Thông tin tài liệu
BO CONG THUONG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH Nin PHAM NGOC HUONG DINH DANH, NUOI TRONG VA DANH GIA HOAT TINH SINH HOC CUA NAM MOI DEN THU THAP TAI DAI NINH - LAM DONG Nganh: CONG NGHE SINH HOC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hề Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1.PGS TS Trịnh Ngọc Nam - - Chủ tịch Hội đồng 2.PGS TS Võ Thanh Sang : - Phản biện I TS Hồ Bảo Thuỳ Quyên .-2-©2s S252 - Phản biện TS Hồ Thiên Hoàng -5 e- - Ủy viên TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc Si) CHU TICH HOI DONG VIEN TRUONG VIEN CONG NGHE SINH HOC VA THUC PHAM _ BO CONG THUONG TRUONG DAI HQC CONG NGHIEP THÀNH PHÓ HỊ CHÍ MINH CONG HOA XA HOI CHU NGHIA VIET NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phạm Ngọc Hương MSHV: 20126161 Ngày, tháng, năm sinh: 09/01/1992 Nơi sinh: Campuchia Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 L TEN DE TAL Dinh danh, nudi đánh giá hoạt tính sinh học nắm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đằng NHIEM VU VA NOI DUNG: Nhiệm vụ: Định danh, nuôi trồng đánh giá hoạt tính sinh học nắm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng Nội dung nghiên cứu luận văn tốt nghiệp: “*, Dinh danh bang phwong pháp mơ tả hình thái kết hợp sinh học phân tử chúng nắm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng s* s* Nhân giếng nuôi trồng nấm mối đen tự nhiên thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng Phân tích hàm lượng số hợp chất polyphenol cao chiết qua thê nắm “ Dánh giá hoạt tính sinh học cao chiết: hoạt tính kháng oxi hóa khả phương pháp HPLC - DAD ức chế tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4T] s* So sánh kết với hai chủng nắm mối đen nuôi trồng thương mại Việt Nam nội dung nêu H NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo 2715/QĐ-ĐHCH ngày 30/11/2022 HI NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/5/2022 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thị Kim Anh Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 20 NGUOI HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO (Ho tén va chit ky) (Ho tén va chit ky) VIEN TRUONG VIEN CONG NGHE SINH HOC VA THUC PHAM (Ho tén va chit ky) LOI CAM ON Cảm ơn ba mẹ cho có sống thật ý nghĩa Sau q trình học tập nghiên cứu, tơi hoàn thành luận văn tốt nghiệp với dé tai “Định danh, ni trồng đánh giá hoạt tính sinh học nắm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng”, dự án tâm huyết nghiệp kê từ tốt nghiệp đại học bắt đầu với nghề nuôi trồng nắm Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Kim Anh, người Cô giáo đồng hành, định hướng, tận tâm bảo tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình thực dé tai Tơi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM, quý Thầy Cô Viện đào tạo Quốc tế sau đại học Viện Công nghệ Sinh học Thực Phẩm tạo điều kiện truyền đạt cho kiến thức q báu giúp tơi có thêm nhiều đam mê, định hướng khoa học hiểu biết sâu rộng lĩnh vực công tác minh Xin cảm ơn anh chị bạn bè Viện Công nghệ Sinh học Ứng dụng, đặc biệt bạn Lê Thanh Nhàn động viên, trợ nhiệt tinh suốt q trình để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Đồng cảm ơn anh chị đồng nghiệp, bạn lớp CHSH10B đồng hành khích lệ tơi suốt q trình học thạc sĩ Mặc đù luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót, góp ý q báu q Thầy Cơ động lực để tơi hồn thiện kiến thức nhiều TOM TAT LUAN VAN THAC Si Danh pháp khoa học nắm mối đen tự nhiên thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng hai chủng nắm mối đen nuôi trồng thương mại có nguồn gốc từ Trung Quốc Thái Lan xác định Hymenopellis raphanipes Ba chúng giếng nắm mối đen nhân giống nuôi trồng thành công giá thể mùn cưa cao su phối trộn voi 10% cam gao diéu kién nhiét d6 25-28°C Céng trình có thé cơng trình định danh xác tên lồi, phân tích hàm lượng polyphenol xác định hoạt tính sinh học nắm Hymenopellis raphanipes Việt Nam Trong nghiên cứu cao chiết ethanol nắm sấy thăng hoa từ ba chúng nấm mối đen sử dụng để khảo sát đặc tính kháng oxy hóa phương pháp bắt gốc tự DPPH khả gây độc tế bào mơ hình địng tế bào ung thư biểu mơ tuyến vú 4T1 Kết phân tích kháng oxy hóa cho thấy cá ba cao chiết khảo sát có khả loại bỏ gốc tự DPPH cao chiết TMI cho kết kháng oxy hóa cao với giá trị ICso= 3,088 + 0,088 mg/ml Dang thai ba loại cao chiết (Đại Ninh, TMI, TM2) cịn có khả gây độc tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4TI với giá trị lCzo 23,283 + 5,058 ug/ml, 16,975 + 5,791 ng/ml 19,727 + 1,360 ng/mI Nhìn chung, cao chiết từ chủng nấm mối đen thương mại TMI cho hiệu kháng oxi hóa gây độc tế bào ung thư tốt hai loại cao chiết lại điều kiện thí nghiệm il ABSTRACT The scientific name of the wild rooting shank harvested in Dai Ninh - Lam Dong and two commercial Chinese and Thailand mushroom strains were both identified as Hymenopellis raphanipes Three strains of rooting shank have been successfully cloned and cultivated on a substrate of rubber sawdust and 10% rice bran at a temperature of 25-28°C This might me the first work to explicitly identify the species, analyze polyphenol content, and establish the biological activity of Hymenopellis raphanipes in Vietnam In this study, ethanol extracts of freeze-dried fruiting bodies of three strains of rooting shank were used to investigate their antioxidant properties using the DPPH free- radical scavenging assay and their cytotoxic activity on the 4T1 mammary carcinoma cell line The results of the antioxidant analysis showed that all three extracts had the ability to scavenge DPPH radicals, with TM1 extract showing the highest antioxidant activity with an ICso value of 3.088 + 0.088 mg/ml In addition, the three extracts (Dai Ninh, TM1, TM2) also had the ability to kill 4T1 mammary carcinoma cells with ICso values of 23.283 + 5.058 ug/ml, 16.975 + 5.791 ug/ml and 19.727 + 1.360 ug/ml, respectively Overall, the extract from the commercial TM1 strain of rooting shank showed superior antioxidant and cytotoxic activity than the two remaining extracts under the same experimental conditions 1H LOI CAM DOAN Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp thạc sĩ “Định danh, ni trồng đánh giá hoạt tính sinh học nắm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng” cơng trình nghiên cứu thân tơi Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Học viên (Chữ ký) Phạm Ngọc Hương 1V 909909) .4‹.1+ i TOM TAT LUẬN VĂN THẠC SĨ 2222222 2222221221222122112212222222 xe ii ABSTRACT 222 2221222112211122112222122122112112122222erree iii LOI CAM DOAN MUC LUG ooececccccccssseessseessseessssessseesesesssieseseteseraserssetsietsnetsnstsastsnestseaseessseesasees DANH MỤC HÌNH ẢNH 2222 22222222212121221111121112111212222212222 xe vii DANH MỤC BẢNG BIỂU 222 222222221121112111111111112112112221222xe x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮTT -2-222222222222211221122112211221122112711221221222222 e0 xi MỞ ĐẦU .2222222222222212211221121112212112222222222222e Bo VA dS nh 2), Mure 6u nh6n cetu swcrsavsneereevenser son nnrornennweevennwarveusueesnrewerinnucerusenaunevenmacarerteacmrests Đối tượng phạm vi nghiên cứu . 22-222 222221221121212211211121111112112 xe Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu 22-222 2222221222122352221222222Xe Ý nghĩa thực tiễn để tài .- 25 221 2221222122122122222222 re CHUONG 1.1 TONG QUAN VE LINH VỰC NGHIÊN CỨU Tổng quan nắm mối đen .-2222222 22E2221222122112211221121112211111111 212.22 e 1.1.1 Vị trí phân loại phân bỐ -©22 222 22121112211211122112211211221 212 xe 1.1.2 Tỉnh hình ni trồng nắm mối đen -25222222 2222231223122112111211 222 22xe 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng hoạt tính sinh học - cc cS Series 1.1.3.1 Gia tri dimh du61ng oo I1ỪDỪDẶỪỦỒWE®" 1:1;3:2 Hoat tính kháng OXỈ HƠI nu seisetseiiieeteittitbeibeit SSEEERESEIIGREISEIHISHEINDSESEĐESĐ 11 1.1.3.3 Hoạt tính ức chế tế bào khối u 1.1.3.4 Một số hoạt tính khác .-:2: 22222212 2212221122211211121112112211 121 re 1.1.4 12 Các phương pháp phân loại nấm mối đen -222222222212221222122eC 17 Sự khác để tài cơng trình nghiên cứu khác 17 CHƯƠNG2 "` 2.1.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I9 a5 na 19 Chủng nấm .22222222221222122222221222222 2e 19 2.1.2 Hoa chat va mi o c.cccccccccecsessessvssessessesevsssecseseessessesevseeesvsssesenseneevseeeeneeveeceecs 2.1.3 Dòng tế bào nguyên bào sợi 2.2 — Dụng cụ - Thiếtbị 22222222221222122212222212222222 re 23 2.3 Phương pháp nghiÊn CỨU óc t2 21 HH HH nh rưệt 24 243.1 Định đanh mơ tâ hình thái kết hợp sinh học phân tứ mẫu nấm mối đen On nn HT TH HT TH TT TT TH HT HT HT 111kg 24 2:3.1;L Métahinh Kháis:sz:spreontiiittitiGEEDREETHHIEAERHEIHISHHSGELRRICRINRGSASAHBtSttttaset 24 2.3.1.2 Phương pháp tách chiết DNA, PCR xây dựng phát sinh lồi 25 2.3.2 Nhân giống ni trồng nắm mối đen .-2S22 2222212221221221221x2e 26 2.3.2.1 Nhân giống nắm môi trường PDA, meo hạt, meo que mì 26 2.3.2.2 Ni trồng thê nắm mối đen mùn cưa cao su -:-5¿ 27 2.3.3 Phương pháp chiết cao nam mối đen 2222 S22 22122212212212222.ee 27 2.3.4 Phân tích hàm lượng số hợp chất polyphenol có cao chiết qua thé TAM 28 2.3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết thể nắm 30 2.3.5.1 Hoạt tính kháng oxi hóa: khả bắt gốc tự đo DPPH - 30 2.3.5.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bao tế bào ung thư vú 4T1 tế bào đối chứng nguyên bảo sợi (fibroblasf) chat 31 B.3.S:3 Xu lUSÔ TẾ ggganngpnoidtttidiitiidtigDigiiSb1S010GG0801H0H8HSĐS10180101008000008 33 CHƯƠNG3 KET QUÁ NGHIÊN CỨU -c c2 22kg 34 3.1 Định đanh mơ tả hình thái kết hợp sinh học phân tử mẫu nắm mối đen LH HT HT TH TH TH TT TT TT TT TT TT TH TH HT Ho 34 3.1.1 Mơ tả hình thái cờ 3.1.2 Xây:dưng phátsinh lOÀ»z::z:eissssssbrssigebsstebloiittseitiittiastsatiteessal 40 34 3.2 Nhân giếng nuôi trồng nấm mối đen 22222222 2212221222122122.ee 4I 3.2.1 Nhân giếng nấm môi trường PDA, meo hạt, meo que mì 42 3.2.2 Ni trồng thể nắm mối đen mùn cưa cao su 44 343 Phân tích hàm lượng số hợp chất polyphenol có cao chiết thê ¡UP a4 30 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học 3.4.1 Kết kháng oxy hóa cao chiết nắm nghiên cứu . 33 ác St St Sn nh vi HH hư 53 CHUONG NGUYEN VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Ching nim Hinh 2.1 Hinh anh qua thé va vi tri thu thập nắm mối đen Đại Ninh Mẫu nắm thu thập vị trí tọa độ 11°32'30.25"N Ninh - Tỉnh Lâm Đồng 108°07'39.25"E thudc Dai Giống nắm sau lưu sưu tập giống nam va phòng tiêu bán Viện Công nghệ sinh học Ứng dụng Thời điểm thu giống nhiệt độ khoảng 25-28°C, thời tiết âm Hai chúng nắm thương mại TMI (xuất xứ Trung Quốc) TM2 (xuất xứ Thái Lan) nuôi trồng Việt Nam 2.1.2 Hóa chất e _ Hóa chất dùng cho phân tich hinh thai: Congo red, KOH 3%, Lacto phenol cotto blue va Melzer e «Ha chat dung k¥ thuat sinh hoc phan tt: CTAB, Phusion U Multiplex PCR Master Mix (Thermofisher, USA), enzyme ExoSAP-IT™ (Thermofisher, USA) 19 Bang 2.1 Thanh phan dung dich CTAB 2x STT Hoa chat ammonium Nông độ cuối Số lượng Cetyltrimethyl (CTAB) bromide | 2% Tris-HCl 1M (pH 8.0) 100mM EDTA 0,5M 20mM ml DTT 0.125% 0.25 g NaCl 5M 1.4M 13.36 g Nước cất vừa đủ (pH 8.0) 4g 20 ml 200 ml Bang 2.2 Thanh phan dung dich CIA STT | Hóa chất Chloroform Isoamyl alcohol Thể tích (ml) 192 20 Bang 2.3 Thanh phan sir dung phan tng PCR STT Thành phần Thể tích q1) Phusion U Multiplex PCR Master Mix: 6.25 ¢ Phusion U Hot Start DNA Polymerase * 2X reaction buffer °3 mM MgCle « 400 uM cia méi dATP, dTTP, dCTP va dGTP Nước (khơng có nuclease) 4.75 Mẫu DNA Mãi xuôi 10uM 0.25 Mỗi ngược 10uM 0.25 Thể tích tổng 12.5 Bảng 2.4 Mỗi sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử Tên gen ITS Tên Trình tự ITSI Mỗi xi 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’ ITS4 Mỗi ngược 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ 21 Bảng 2.5 Môi trường nhân giống nắm STT Môi Ký trường hiệu Thach Thành phần PDA | Khoai tay 200 g/l, D-glucose 20 g/l va agar 20 g/1 khoai tay Meo hat MH Meo que mi | MQ 1000g que mì, 20g cám bắp, 20g cám gạo Gia Mùn cưa ủ hoai, cám gạo 10% thé | GT 1000g thóc hạt, 20g cám bắp, 20g cám gạo mùn cưa Bảng 2.6 Dung mơi hóa chất sử đụng phân tích HPLC phịng thí nghiệm thuộc Viện Cơng nghệ sinh học Thực phẩm- IUH cung cấp STT Dung mơi — Hóa chất Phenolic acid chuẩn Rutin va quercetin Methanol Acid formic 22 Bảng 2.7 Dung mơi hóa chất sử đụng khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa khả gây độc tế bào cao chiết nắm mối đen STT | Dung mơi ~ Hóa chất 2.1.3 STT | Dung mơi - Hóa chất Methanol (CH30H) Trypsin EDTA DPPH PBS Tas Khang sinh Penicillin ‘immer 10 | Khang sinh Streptomycin DMEM (Dulbecco’s) 11 | Trypan blue niet 12 | Nước cất sulfasiũc] Bovine Serum) Dòng tế bào nguyên bào sợi Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4T1 nuôi cấy lưu trữ phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Trung tâm Nghiên cứu triển khai Khu Cơng nghệ cao Thành phế Hề Chí Minh Ngun bào sợi (fibroblast) hFP7 déng duge cung cấp Viện Sinh học nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Dụng cụ - Thiết bị e Dụng cụ: — _ Dụng cụ dùng định danh: lam kính, lamen, lưỡi lam, kim mũi mac, nhip, pipetteman, đầu tuýp, ống đong, tube, cốc thủy tỉnh, chai trung tính, bi phá mau, khay lạnh đo Viện Công nghệ Sinh học Ứng đụng cung cấp —_ Dụng cụ đùng nhân giếng nuôi trồng: Các dụng cụ Nông trại Ngọc Hương cung cấp 23 — Dung cu dung xác định hoạt tính: dụng cụ Viện Cơng nghệ sinh học Thực phẩm IUH cung cấp e Thiếtbi: — _ Thiết bị dùng định danh: Kính hiển vi soi (Optika, Ý), kính hiển vi huỳnh quang DIC BH2 (Olympus, Nhật Bản, máy ảnh D5000 (Nikon, Nhật Ban) (Benchmark), May nghién mau Bead Bug D1030-E D1008 (DALAB), bé ủ nhiệt khô HB120-S (DALAB), may spin down máy voxtex Genie G- 560 (Scientific industries), tu lanh 4m 20°C (Panasonic), may ly tâm lạnh Smart R17 (Hanil), may néng dé DNA NanoDrop One (Thermo Scientific), may luén nhiét TurboCycler Thermal Cycler (Blue-Ray Biotech, Dai Loan), bn dién di Mupid_exU (Takara Bio), bén dién di MSMIDIDUO (Cleaver), may doc gel (Maestrogen) số thiết bị khác Viện Công nghệ Sinh học Ứng dụng cung cấp —_ Thiết bị đùng nhân giống nuôi trồng: Tú cấy, nồi hấp số thiết bị nhà trồng nắm — Thiết bị dùng xác định hoạt tính: Viện Sinh học Thực phẩm IUH cung cấp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Định danh mơ tả hình thái kết hợp sinh học phân tử mẫu nấm đen 2.3.1.1 M6 ta hinh thai Hinh thai dai thé (mau sắc, kích thước, hình dạng cầu trúc) mô tả mẫu tươi Các đặc điểm (mũ nắm, cuống nắm, phiến nắm, bao gốc, thịt nam) duoc dac ghi nhận theo hướng dẫn Largent (1986) Singer (1986) [69, 70] Các đặc điểm vi thể (đảm, cystidia, bào tử, hệ sợi) phân tích mẫu khơ lưu trữ phịng thí nghiệm Để quan sát đặc điểm vi thể, lát cắt ngang (handle section) thực kính hiển vi soi nỗi (Optika, Y) duoc bu nude KOH 3% 24 nhuộm với dung dich Congo red Ảnh chụp vi thể thực với kính hiển vi DIC BH2 (Olympus, Nhat Ban) két néi may anh D5000 (Nikon, Nhat Ban) Bao tử nhuộm với Laecto phenol cotto blue va Melzer để xác định tính chất thành bào tử Các đặc điểm vi đo phần mềm Piximetre ver.5.I (Pháp) so sánh với mô tả Largent cộng (1981) [71] Các cấu trúc vi thể đo: bào tử (50 bào tử cho mẫu), đám cystidia (10 cho mẫu), hệ sợi (10 cho mẫu) Các đặc điểm giải phẫu so sánh với khóa phân loại Peterson Hughes (2010) để xác định loài [1] 2.3.1.2 Phương pháp tách chiết DNA, PCN xây dựng phát sinh loài Tách chiết DNA giải trình tự: DNA gene mẫu nắm tách chiết theo phương pháp CTAB (Doyle Doyle, 1987) từ hệ sợi tươi [72] Trình tự vùng ITS khuếch đại phản ứng PCR [73] với đặc hiệu ITS1 Và ITS4 Phusion U Multiplex PCR Master Mix (Thermofisher, SA) (bảng 2.3 2.4) Phản ứng PCR thực theo điều kiện: 98°C phút, 35 chu kì: 95°C 30 giây, 55°C 30 giây, 72°C | phút 72°C 10 phút máy luân nhiệt TurboCyeler Thermal Cycler (Blue-Ray Biotech, Đài Loan) Sản phâm PCR điện kiểm tra gel agarose 1,5% với dung dịch đệm TAE 0,5X, điện 100V 20 phút Sản phẩm PCR tinh enzym ExoSAP-ITTM (Thermofisher, USA) Sản phẩm sau tinh gửi giải trình tự Ist BASE (Malaysia) Phân tích phát sinh lồi: Kết giải trình tự hiệu chỉnh phần mềm ATGC ver.7 (Genetyx, Nhật Bản) so sánh với sở liệu Genebank céng cu BLAST Cac trinh tu ITS bao gồm nhóm ngoạ truy xuất từ Genebank (www.nebi.nlm.nih.gov/genbank/) để làm trình tự tham chiếu cho xây đựng phát sinh lồi Các trình tự ITS giếng cột AliView ver.1.26 [74] hiệu chỉnh tay Mơ hình tiến hóa đữ liệu ITS phát sinh loài xây dựng phương pháp Maximum Likelihood với bootstrap 1000 lần lặp lại mơ hình Kimura 2-parameter+G thực MEGA 25 ver.10.1.8 [75] 2.3.2 Nhân giống nuôi trằng nắm den Dựa vào điều kiện tối ưu cho nuôi nam Hymenopellis radicata nghiên cứu Hàn Quốc điều kiện tự nhiên thu mẫu kinh nghiệm trằng giếng mối đen từ Thái Lan Trung Quốc, tiến hành nuôi trồng giống mối đen thu thập Đại Ninh hai giống sản xuất thương mại môi trường dinh dưỡng điều kiện chăm sóc 2.3.2.1 Nhân giống nấm môi trường PDA, meo hạt, meo que mì Mơi trường PDA mơi trường tách giếng khiết kháo sát hệ sợi môi trường thạch nghiên cứu trước [16, 18] Môi trường hấp khử trùng 121°C, afm 15 phút Mánh tơ nắm phân lập từ thể nắm tươi (TMI TM2) cấy vào ống nghiệm thạch PDA, tiếp tục cấy chuyền chủng giống vào chai thủy tỉnh PDA Sau 10 ngày điều kiện ủ tối, nhiệt độ 22-25°C tơ lan gần kín mơi trường, tiến hành cấy chuyển sang môi trường meo hạt Môi trường meo hạt gồm: 1000g thóc hat, 20g cám bắp, 20g cám gạo Thóc nấu chín vừa nứt vỏ trộn với cám dinh đưỡng cho vào chai thủy tỉnh 500ml hấp khứ trùng 121°C, atm 50 phút (mỗi chúng giống chuẩn bị chai meo hạt) Để môi trường nguội cấy giống, ủ tơ điều kiện không cần ánh sáng nhiệt độ 22-25°C Sau tơ nấm lan đầy mơi trường meo hạt tiến hành cấy chuyển sang meo que mì (mỗi chủng giếng chuẩn bị 10 bịeh meo que mì, bịch gồm 4550 que mi) Que mi nguyên liệu phố biến sản xuất meo nắm, giúp việc cấy meo vảo phôi nâm tiện lợi Môi trường meo que mì gềm: 1000g que mì, 20g cám bắp, 20g cám gạo Que mi ngâm nước vôi 1% 24 giờ, sau vớt rửa trộn với cám dinh dưỡng cho vào bịch nilon chịu nhiệt hấp khử trùng 121°C, | atm 60 phit Đề nguội cấy giống, ủ tơ điều kiện không cần ánh sáng nhiệt độ 22-25°C Khoảng 20 ngày tơ lan đầy meo que mì tiến hành cấy vào phôi Việc cấy chuyển tơ nắm từ meo hạt sang meo que, sau cấy meo que vào bịch phôi sử dụng phố biến nghề nắm Việt Nam Q trình có thê giúp 26 enzyme to nam thích nghi phân húy chất từ cellulose tốt Hơn nữa, việc nhân giếng đơn giản tiện lợi sản xuẤt 2.3.2.2 Nuôi trồng thê nấm đen trÊn Hmùn cưa cao su Mùn cưa nguyên liệu lựa chọn để tiến hành nghiên cứu Mùn cưa cao su nguyên liệu đổi dao phục vụ cho sản xuất nắm ăn nắm liệu Việt Nam Mùn cưa để hoai tự nhiên 20 ngày xứ lý với nước vôi 1% ngày sau phối trộn với 10% cám gạo [18] pH nguyên liệu đạt 6-7 Tiến hành phân vào bịch nilong cho đạt khối lượng 1,3-1,4 kg, hap khử trùng nước nhiệt độ 95-100°C giờ, để nguội, cấy giống ủ tơ điều kiện không cần ánh sáng nhiệt độ 22-25°C Mỗi nghiệm thức thực với 250 bịch phơi Chăm sóc thu thê: Khi sợi nấm lan kín mơi trường giá thể, bịch phôi nấm cho nhà trồng nắm tiến hành phủ cát xử lý với nước vơi 1% ngày trước Điều kiện mơi trường nuôi trồng: pH nước tưới mức pH - 7, nhiệt độ phòng từ 25-28°C, sử dụng máy phun sương giai đoạn ni trồng hình thành thể tạo độ âm khơng khí 80-90%, ánh sáng khuếch tán khống từ 300 lux đến 400 lux, thống khí Quả thể nắm thu hái giai đoạn búp, sấy thăng hoa nhiệt độ âm (-25°C), bảo quân kín cho nghiên cứu 2.3.3 Phương pháp chiết cao nằm đen Trong thí nghiệm này, thực chiết cao nấm mối đen dung môi ethanol 96 độ nhằm tách chiết mốt số hợp chất hữu tan ethanol polyphenol (axit phenolic flavonoid) Một số loại nắm chiết cao dung môi ethanol 96 độ [76] Tiến hành cắt nhỏ 300g/mẫu nắm sấy thăng hoa (quá thé thu giai đoạn búp, chưa nở dù) chủng nấm nghiên cứu ngâm cồn 96 độ với tỉ lệ (1:10) nhiệt độ phòng theo phương pháp ngâm kiệt dé thu dịch chiết Sau ngày tiến hành lọc thu dịch chiết nắm mối đen Tiếp tục ngâm bã nắm lại cồn 96 độ với tỉ lệ (1:10) l tuần, thu dịch Lặp lại lần Toàn dịch chiết thu 27 due dem loc va c6 quay bang may c6 quay chan khéng IKA*RV10 dé loai bé dung môi thu cao chiết Cao chiết bảo quản 4°C để sử dụng cho thí nghiệm 2.3.4 Phân tích hàm lượng số hợp chất polyphenol có cao chiết thể nắm Gửi mẫu nấm chiết cao phân tích hàm lượng số polyphenol phịng thí nghiệm thuộc Viện Công nghệ Sinh học — Thực phẩm, trường Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh >_ Chuẩn bị chất chuẩn: Các chất chuẩn sử dụng đề định lượng hàm lượng polyphenol có cao chiết nấm khô thê bảng sau: Bảng 2.8 Các chất chuân sứ dụng để định lượng hàm lượng polyphenol có cao chiết nắm khơ Chit chudn/ cin chay HPLC Axit Axit Axit Axit gallic chlorogenic caffeic syringic Thuộc nhóm Axit Phenolic Axit ferulic Axit salicylic Rutin Quercetin Flavonoid Chất chuẩn chuẩn bị theo thang nồng độ từ 0,1 — ppm Cân 0,001 g chuẩn axit gallic, chuyén chất rắn vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch hỗn hợp methanol nước (50:50) điều chinh pH bang axit formic Thực tương tự hợp chất polyphenol chuẩn lại Thu dung dịch chuẩn gốc chất polyphenol với nồng độ 100 ppm Chuẩn làm việc chuẩn bị cách trộn chất polyphenol Hút chuẩn polyphenol 10 ml cho vào bình định mức 100 ml Định mức tới vạch hỗn hợp methanol nước (50:50) điều 28 chỉnh pH axit formie Thu hỗn hợp chuẩn có nồng độ 10 ppm Xây đựng dãy nông độ chuẩn từ chuẩn làm việc có nơng độ 10 ppm Hút 0,1; 0,25: 0,5: 1; 2.5; ml chuẩn làm việc cho vào bình định mức 10 ml định mức tới vạch hỗn hợp methanol nước (50:50) điều chỉnh pH axit formic Két qua thu dãy chuẩn có nơng độ 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5; ppm Các dung dịch tiến hành lọc đầu lọc 0,45 um, cho vao lo thuy tinh 1,5 ml Tién hanh phan tich bang phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) > Chuẩn bịmẫu: Cân I,0g mẫu cao chiết nắm hịa tan vào mÌ nước axit hóa đồng bề siêu âm 30 phút Dung dịch cao chiết nấm lọc đề loại bỏ hạt cặn Dung dịch mẫu chiết với cột sắc ký pha dao VertiSep GES C18 Cột GES hoạt hóa methanol nước Tiếp theo cho địch chiết mẫu nắm chuyển sang cột, lặp lại lần để đảm bảo giữ chất cần chiết nằm cột Rửa cột nước axitpH = 2.2 sau rửa cột nước cất đề loại bỏ thành phần khác Cuối rửa giải chất phân tích polyphenol methanol định mức lên 10 ml Các dịch chiết lọc đầu lọc 0,45 um, cho vao vail 1,5 ml Tién hanh phan tich phương pháp sic ky léng hiéu nang cao (HPLC) > Diédu kién sic ky HPLC: Các hợp chất polyphenol cao chiết nắm mối đen định lượng cách sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu cao bị Shimadzu LC-2030C 3D (Shimađzu, Nhật Bán) kết nối với diode-array detector (HPLC-DAD) Tất cá cao chiết pha loãng metanol, lọc qua màng 0,45 tim phân tích theo phương pháp mà Vu (2023) báo cáo trước [12] Tóm lại, chất phân tích phân tách cột sắc ký pha dao VertiSep™ GES C18 (250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5,0 n, Thái Lan) với pha động gồm mefanol (A) axit fomie/nước (pH= 2,2) (B) Chương trinh gradient cua pha động sau: 25% A phút, 25-40% A phút, giữ 40% A phút, 40-60% A phút, giữ 60% A phút tối thiêu, 60-80% A phút, giữ 80% A phút, 80%—85% A 29 phút giữ 80% phút, sau giảm xuống 25% A phút thứ 35 Axit phenolic flavonoid phát bước sóng 295 340 nm Tốc độ đòng chảy 0,8 ml/phút nhiệt độ cột cải đặt 40°C 2.3.5 2.3.5.1 Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết thể nắm Hoạt tính kháng oxi hóa: khả bắt gốc tự DPPH Kha nang bat gốc tự DPPH thực theo mô tả Yang cộng [77] Khả bắt gốc DPPH tính theo cơng thức: Ä S% = x 100 Trong đó: - 89: bắt gốc DPPH - A: giá trị mật độ quang dung địch đối chứng - AI: giá trị mật độ quang dung dịch cao chiết a Chuẩn bị thuốc thử mẫu Dung dịch DPPH: Pha DPPH cách cân 0,002g DPPH, định mức lên 100ml với methanol 80% Dung dịch sau pha bảo quản tối Mẫu cao chiết nắm mối đen hòa tan với methanol để đạt dãy nông độ sau: Dai Ninh: mg/ml; 3,0 mg/ml; 4,0 mg/ml; 5,0 mg/ml; 6,0 mg/ml; 7,0 mg/ml TM1: mg/ml; 0,5 mg/ml; 1,0 mg/ml; 1,5 mg/ml; 2.0 mg/ml; 2,5 mg/ml; 3,0 mg/ml, 4,0 mg/ml TM2: mg/ml; 1,0 mg/ml; 2,0 mg/ml; 3,0 mg/ml; 4,0 mg/ml; 5,0 mg/ml Đối chứng dương sử dụng axit ascorbic pha voi day ning dé mg/ml, 0,005 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,015 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,025 mg/ml b Tiến hành thử nghiệm 30 Cac eppendorf duge boc kin dé tránh ánh sáng Hỗn hợp phản ứng tích 2000p g6m: 1000 ul DPPH da pha va 1000 pl dung dich cao chiét đung dịch chất đối chứng chuẩn bi U 30 phút tối nhiệt độ phòng, sau hỗn hợp đo mật độ quang bước sóng 517 nm Mỗi mẫu thứ thực lần lặp lại Kết hoạt tính kháng oxy hóa loại cao chiết chất đối chứng biểu diễn giá trị ICs 2.3.5.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào tễ bào ung thư vú 4T1 tế bào đối chứng nguyên bào soi (fibroblast) a Chuẩn bị mẫu thử Tất dung dịch thao tác eppenđorf 1,5ml có bọc giấy bạc.Chuẩn bị dung dịch chứa cao chiết từ ba chủng nắm mối đen nghiên cứu để thử hoạt tính tế bào, ba loại cao chiết pha DMSO dé dat duoc day nông độ 2000, 1000, 500, 250, 125 ng/ml với nồng độ DMSO cế định Hút 25n1 dịch từ dãy nồng độ chuẩn bị vào 225Hl DMEM, ta có mơi trường nuôi cấy tế bào chứa hoạt chất voi day néng dé 1a 200 ug/ml, 100 pg/ml, 50 ug/ml, 25 ng/ml, 12,5 pg/ml với nồng độ DMSO cố định 1a 0,1% b Nuôi cấy tế bào Tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4T1 nguyên bào sợi (fibroblast) hFP7 dịng ni cấy mơi trường DMEM bồ sung 10% FBS 1% kháng sinh (penicillin, streptomycin 1X) nhiệt độ 379C, 5% CO2 [78] c Thử hoạt tính hoạt chất tế bào Tế bảo sau đạt mật độ bám trải đến 80% tách khỏi bề mặt nuôi cay Trypsin-EDTA 0,25% Sau đó, cho 100 pl dich té bào mật độ 10 tế bao/ml méi trường nuôi cấy DMEM + 10% FBS + 1% kháng sinh phân phối vào giếng đĩa 96 giếng Sau 24h nuôi cấy, bố sung cao chiét ethanol từ ba chủng nắm nghiên cứu vào giếng có sẵn tế bào Thêm vào giếng 25 ul cao chiết ba loại gồm Đại Ninh, 31 TMI, TM2 pha thành day néng dé ug/ml, 12,5 pg/ml, 25 ug/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml va 200 pg/ml 0,1% DMSO Té bao duoe dat ti nudi cdy nhiệt độ 37°C, 5% CO2 Sau ngày nuôi cấy, tiến hành tách tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy, thu tế bào đếm tế bào Thí nghiệm gồm nghiệm thức bao gồm nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức lặp lại lần Bảng 2.9 Các nghiệm thức khảo sát hoạt tính gây độc tế bào (mỗi tượng trưng cho giếng) Ae x Te bao nà Fibroblast Cao x chiết A Nong (ug/ml) Ninh Dai 200 | 100 | 50 | 25 | 12,5 | | 0,1%0 DMSO TMI TM2 200 | 100 | 50 | 25 | 125 | 200 | 100 | 50 | 25 | 125 | NÊN 200 | 100 | 50 | 25 | 12,5 | © | 0,1% DMSO (ai TM2 200 | 100 | 50 | 25 | 125 | | 01%DMSO 200 | 100 | 50 | 25 | 12,5 | | 0,1% DMSO 32 | 01%⁄DMSO | 0I%DMSO d Đếm tế bào phương pháp nhuộm với Trypan blue Nhuộm dịch tế bào với trypan blue theo tý lệ 1:1, tiến hành đếm tế bào buồng đếm hồng cầu kính hiển vi Tế bào sống xác định tế bào to, tròn đều, sáng, đếm tế bào sống ô lớn, số lượng té bao/ml dung dich ban đầu tính theo cơng thức A=“x10!xN Trong đó: A: mat dé té bao/ml A5: tổng số tế bào đếm N: tỷ lệ pha lỗng với Trypan Blue 2.3.5.3 Xử1ísố liệu Sử dụng phần mém Microsoft Excel để xử lý sé liệu xây dựng phương trình đường tuyến tính nồng độ mẫu thứ hoạt tính kháng oxy hóa Giá trị ICso đỗ thị xác định vẽ dựa phan mém GraphPad Prism Két qua tính từ trung bình lần lặp lại, thể theo đạng trung trình + SD Kiểm tra khác biệt nghiệm thức phân tích ANOVA LSD phần mềm Statgraphics16 33
Ngày đăng: 13/12/2023, 23:08
Xem thêm:
