Nghiên cứu thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của dịch thủy phân từ hàu và vẹm xanh được nuôi tại xã long sơn, tỉnh bà rịa vũng tàu

BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỖ CHÍ MINH Nin PHAN THỊ HỒNG ANH NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH THUY PHAN TU HAU VA VEM XANH DUOC NUOI TAI XA LONG SON, TINH BÀ RỊA — VUNG TAU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHĨ HỖ CHI MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hề Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Huyền Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 04 tháng 10 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1.PGS TS Trịnh Ngọc Nam — Chủ tịch Hội đồng 2.PGS TS Võ Thanh Sang — Phản bién TS Hồ Bảo Thùy Quyên — Phản biện TS Hồ Thiên Hoàng — Ủy viên TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh — Thư ký CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG VIEN TRUONG VIEN CÔNG NGHỆ SINH HOC VA THUC PHAM PGS TS Trinh Ngoc Nam TS Nguyén Ba Thanh BO CONG THUGNG TRUONG DAI HOC CONG NGHIEP THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH CONG HOA XA HOI CHU NGHIA VIET NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phan Thị Hoàng Anh MSHV: 20125741 Ngày, tháng, năm sinh: 23/04/1996 Nơi sinh: TP Đà Nẵng Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐÈ TÀI: Nghiên cứu thu nhận đánh giá hoạt tính sinh học dịch thủy phân từ hàu vẹm xanh nuôi xã Long Sơn, tỉnh Bà Rịa — Vũng Tàu NHIEM VỤ VA NOI DUNG: - _ Khảo sát điều kiện thủy phân bột thịt hau va vem xanh bing enzyme protease - Thu nhận, khảo sát so sánh hoạt tính sinh học sản phẩm thủy phân từ hàu vẹm xanh - _ xác định trình tự peptit dịch thủy phân từ hàu vẹm xanh - _ Đánh giá khả tương tác peptit thủy phan va ACE Đánh giá hoạt tính sinh học mẫu bột thủy phân từ hàu vẹm xanh sau sấy phun II NGAY GIAO NHIEM VU: 30/11/2022 Il NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 30/05/2023 IV NGUOI HUONG DAN KHOA HOC: TS Tran Thi Huyén Tp H6 Chi Minh, thang nam 20 NGUOI HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO TS Tran Thi Huyén TS Nguyén Thi Kim Anh VIEN TRUONG VIEN CONG NGHE SINH HOC VA THUC PHAM TS Nguyén Ba Thanh LOI CAM ON Trong thời gian học tập trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, em quan tâm hỗ trợ nhiều từ Thầy Cô bạn bè Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tạo điều kiện cho chúng em có mơi trường học tập nghiên cứu tốt khoáng thời gian học thực luận văn tết nghiệp trường Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Trần Thị Huyền tận tình hướng dẫn em suốt thời gian học thực luận văn thạc sĩ Những kinh nghiệm kiến thức mà cô chia sẻ học quý giá vô cần thiết cho thân em không mà cịn hành trình nghiên cứu sâu tương lai Tiếp theo em xin cảm ơn TS Đặng Thùy Tiên (Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng) hỗ trợ tận tình trình chạy máy LC-MS/MS Đồng thời, em cảm ơn TS Nguyễn Ngọc Tuấn với thầy cô giảng viên môn Công nghệ Sinh học tận tinh giúp đỡ, cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm khoảng thời gian học trường Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn động viên giúp đỡ gia đình, bạn bè trình học tập thực dé tai luận văn Do thời gian thực luận văn có giới hạn thiếu kinh nghiệm nên không tránh sai sót Em mong nhận ý kiến đóng góp q thầy đê để tài hoàn thiện Một lần em xin chân thành cảm ơn! TOM TAT LUAN VAN THAC Si Sản phẩm thủy phân từ hàu vẹm xanh xác định chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu thu nhận đánh giá sản phâm thủy phân từ hai đối tượng Vì vậy, chon hàu vẹm xanh nuôi Long Sơn, tỉnh Bà Rịa — Vũng Tàu để thực nghiên cứu thu nhận đánh giá hoạt tính sinh học từ sản phẩm thủy phân hai loài enzyme protease Nghiên cứu xác định điều kiện thúy phân phù hợp pH 7.0, tỷ lệ E/S 8% 360 phút hàu pH 7,0, tỷ lệ E/S 4% 480 phút vẹm xanh Sản phâm thủy phân từ hàu có khả thu gom gốc tu DPPH va ABTS (lan lượt 87,40 + 0,84% 72,25 + 1,31%); kết đánh giá lực khử cho độ hấp thụ cao 1,049 + 0,01 bước sóng 700 nm Tương tự, sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh có khả thu gom gốc tự DPPH ABTS (lần lượt 88,43 + 0,96% 81,106 + 0,22%); kết đánh giá lực khử cho độ hap thụ cao 1,698 + 0,02 bước sóng 700 nm Từ cho thấy, sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh có hoạt tính kháng oxy hóa cao so với sản phẩm thủy phân từ hàu Ngược lại, sản phẩm thủy phân từ hàu lại có khả ức chế ACE (65,89 + 2,40%) cao so với sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh (64,038 + 2,69%) Dịch thúy phân từ hai lồi khơng thể khả kháng khuẩn Bốn trình tự peptit xác định dịch thủy phân hàu TEAPLNPK, AVDNGTER, ILAPPERKY, HAPPER ba trình ty peptit dịch thủy phân vẹm xanh TEAPLNPK, GPSIVHR ILAPPERK Các trình tự chứa hàm lượng axit amin ky nước cao, điều ánh hưởng đáng hoạt tính kháng oxy hóa ức chế ACE sản phẩm thủy phân Phương pháp docking phân tử cho thấy khả tương tác đễ dàng peptit với ACE tạo phức hợp ôn định Kết dé tai cung cấp nguồn liệu tiềm năng, ứng dụng vào nghiên cứu sau để sản xuất peptit mang hoạt tính kháng oxy hóa hay ức chế ACE thu nhận từ trình thủy phân hau vẹm xanh Việt Nam il ABSTRACT Despite the abundance of bioactive compounds in the hydrolysis products derived from oysters and green mussels, their comprehensive investigation in Vietnam remains limited Therefore, we selected oysters and green mussels cultivated in Long Son, Ba Ria - Vung Tau province, to evaluate their hydrolysis products using the protease enzyme The study determined the suitable hydrolysis conditions to be pH 7.0, E/S ratio of 8% for 360 minutes for oysters, and pH 7,0, E/S ratio of 4% for 480 minutes for green mussels The hydrolysates derived from oysters exhibit the capacity to scavenge DPPH and ABTS free radicals at 87.40 + 0.84% and 72.25 + 1.31%, respectively; with the highest measured reducing power at an absorbance of 1.049 + 0.01 at 700 nm Similarly, hydrolysates from green mussels demonstrated the ability to scavenge DPPH and ABTS free radicals at 88.43 + 0.96% and 81.106 + 0.22%, respectively; with the highest measured reducing power at an absorbance of 1.698 + 0.02 at 700 nm Therefore, it can be concluded that hydrolysates from green mussels exhibit a higher antioxidant activity compared to those derived from Conversely, the hydrolysis products from oysters showed higher ACE oysters inhibitory activity (65,89 + 2,40%) than those from green mussels (64,038 + 2,69%) The hydrolysis products from both species did not exhibit antibacterial activity Analysis of the hydrolyzate TEAPLNPK, from green from AVDNGTFR, mussels can oysters identified ITAPPERKY, only analyze four peptide and IIAPPER three peptide sequences, Meanwhile, sequences: namely hydrolyzate TEAPLNPK, GPSIVHR, and ITAPPERK These sequences all contained a high hydrophobic amino acid content, significantly influencing the hydrolysis products' antioxidant and ACE inhibitory activities Molecular docking analysis revealed the potential interactions between the peptides and ACE, forming stable complexes The results of this study will provide potential data for future research and application in the production of antioxidant and ACE inhibitory peptides derived from the hydrolysis of oysters and green mussels in Vietnam 1H LOI CAM DOAN Tôi xin cam đoan để tải “Nghiên cứu thu nhận đánh giá hoạt tính sinh học dịch thủy phân từ hàu vẹm xanh nuôi xã Long Sơn, tỉnh Bà Rịa —- Vũng Tàu” đề tài nghiên cứu TS Trần Thị Huyền giảng viên hướng dẫn Các kết số liệu có dé tai trung thực, khơng có chép chưa cơng bồ cơng trình nghiên cứu khác Những thông tin hỗ trợ xây dựng sở lý luận cho dé tài trích dẫn đầy đủ ghi rõ nguồn gốc Nếu có sai phạm, tơi sẵn sang chịu hồn tồn trách nhiệm chịu hình thức kỷ luật mơn nhà trường Học viên Phan Thị Hoàng Anh 1V MUC LUC 08906 922227 -::1aa v INSNEEMUE BÌNHUẤ NI nnounnnonpbntsniDnttSEISGSIHIGERGRASHGSDDIDIGBIMGERNEISGGĐ1G88 viii DANH MỤC BÁNG BIỂU -55552::22222211 11.222 rirriee ix 9I28)00/940A32i30á.6000 x MÔ ĐẦH co nossnnueninsibinntrigdsddbiiiiis9iSGGDIĐ1BS001G0001001004G91180130030101002G9188 1 Đặt vấn đề HH n2 hà VN i0 nêu Đối tượng phạm vi nghiên cứu -©-2-2222222222222212221211122112111212 22 22 e Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu -2-©22222222222221222122112111 22.222 Ý nghĩa thực tiễn để tài -2222222 221222122112221211222222222 re CHƯƠNGI TỎNG QUAN 2L 22 221k 1.1 Tổng quan hàu, vẹm xanh l[,J Khi quái chUNÐ srsssessrosssoiirDitoiiltiBDHDEEUHIOHEEEIHGIRENHOHEENUEEMRSUAEH 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng số công dụng -522-222222222221222222222Xe 1.13 Tình hình nuôi trồng Việt Nam -22 2222222221122112211211221222 xe § 1.2 Tổng quan peptif 1.2.1 Giới thiệu peptit . -222222122212221222222212222 xe 10 1.2.2 Các hoạt tính sinh học peptI( che re 10 143 Tình hình nghiên cứu 1.3.1 Tỉnh hình nghiên cứu nƯỚC ác nhe 12 1.3.2 Tỉnh hình nghiên cứu hƯỚC ác ch khe 14 CHƯƠNG2 a) 2-22 22s222122212112111211121111112111211222212222 xe 10 c tn 2x HH HH HH re 12 CƠ SỞ LÝ THUYÊT -5552cccccctEEErrrrrrrrrree l6 2.1 Noguy6n LQ oo 16 2.2 Hóa chất, thiết bị UỤN €Ụ s:setitxc h9 t82S2ESDDOIDSEIIRHSERIRIUISEBDSSBtitetl 16 Mon l6 2.2.2 Hoa chat 17 223: DUNG Uso 18 2.3 Phương pháp nghiÊn tu oo ecececeeceececeeseeeeeeeeeeeeeeeeeeeeersareereeeneeeareeenreates 18 2.3.1 Phương pháp chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng thủy phân 2.3.2 Phương pháp thủy phân profease -2222222222 2221222222 xe 2.3.3 Phương pháp xác định tổng hàm lượng protein -2-222 22s Sz 22x cszev 21 2.3.4 Phuong phap xác định hoạt tính khang oxy h6a 2.3.5 Phuong phap xéc dinh hoat tinh khang khuatn 0.00.0 S222 23 2.3.6 Phương pháp xác định hoat tinh tre ché Angiotensin I converting enzyme 23 2.3.7 Phương pháp xác định trình tự peptit sắc ký lỏng khối phê 24 2.3.8 Phương pháp docking phân tử àcc cS Set 25 2.3.9 Phương pháp sấy phun S222 2222221221221211211212222 re 25 2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 2-©222221221221221222122121122212112 22 xe 25 CHUONG3 eee eeeeeeereeeeeeerettees 21 KET QUA NGHIÊN CỨU . k2 SE 1121p etrrre 26 3.1 Khảo sát điều kiện thủy phân bột hàu vẹm xanh enzyme protease26 3.1.1 Tỷ lệenzyme/cơ chất (E/8) -222 22222212221222122122212222122 e6 26 SN no 3:8 Đổ Deseennunnntrsrtttttottittleitilttgttqt@USEGHUEHIHRUSNHUNGrữominaruaem 27 0 ếăẳăảijä5ÃiäẢ3Ă 26 3.1.4 _ Hiệu suất thủy phân . S22222222122212271222112212221222222 e6 28 3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa nh HH HH HH tre 29 3.2.1 Hoạttính thu gom gốc tự DPPH 222222222212221222122212221222.ee 29 3.22 Hoạttính thu gom gốc tự ABTS 3.2.3 i5 343 Hoạt tính kháng khuẩn .-222222 221222122212112211211122112111121211 2122 xe 32 34 ead tihh te ch! ACE commen 3.5 Xác định trình tự peptit phương pháp sắc ký lỏng khéi phé 35 3.6 P.2 J3 80 34 Kết sấy phun . ©-2222 222222122211221122122112212211221212222 re 43 ¡0ì d5 33 38 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ . ./¿5:cc222221 t2 1e 45 Kết luận .- QC 0112201111121 111151111 ng 1k1 ng kg kg kk ng kg kg kg kg k ke gề 45 Kiến nghị .- 22 222 222122212221222122212221222122121222122122212222221221222 re 46 DANH MỤC CƠNG TRÌNH Đà CƠNG BĨ CỦA HỌC VIÊN 47 vi TÀI LIỆU THAM KHẢO -: PHỤ LỤC c 5c tt 22221112 EErrtrrree LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN Vii 200 250 e 3 Dich thiy phan vem ANOVA Table Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Method: 95.0 Nong 20 40 60 80 100 e_ 86.0167 90.5433 x x for VEM_ TP DPPH by D.Nong Sum of Squares|Df \Mean Square \F-Ratio |16614.7 3_ J3322.95 3395.42 |11.7439 12 |0.978656 16626.5 17 Tests for VEM_TP_DPPH by D.Nong percent LSD Count ‘ean 0.0 30.1267 50.3633 omogeneous Groups 65.66 81.0133 88.4267 Bột thủy phân vem xanh sấy phun ANOVA Table for VEM SP DPPH P-Value 0.0000 xX xX xX xX xX xX by D.Nong Source Sum of Squares|Df \Mean Square \F-Ratio P-Value Between groups |19803.9 [3960.77 1321.30 0.0000 Within groups |35.9717 12 |2.99764 Total (Corr.) 19839.8 17 Multiple Range Tests for VEM SP_DPPH by D.Nong Method: 95.0 percent LSD J.Nong đo Count Mean Homogeneous Groups 0.0 x 50 40.3067 x 100 67.8933 X 150 83.8233 x 90.3767 x 200 250 93.1867 x PL35.2 Hoạt tính thu gom géc tu ABTS e Dich thiy phan hau ANOVA Table for HAU TP ABTS by D.Nong Source Sum of Squares|Df Between groups |9791.64 Within groups _|9.76713 12 Total(Com.) |9801.441 17 \Mean Square \F-Ratio {1958.33 2406.02 |0.813928 59 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for HAU_TP_ABTS by D.Nong Method: 95.0 percent LSD Nong 20 40 60 80 100 e Count can 0.0 31.5867 41.9333 omogeneous Groups x x x x x x 51.5067 61.8567 72.2533 Bét thay phan hàu sấy phun ANOVA Table for HAU Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Method: 95.0 Nong SP ABTS by D.Nong Sum of Squares|Df_ |Mean Square |\F-Ratio |13361.5 [2672.3 858.18 [37.3671 12 [3.11393 13398.9 17 Tests for HAU_SP_ABTS by D.Nong percent LSD Count ‘ean 0.0 34.2133 20 40 60 80 100 omogeneous Groups x x x x x x 51.7367 64.8533 72.7367 81.1067 e P-Value 0.0000 Dich thiy phan vem xanh ANOVA Table for VEM TP ABTS by D.Nong Source Sum of Squares|Df \Mean Square \F-Ratio P-Value Between groups |13346.9 [2669.38 8204.21 0.0000 Within groups _|3.9044 12 |0.325367 Total (Corr.) 13350.8 17 Multiple Range Tests for VEM TP_ABTS by D.Nong Method: 95.0 percent LSD D.Nong Count Mean Homogeneous Groups 0.0 x 50 41.62 x 100 55.2833 x 150 65.4033 x 200 74.3967 x 82.9 x 250 e_ Bột thủy phân vem xanh sấy phun 60 ANOVA Table for VEM Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Method: 95.0 Nong SP ABTS by D.Nong Sum of Squares|Df_ |Mean Square \F-Ratio }|11045.4 [2209.07 420.34 {63.066 12 {5.2555 11108.4 17 Tests for VEM SP_ABTS by D.Nong percent LSD Count 50 100 150 200 250 ‘ean 0.0 35.0367 45.6 57.7833 65.3067 76.61 P-Value 0.0000 omogeneous Groups x x x x x x PL5.3 Năng lực khử e Dich thiy phan hau ANOVA Table for HAU RP by E.NONG DO Source Sum of Squares|Df_ |Mean Square \F-Ratio P-Value Between groups | 1.91338 [0.382676 918.79 0.0000 Within groups {0.004998 12 |0.0004165 Total (Corr.) 1.91838 17 Multiple Range Tests for HAU_ RP by E.LNONG DO Method: 95.0 percent LSD iE NONG DO Count Mean Homogeneous Groups 0.104 x 50 0.302333 x 100 0.466 x 150 0.661333 x 0.881333 x 200 250 1.053 x e Dich thiy phan vem xanh ANOVA Table for VEM_RP by E.NONG DO Source Sum of Squares|Df \Mean Square \F-Ratio P-Value Between groups |5.56294 {1.11259 0.0000 Within groups 12 |0.000749556 Total (Corr.) |0.00899467 |5.57194 17 1484.33 Multiple Range Tests for VEM_ RP by E.NONG DO Method: 95.0 percent LSD 61 .NONG DO can 50 100 150 200 250 omogeneous Groups 0.06 0.489333 0.866 1.16733 1.44167 1.69433 x x x x x x PL5.4 Hoạt tính ức chế ACE e Dich thiy phan hau ANOVA Table for HAU_ACE Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Method: 95.0 Nong by D.Nong Sum of Squares|Df_ |9662.18 |47.5777 12 |9709.76 17 Tests for HAU_ACE percent LSD Count can |Mean Square \F-Ratio {1932.44 487.40 |3.96481 by D.Nong omogeneous Groups 50 0.0 15.1333 x x 100 34.6733 x 150 200 250 e 41.53 59.73 65.9 Dich thiy phan vem xanh ANOVA Table for VEM_ P-Value 0.0000 x x x ACE by D.Nong Source Sum of Squares|Df_ |Mean Square \F-Ratio ,P-Value Between groups |9834.89 {1966.98 378.25 0.0000 Within groups [62.4021 12 {5.20018 Total (Corr.) [9897.29 17 Multiple Range Tests for VEM_ ACE by D.Nong Method: 95.0 percent LSD D.Nong Count Mean Homogeneous Groups 0.0 x 50 8.57333 x 100 20.0933 x 150 31.4967 x 55.6967 x 200 250 64.0367 x 62 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN L LÝ LỊCH SƠ LƯỢC: Họ tên: Phan Thị Hoàng Anh Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 23/04/1996 Nơi sinh: TP Đà Nẵng Email: hoanganhphan2304@gmail.com Dién thoai: 0971053996 IL QUA TRINH DAO TAO: - 2014-2018: Sinh vién Vién Céng nghệ Sinh học Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 dén nay: Hoc viên Cao học Ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Công nghiệp Thành phế Hề Chí Minh II Q TRÌNH CONG TAC CHUYEN MON: Thoi gian 2018 — 2020 Nơi công tác Công việc đảm nhiệm Công ty CP Tư vấn Môi trường Sài Gon Nhân viên xử lý số liệu Tp HCM, ngày tháng Năm 20 Phan Thị Hoàng Anh 63 CHƯƠNG 2.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT Nguyên liệu Mẫu hàu (C gigas) vẹm xanh (P viridis) mua từ trang trại Long Sơn (tinh BR — VT), thu hoạch vào quý II năm (đầu tháng đến cuối tháng 6) Trong trình thu nhận vận chuyển, hàu vẹm xanh bảo quản điều kiện lạnh (49C) Sau chun phịng thí nghiệm, tiến hành cân mẫu, xay nhỏ sấy khô đến khối lượng không đổi SEB-Neutral PL enzyme protease lỏng sử dụng đề phân húy protein, làm tăng độ hòa tan phan tan cua protein Enzyme hoat dong tốt nhiệt độ 35 — 60°C, độ pH 5,5 — 7,5, hoạt tính 750 IU cung cấp từ Cơng ty TNHH Dịch vụ Đầu tư Xúc tiến Thương mại Hưng Thịnh Việt Nam 2.2 [44] Hóa chất, thiết bị dụng cu 2.21 Thiết bị Bảng 2.1 Danh sách thiết bị sứ đụng thí nghiệm STT Bê ủ Cân May May May May May May Thiết bị Néi hấp tiệt trùng 11 Tu cay 10 12 13 14 15 Hãng sản xuất nhiệt phân tích quang phơ khuay tir lac ly tam falcon ly tam lanh vortex GENESMART Sartorius Thermo Scientific SCILOGEX Taitec Hettich Hettich IKA STURDY Thiết bị sây phun Labplant Tủ đông sâu GFL Furni LAB Tu lanh -20°C Sumikura Tủ lạnh 4°C Tủ sây SANAKY CONTHERM 16 2.2.2 Héa chat Bảng 2.2 Danh sách hóa chất sứ đụng thí nghiệm STT | | _| 5_ | 6_ | 7_ | | | 10_| 11 | 12 | 13 | 14 | 15 _| Hóa chất Cơng thức hóa học ABTS Angiotensin I converting enzyme _| Axit ascorbic CsHsOs |Axiaxete CH:COOH Axit boric H3BO3 Axi gallic C7H6Os Axit trichloroacetic C›HClO› Captopril CoHisNO38 Copper CII) sulfate CUSO4.5H20 DPPH Ethanol C:H:OH Ethyl acetate CaHsO2 Ethylene glycol (CH20H)2 Ferric chloride FeCls Folin — Ciocalteu’s phenol - Hãng Sigma Sigma Prolabo Xilong Fisher Merck Xilong Domesco Xilong TCI Xilong Xilong Xilong Xilong Merck Maltodextrin Methanol Mueller Hinton agar Natri persulfate n-butyl alcohol |N-Hippuryl-His-Leu hydrate |Ninhydrin |n-propanol Nutrient broth Potassium ferricyanide Sodium acetate Sodium carbonate Sodium citrate Sodium cloride Sodium hydroxide Sodium tetraborate Xilong Himedia Xilong Xilong Sigma Merck JHD Himedia Xilong Xilong Xilong Xilong Xilong Xilong Fisher 16 | Glycine 17_| 18 19 20_ 21 22_ 23 24_ 25 26 27 28 29_ 30 | 31 32 | | | | _| | | | | | | C, Hs NO, CH30H Na2S20s C4HoOH CoHa(CO)2C(OH)2 CH3CH2CH20H K3Fe(CN)6 CH3COONa.3H20 Na2CO3 NaasCeH:O; NaCl NaOH Naz [Ba O5 (OH), | 17 Biolab 223 Dung cu Bang 2.3 Danh sách dụng cụ sử dụng thí nghiệm STT 10 11 Dung cu Binh dinh mire (S50mL, 100mL) Binh tam giác (100mL, 250mL) Côc thủy tĩnh (100mL, 250mL, 500mL) Cuvette Dau tip (100 uL, 200 pL, 1000 uL) Diia thuy tinh Eppendorf (1.5mL) Gia đỡ ơng nghiệm Hộp đựng đâu típ Khay dung Eppendoft Micropipette 12 — | Nhiệt kế 13 14 2.3 2.3.1 Ong dong (100 mL, 250 mL) Ơng nghiệm có nắp Xuất xứ Đức Đức Đức Đức Trung Quoc Việt Nam Trung Quéc Việt Nam Trung Quéc Việt Nam Đức Việt Nam Đức Đức Phương pháp nghiên cứu Phương pháp chuẩn bị nguyên liệu cho phân ứng thủy phân Hau va vem xanh (5 kg loại) mua chuẩn bị nguyên liệu sử dụng cho tất thí nghiệm sau Sau thu mua, hàu vẹm xanh chun phịng thí nghiệm điều kiện lạnh (4°C), tiến hành tách thủ công phan thịt rửa nhiều lần với nước Tiến hành xay nhuyễn máy xay Tefal BL438166 lần, lần phút Sau đó, sấy mẫu thịt hàu vẹm xanh xay nhỏ nhiệt độ 40 —50+2°C đến đạt khối lượng không đổi để thu nguyên liệu bột hàu vẹm xanh [39, 45] 18 Hinh 2.1 Nguyén liêu sau xay nhỏ sấy đến đạt khối lượng không đổi (A) Bột hàu Œ) Bột vem xanh 2.3.2 2.3.2.1 Phương pháp thầy phân bang protease Khảo sát điều kiện thủy phan [44] Tỷ lệ eaymelcơ chất (E/8) Chuẩn bị hẫn hợp chất đhàu vem xanh) enzyme protease với tỷ lệ E/S khảo sát 0, 2, 4, 6, 8, 10⁄4 vào bình tam giác 250 ml Các điều kiện thủy phân khác cố định bao gồm nhiệt độ 550C; pH 7,0 thời gian phản ứng 360 phút Sau đó, tiến hành đun hỗn hợp 900C 15 phút để dừng phản ứng Cuối củng, ly tâm tốc 13.000 vịng/phút 15 phút đễ thu dịch thủy phân Các thí nghiệm lặp lại ba lần Sản phẩm thủy phân tạo thành đánh giá phương pháp ninhydrin Ninhydrin (1,5 g) chuẩn bị 10 ml đệm axetat, sau bỗ sung 60 ml ethylene glycol, 15 ml n-propanol 15 ml n-butyl alcohol, Hit ml dich thủy phân ml dung dich ninhydrin vừa chuẩn bị vào ống nghiệm, phối tron cho đồng phản ứng, sau tiến hành đun sơi hỗn hợp 20 phútđể để xây phản ứng 8au đun xong, nhanh chóng làm lạnh ống nghiệm chứa hỗn hợp phản ứng bồn chứa nước đá, Sau đó, hút ml ethanol (40% v/v) để phản ứng màu diễn Độ hấp thụ mẫu phản ứng đo bước sóng 570 nm sử dung glycine để dựng 19 đường chuẩn Hàm lượng sản phẩm thủy phân tạo thành tính theo nồng độ mol suy từ đường chuẩn glycine Thời gian phản ứng Chuẩn bị hỗn hợp chất (hau vẹm xanh) enzyme protease vào bình tam giác 250 ml, với tỷ lệ E/S xác định thử nghiệm trước Tiến hành thủy phân khoảng thời gian khảo sat la 120, 240, 360, 480 va 600 phút; với độ pH7,0 nhiệt độ phản ứng 550C Sau thời gian phản ứng, đun hỗn hợp 909C 15 phút để dừng phân ứng Cuối cùng, ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút 15 phút dé thu địch thủy phân Sản phẩm thủy phân tạo thành đánh giá phương pháp ninhydrin Các thí nghiệm lặp lại ba lần Độ pH Sau xác định tý lệ E/S thời gian phản ứng phù hợp để thủy phân hàu va vem xanh bang enzyme protease, tiép tục tiến hành khảo sát độ pH môi trường thay đổi từ 5,5; 6,0; 6,5: 7,0; 7,5; 8,0 nhiệt độ 55%C Sau thời gian phản ứng, đun hỗn hợp 90°C 15 phút để dừng phán ứng Cuối cùng, ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút 15 phút để thu dịch thủy phân Sản phẩm thủy phân tạo thành đánh giá phương pháp ninhydrin Các thí nghiệm lặp lại ba lần 2.3.2.2 Xác định hiệu suất thủy phân (DH%) Hiệu suất thủy phân xác định phương pháp so màu ninhydrin [46] Phương pháp dựa sở axit amin oxi hóa giảm bớt nguyên tử C trở thành dạng aldehyde đến ammoniae carnonie, axit amin đưới tác đụng ninhydrin Các axit amin có khối lượng phân tử nhỏ amoniae tạo thành oxi hóa ninhydrin tạo thành phức hợp có màu xanh tím có độ hấp thụ cực đại bước sóng 570 nm Ninhydrin (1,5 g) chuan bi 10 ml dém axetat, sau bé sung 60 ml ethylene glycol, 15 ml n-propanol 15 ml n-butyl alcohol Hut ml dịch thủy phân ml dung địch ninhydrin vừa chuẩn bị vào ống nghiệm, phối trộn cho đồng phản ứng, sau tiến hành đun sôi hỗn hợp 20 phút dé để xảy phản 20 ứng Sau đun xong, nhanh chóng làm lạnh ống nghiệm chứa hỗn hợp phản ứng bền chứa nước đá Sau đó, hút ml ethanol (40% v/v) dé phan tng mau diễn Phản ứng màu đo độ hấp thụ bước sóng 570 nm sử dụng glyeine làm chất chuẩn Giá trị DH% tính theo cơng thức: DH = [(A2 - Ai) / A2] x 100%, As hàm lượng sản phâm sau thủy phân (mM) A¡ hàm lượng sản phẩm mẫu đối chứng (mM) Các thí nghiệm lặp lại ba lần Sau thủy phân, tiến hành đông khô sản phâm thủy phân tir hau va vem xanh Sản phẩm sau đông khô sử đụng để đánh giá hoạt tính sinh học 23.3 Phương pháp xác định tổng hàm lượng protein [47] Tổng lượng protein đo phương pháp Lowry, đựa sở xác định cường độ màu sản phẩm khử phức hợp đồng — protein véi phosphomolipden — phosphovonphramate (Trong thuốc thứ F - C) với phức hợp đồng - protein Giá trị cường độ màu bước sóng 750 nm tương quan với hàm lượng protein có mẫu [48] Chuẩn bị hỗn hợp gồm 0,5 ml mau (dịch thủy phân bột say phun) va 2,5 ml hợp dung dịch có tỷ lệ A:B:C 50:1:1 chuẩn bị trước thử nghiệm (Với dung dich A: NaOH 0,1M va Na2CO3 2%; dung dịch B: Na:CH:Ö; 1%; dung dich C: CuSOy4.5H20 0,5%) vao éng nghiém Lac déu va hop 20 phit nhiệt độ phòng để xây phân ứng Sau đó, bé sung 0,25 ml thuéc tht F — C 0,5 N vào ống nghiệm, đồng hỗn hợp ú 60 phút nhiệt độ phòng Độ hấp thụ màu hỗn hợp đo bước sóng 750 nm máy đo quang phố UV — Vis hàm lượng protein tổng số tính tốn dựa đường chuẩn BSA Các thí nghiệm lặp lại ba lần 23.4 2.3.4.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa Hoạt tính thu gom gốc tự DPPH [49] Phản ứng thực cách hút 1,0 ml dịch thủy phân với nông độ khác (20, 40, 60, 80, 100 mg/m]) trộn với 4,0 ml DPPH 0,076 mM hòa tan methanol Sau lắc đều, hỗn hợp giữ bóng tối 25C 30 phút Độ hấp thụ màu hỗn hợp phản ứng đo bước sóng 517 nm 21 máy UV — Vis Hoat déng thu gom g6c DPPH tính bằng: Tý lệ thu gom (%) = [(Aaéi cining — Amin) / Adi ching] x 100, dé Aaé ching 1A d6 hap thy cia mẫu đối chứng (dung dịch DPPH không chứa dich thiy phan) va Amin 14 d6 hap thụ mẫu thứ Đường chuẩn xây dựng cách sử đụng loạt nồng độ axit ascorbic dé thay cho dịch thủy phân Các thí nghiệm lặp lại ba lần 2.3.4.2 Hoạt tính thu gom géc ABTS [50] Chuẩn bị dung dịch gốc tự (ABTS) bang cách hút dung dich A B với tỷ lệ 1:1 (Trong đó, dung dich A la ABTS mM va dung dich B la natri persulfate 2,45 mM) vao céc thủy tinh, đồng hỗn hợp ủ 16 250C bóng tối Sau thời gian ủ, pha loãng hỗn hợp nước cất lần đến độ hấp thụ màu đạt giá trị 0,70 + 0,02 bước sóng 734 nm Phản ứng bắt đầu cách sử dụng 100 ul dich thủy phân nông độ khác (20, 40, 60, 80, 100 mg/m]) trộn với ml dung dich ABTS”, lắc ủ phút bóng tối Độ hấp thụ màu đo bước sóng 734 nm Phần trăm hoạt động thu gom gốc ABTS tính theo cơng thức: [CÀ đói chứng — Amẫu) / A đối chine] < 100, Ađái chứng độ hấp thụ đối chứng (dung địch ABTS*! không chứa dịch thủy phân); A„ãu độ hấp thụ mẫu thứ Đường chuẩn xây dựng cách sử đụng loạt nồng độ axit ascorbic dé thay cho dịch thủy phân Các thí nghiệm lặp lại ba lần 2.3.4.3 Năng lực khử (Reducing power assay) [36] Hút 1,0 ml địch thủy phân pha lỗng với nơng độ khác (50, 100, 150, 200, 250 mg/ml); 2,5 ml potassium ferricyanide 1% va 2,5 ml đệm phosphate (0,2 M; pH 6,6) vào ống nghiệm, đồng hỗn hợp ủ 20 phút 509C Sau thời gian ú, tiếp tue bé sung 2,5 ml trichloroacetic acid 10% va ly tam 3000 vòng/phút 10 phút, thu địch nỗi Hút 2,5 ml dich nỗi vào ống nghiệm mới, bé sung 2,5 ml nước cất lần 0,5 ml ferric chloride 0,1%, đồng hỗn hợp ủ 10 phút Độ hấp thụ màu hỗn hợp phản ứng đo bước sóng 700 nm máy UV — Vis Đường chuẩn xây dựng cách sử dụng loạt nồng độ axit ascorbic dé thay cho địch thủy phân Các thí nghiệm lặp lại ba lần 22 Năng lực khứ biểu diễn dạng đương lượng Hg axit ascorbic (AAE) mg mẫu, theo công thức: C = C¡ x V/m, C lực khứ (ngAAE/mg); C¡ nồng độ axit ascorbie có từ đường chuẩn (ug/ml); V thê tích dich pha loãng mẫu (ml); m — khếi lượng mẫu thử nghiệm (mg) 2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn [37J Các chúng vi khuẩn sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cầu khuẩn gram durong S aureus ATCC 25923, vi khuan gram âm E coli ATCC 25922, Ƒ parahaemolyfieus (cung cấp Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2) Khả kháng khuân đánh giá phương pháp khuếch tán đĩa thạch Chuẩn bị ống nghiệm mÍ mơi trường đỉnh dưỡng lồng NB, bề sung 50 HÌ lượng vi khuẩn từ ống giống giữ giống — 70°C, hoạt hóa chúng vi khuẩn từ — giờ, 37°C thực đo ODsooam đạt giá trị từ 0,08~0,1 (theo tiêu chuẩn 0,5 MeFarland) Tiếp theo, sử dụng tăm hấp khử trùng nhúng vào địch khuẩn, loại bỏ dịch vi khuẩn thừa tăm cách xoay nhẹ lên thành ống nghiệm Sau đó, ria dịch khuẩn có tăm lên bề mặt thạch MHA chuẩn bị trước Mở nắp đĩa thạch từ — phút tủ cấy cho khô bề mặt, tiến hành đục giếng thạch với đường kính giếng mm Sau đó, hút 100 ul mẫu địch thủy phân với nông độ khác (50, 100, 150, 200 mg/ml) lọc qua màng lọc vô trùng 0,45 um Cae dia sau bố sung dịch thủy phân vào giếng, ú — 10°C gid, sau ủ 370C 24 Dựa vào phát triển vi khuẩn vùng tiếp xúc thạch mẫu peptit thủy phân để đánh giá khả kháng khuẩn, đường kính vùng ức chế xác định thước đo kỹ thuật Đối chứng dương kháng sinh Genftamycin 100 mg/mIl 23.6 Phương pháp xác dinh hoat tinh wc ché Angiotensin I converting enzyme (ACE) [51] Chuan bj dung dich N-Hippuryl-His-Leu hydrate (HHL) bang cach hod tan 1,8 mg co chat HHL 500 ul dung dich dém sodium borate (50 mM; pH 8,3) Tiép đến, hit 50 ul dich thay phan dwoe pha loang véi cdc néng dé khdc (50, 100, 150, 23 200, va 250 pg/ml) va 150 ul dung dich HHL vao eppendoft, déng nhat hop va ú phút 37°C Sau đó, bé sung 50 ul dung dich ACE (25 mU/ml), déng nhat hỗn hợp tiếp tục ú 60 phut 37°C Sau thời gian ủ, kết thúc phản ứng cách thêm 250 ni HCI 1,0 M vào hỗn hợp, tiếp tuc bé sung 1,5 ml ethyl acetate vào dịch phán ứng đề chiết xuất axit hippurie trước tiến hành ly tâm 3000 vòng/phút 10 phút 25°C thu địch Hút 1,0 ml phần dịch nối chuyển vào eppenđorf để bay hoàn toàn ba Cuối cùng, thêm 3,0 ml nước cất lần tiến hành đo quang hễn hợp bước sóng 228 nm Hoạt tính ức chế ACE tính cơng thức: [(A mẫu trắng — Amẫu) / (Ä mẫu tráng — Ađối shứng)] x 100, A xấu gáng độ hấp thụ hỗn hợp không chứa dịch thủy phân, Amau độ hấp thụ hỗn hợp phản ứng, Aaá chứng độ hấp thụ đung địch đệm Đường chuẩn xây dung bang cach sir dung mot loat cdc néng dé captopril (thuốc ức chế hoạt động ACE) dé thay thé cho cae dich thiy phan Cac thí nghiệm thực ba lần lặp lại 2.3.7 Phương pháp xác định trình tự peptit sắc ký lông khối phổ (LCMS/MS) [52] Trinh tự axit amin peptit sản phẩm thủy phân phân tích hệ thống HPLC-MS/MS, với tốc độ đòng 0,3 mL/phut, su dung gradient định Pha động bao gồm hai dung môi A B Dung môi A điều chế cách thêm 0,1% axit Formic (FA) (Fisher Scientific, Hoa Ky) (v/v) miliQ-H20 (Merek), dung môi B được điều chế cách thêm acetonitril (ACN) (Fisher Scientific, USA) với 0,1% FA v/v Dé dốc rửa giải thực cách thay đổi tỷ lệ dung môi B từ 10% đến 90% khoảng thời gian 37 phút Sử dụng Cột XBridge C18 3,5m 2,1 x 150mm máy quang phô khối Triple TOF 6600+ (AB SCIEX) trang bị Analyst TF 1.8 Céng cu tim kiếm ProteinPilot sử dụng để phân tích phổ MS/MS 24 2.3.8 Phuong phap docking phan tw [53] Cấu tric tinh thé cla enzyme ACE (PDB: 108A, dé phan gidi 2,0 A) duoc tai vé tir Protein Data Bank (/www.resb.org/pdb/home/home.đo) Cấu trúc phân tử captopril tải từ sở liệu Pubchem (//pubchem.nebi.nÏlm.nih.gov), cấu trúc trình tự peptit xây dựng mơ phần mềm PyMOL,2.5.5 Tiến hành docking bang phan mém Autodock Vina dé đánh giá lượng tự liên kết số lượng tương tác vật lý Kết đocking đánh giá thơng qua ba tiêu chí điểm số docking, tương tác giá trị RMSD Kết doeking phân tích phần mềm PyMOL 2.5.5 Sự phù hợp việc kết nối peptit vị trí hoạt động ACE đánh giá dựa lượng liên kết Ngoài ra, liên kết hydro khoảng cách tính tốn 2.3.9 Phương pháp sấy phun [54] Maltodextrin sử dụng làm chất mang bố sung vào địch thủy phan hau va vẹm xanh với tỷ lệ 15% (w/v) Thiết bị sử dụng để sấy phun hãng Labplant, model: SD-Basie Dung dịch mẫu đưa vào máy sấy phun q trình tạo bột với nhiệt độ khơng khí vào 160°C, nhiệt độ khơng khí 800C, tốc độ bơm ml/phút Bột sấy phun đem đo độ âm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Đề đánh giá hoạt tính chống oxy hóa sản phẩm thủy phân sấy khơ, bột sấy phun hòa tan nước cất lần theo tý lệ cho hàm lượng chất thủy phân với nông độ thử nghiệm thực dịch chất thủy phân trước 2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thô xử lý sơ phần mềm Microsoft Excel 365 Các thí nghiệm bố trí lặp lại lần kết trình bày đưới đạng số trung bình (cúa lần lặp lại) + độ lệch chuẩn Phân tích ANOVA đơn yếu tố hai yếu tố, xây dựng biểu đề, đường chuẩn phần mềm chuyén dung Statgraphics Centurion XVI Prism 8.3 Sir dung kiém dinh Multiple range test dé đánh giá mức độ khác biệt giá trị với mức độ ý nghĩa làp < 0,05 25