bảo quản chủng vi sinh vật bằng 2 phương pháp: giữ trong các ống thạch

nghiêng và giữ lạnh sâu trong glycerol.

Giữ trong ống thạch nghiêng: Chuẩn bị các ống chứa môi trường thạch nghiêng

Nutrien Agar 4% NaCl đã hấp khử trùng Cay mỗi chúng vi khuẩn đã chọn lọc vào 2ống nghiệm, bao quan ở nhiệt độ 3 — 5°C Thời gian bảo quản: 03 tháng

18

Giữ lạnh sâu trong glycerol: Chuan bị 100 ml glycerol 40%, eppendorf 1,5 ml

và dau tip 1000 ul (tat cả đã hấp khử trùng) Tăng sinh 24 giờ mỗi chúng trong 10 mlmôi trường Nutrien Agar 40 NaCl lỏng trong ông nghiệm Cho 500 pl glycerol 40% +

500 ul chủng tăng sinh vào eppendorf, mỗi chủng 5 eppendorf, bảo quản ở nhiệt độ —

80°C Thời gian bảo quản: 5 — 10 năm.

2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc thuần

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu hình màu sắc, hình dạng, mép

khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc và kích thước tế bào, trên cơ sở đó sơ bộ phân chia cácnhóm vi khuẩn dé tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình định danh

Quan sát sự phat triên và hình dạng của khuân sau 1 ngảy nuôi cây trên môi

trường LB nhằm ghi nhận hình dang, kích thước, màu sắc khuẩn lạc

Mô tả đặc điểm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram

Nguyên tắc: dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu của Crystal violet trên thành

tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn Vi khuẩn Gram đương có lớp tế bao dày tạp bởipeptidoglycan, nhờ đó màu tím của Crystal violet được gắn chắc vào tế bao (nhờ

iodine), nên không bị khử bởi cồn Do đó vẫn giữ được thuốc nhuộm ban dau Còn vikhuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bảo mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn), nhưng lại cónồng độ lipit cao, khi rửa bằng cồn chất béo này bị hoà tan kéo theo màu thuốc nhuộm

ban đầu Tế bào không màu lại bắt màu với màu hồng đỏ, còn vi khuẩn Gram đương

vẫn giữ màu xanh tím.

Phương pháp nhuộm Gram

Lấy một ít khuẩn lạc cho lên lam kính sạch (đã nhỏ nước cất, trải đều vi khuẩntrên lam kính), có định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn đèn cồn Nhuộm mẫu bằng dungdịch tím tinh thé (Crystal violet) trong 30 giây, rửa lại bằng nước Nhuộm tiếp bằngdung dịch lugol trong 30 giây, rửa lại bằng nước Rửa mẫu bằng cồn 900 trong khoảng

5 — 10 giây, sau đó rửa lại bằng nước Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Fuschin Zeihltrong 30 — 60 giây, rửa lại bằng nước Dé khô, quan sát sự bắt màu của vi khuân dướikính hiển vi ở vật kính có độ phóng dai 100 lần bằng giọt dau

Kết quả dy kiến: Nếu là vi khuan Gram dương sẽ bắt màu tím, nếu là Gram âm

sẽ bắt màu hồng Các thao tác thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng

2.4.4 Xác định khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn phân lập được

(TCVN 5865:2010).

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Complete randomizeddesign — CRD) một nhân tố với các nghiệm thức khác nhau, mỗi dia petri là mộtnghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm bước đầu khảo sát khả năngphân giải lân dựa trên 11 chủng vi khuẩn phân lập

vòng phân giải của các chủng vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi:

Ghi nhận kích thước vòng phân giải (mm) Do đường kính vòng phân giải D

(mm) va đo đường kính khuẩn lạc vi khuẩn d (mm) trung bình sau 3 ngày, 5 ngày, 7ngày Hoạt tính vòng phân giải được đánh giá bằng hiệu số D —d (mm)

2.4.5 Xác định khả năng tổng hợp 3 — indol — axetic (IAA) của chủng vi khuẩnphân lập bằng phương pháp Salkowski (Glickmann & Dessaux, 1995)

2.4.5.1 Phương pháp định tính kha năng tăng sinh IAA của các chủng vi khuẩn