Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên her2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN PHƢƠNG HOA NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn phƣơng Hoa NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2 Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Quang Huấn Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………1 Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………… Khái niêm, phân loại ứng dụng immunotoxin……………………….3 1.2 Tình hình ung thƣ vú (UTV) giới Việt Nam 1.2.1.Trên giới 1.2.2.Ở Việt Nam 1.3 Giới thiệu ung thƣ vú……………………………………………………5 1.3.1 Khái niệm chung bệnh UTV 1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú 1.3.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán 1.3.4 Các phƣơng pháp điều trị 1.4 Kháng nguyên Her2 đặc hiệu tế ung thƣ vú 10 1.4.1 Khái quát kháng nguyên HER2 10 1.4.2 Cấu trúc HER2 11 1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2 11 1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2 11 1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 chế gây ung thƣ HER2….13 1.5 Khái quát chung kháng thể - Kháng thể đơn dòng 16 1.5.1 Cấu tạo chung kháng thể 16 1.5.2 Kháng thể đơn dòng 17 1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi - Mảnh kháng thể………………………… 17 1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng điều trị ung thƣ vú …19 1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin………………………………22 Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Sinh phẩm 23 2.1.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Phƣơng pháp PCR……………………………………………….24 2.2.2 Cắt enzym giới hạn 26 2.2.3 Phƣơng pháp thiết kế vector biểu 26 2.2.4 Phƣơng pháp biến nạp 29 2.2.5 Phƣơng pháp biểu protein tái tổ hợp 30 2.2.6 Phƣơng pháp điện di protein gel polyacrylamide 31 2.2.7 Phƣơng pháp tính protein tái tổ hợp cột lực Ni2+ 32 2.2.8 Phƣơng pháp phân tích khối phổ 33 Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Thiết kế vector biểu pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch hermel 36 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.1 Cắt gen Hermel 36 3.1.2.Cắt vector pET-21A(+) 36 3.1.3 Gắn gen hermel vào vector pET-21A(+) chọn dòng plasmid tái tổ hợp……………………………………………………………………… 38 3.1.4 Xác định trình tự gen hermel ……………………………………Error! Bookmark not defined 3.2 Biểu tối ƣu hoá biểu gen hermel ………………………….Error! Bookmark not defined 3.2.1 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli BL21(DE3) .Er ror! Bookmark not defined 3.2.2 Biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 tế bào E coli BL 21(DE3)……………………………………… 45 3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 E coli 46 3.3.1.Ảnh hƣởng pH lên khả sinh tổng hợp độc tố miễn dịch herme 47 3.3.2 Ảnh hƣởng oxi lên khả biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………………………………………48 3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………………………………………50 3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy …………………………………………… Error! Bookmark not defined 3.3.5 Ảnh hƣởng IPTG………………………………………………….52 3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu……………………………………………54 3.3.7 Biểu protein tái tổ hợp hermel điều kiện thích hợp lựa chọn…………………………………………………………………………….55 3.4 Tinh sach protein tái tổ hợp hermel, khẳng định khối phổ xác đinh hoạt tính………………………………………………………… 56 3.4.1 Tinh protein tái tổ hợp HER2…………………………………… 56 3.4.2 Phân tích khối phổ protein tái tổ hợp…………………………………….57 3.4.3 Xác đinh hoạt tính protein hermel………………………………… 59 Kết luận kiến nghị ……………………………………………………… Error! Bookmark not defined Tài liệu tham khảo ……………………………………………………………Error! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn THUËT NG÷ VIÕT T¾T Stt Ký hiệu Tên đầy đủ ADN Axit Deoxyribonucleic Amp Ampicillin bp Base pair (cặp bazơ nit¬) ddNTP Dideoxynucleotide dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid PE Pseudomonas exotoxin EtBr Ethidium Bromide HRP Horseradish peroxidase 10 IPTG Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside 11 IR Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn) 12 Ka Kanamycin 13 kDa Kilo Dalton 14 LB M«i tr-êng Lauria Betani 15 DT Diphtheria toxin 16 LRR Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine) 17 LTA Axit lipoteichoic 18 NASBA Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa trình tự axit nucleic) 19 OD Optical Density (MËt ®é quang häc) 20 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 21 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 22 TAE Tris - Acetate - EDTA 23 TE Tris - EDTA 24 utv ung th- vó 25 v/ph vßng/phót 26 X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl-  - D-galactopyranoside Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -1- MỞ ĐẦU Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) xác định chất gây độc cho tế bào, tạo để giết cách chọn lọc quần thể tế bào mà có biểu kháng nguyên thụ thể bề mặt đặc hiệu Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết làm tan tế bào ung thư vú biểu mức HER2 yếu tố phát triển biểu mô biểu mạnh 25-30% bệnh nhân ung thư vú ITs tạo việc kết hợp yếu tố : (1) chất gây độc (toxins) có chất protein (2) tác nhân hướng đích theo phương pháp hố học (7) công nghệ ADN tái tổ hợp HER2 loại thụ thể thuộc họ yếu tố phát triển biểu mơ (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng biệt hố tế bào Cho đến chưa tìm thấy ligand đặc hiệu HER2; nhiên tạo dimer với thân với thụ thể khác họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy đường truyền tín hiệu Sự khuếch đại gen HER2 nhiễm sắc thể 17 dẫn đến tăng biểu thụ thể HER2 bề mặt tế bào ung thư vú Biểu mức HER2 biến đổi tế bào thành dạng ác tính làm tăng trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có khuếch đại gen HER2 biểu mức gen tế bào ung thư Tính chất làm cho HER2 trở thành đích hữu hiệu để chẩn đốn sớm đích cơng liệu pháp điều trị miễn dịch Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -2- Ung thư vú hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao bệnh ung thư nữ giới Điều trị ung thư vú nhiều loại ung thư khác theo liệu pháp truyền thống hoá trị liệu xạ trị liệu hiệu tiêu diệt khối u cao lại có nhược điểm lớn, tác dụng lên quan bình thường xung quanh (non-targeted effect) Mặt khác, phương pháp đa phần áp dụng trường hợp khối u phát triển giai đoạn muộn nên có hiệu điều trị thấp Những nghiên cứu gần marker sinh học ung thư vú mở hướng điều trị mới, thông minh đầy triển vọng, liệu pháp điều trị cơng đích (targeted therapy), loại bỏ gần hoàn toàn nhược điểm liệu pháp truyền thống Một số thuốc có chất kháng thể đặc hiệu HER2 FDA chấp thuận để điều trị cho bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 giai đoạn cuối HERCEPTIN Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo kít chẩn đốn loại thuốc có hiệu điều trị cao dạng ung thư vú dương tính với HER2 tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu kháng nguyên Her2’’ Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -3- Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khái niệm, phân loại ứng dụng Immunotoxin Như nói trên, cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunôtxin-IT) xác định chất gây độc cho tế bào, tạo để giết cách chọn lọc quần thể tế bào mà biểu kháng nguyên receptor bề mặt đặc hiệu Những độc tố dạng nghiên cứu chế tạo không trị liệu ung thư (5), mà thử nghiệm bệnh khác GvHD (6), bệnh tự miễn dịch AIDS (7) Immunotoxin tạo việc kết hợp hai yếu tố : chất gây độc (toxins) có chất protein (2) tác nhân hướng dích theo phương pháp hố học (9) cơng nghệ ADN tái tổ hợp (11) Cho tới toxin thường hay dùng để chế tạo ITs protein từ vi khuẩn [pseudomonas exotoxin (PE) hay diptheria toxin (DT)] , từ thực vật [nhóm protein bất hoạt riboxom (RIPs) : Ricin, pokweet anti- viral protein (PAP) Saporin (SAP) ] Cả hai loại toxin tác động lên tế bào theo chế làm bất hoạt EP-2 (PE, DT) hay tác động lên điểm gắn EP-2 (RIPs) tiểu phần riboxom 28S, làm ức chế trình sinh tổng hợp protein (17) Mặc dù toxin kể có hoạt tính cao khơng đến 10 phân tử giết chết tế bào đích, việc kết hợp chúng để tạo ITs mang lại giá trị sử dụng cao nhiều.Các kết nghiên cứu cho thấy ITs tạo toxin kể có khả ức chế tế bào ung thư mạnh hiệu từ hàng trăm tới hàng nghìn lần có tính hướng đích tính chọn lọc Độc tố Melitin ? Melitin loại protein hay chuỗi axit amin, thu hút mạnh màng tế bào nên tiếp xúc với bề mặt tế bào mục tiêu, nhanh Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 50 - độc Khi lượng oxy cung cấp nhiều dẫn đến tăng sinh tế bào xảy mạnh mẽ, lượng protein tái tổ hợp tổng hợp nhiều Nhưng đến khoảng thời gian định, gen độc tố tổng hợp nhiều dẫn đến chết đồng loạt tế bào Nên trường hợp protein tái tổ hợp không biểu 3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh Trong môi trường nuôi cấy ban đầu, ampicillin (Amp) coi áp lực chọn lọc dòng tái tổ hợp mang gen kháng Amp Vì thế, tế bào chứa plasmid tái tổ hợp có mang gen mã hóa độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên Her2 có khả sinh trưởng mơi trường có Amp Để tìm nồng độ Amp thích hợp cho q trình sinh tổng hợp protein tiến hành khảo sát nồng độ Amp thích hợp mơi trường ni cấy Chủng E coli ni cấy bình ni cấy điều kiên (như phần phương pháp), pH = 7,4; khác nồng độ Amp môi trường (100 g/ml, 150 g/ml 200 g/ml) Kết điện di hình 3.11 cho thấy, mơi trường có nồng độ Amp 100 g/ml, 150 g/ml 200 g/ml khả biểu protein tái tổ hợp Vì vậy, chúng tơi chọn nồng độ Amp thấp nồng độ thích hợp để biểu chủng Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên kDa http://www.lrc-tnu.edu.vn - 51 - 66 43 35 34,47 kDa 25 18 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ Amp đến khả biểu độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên Her2 1-3: Lượng protein nồng độ Amp 100 g/ml, 150 g/ml 200 g/ml 4: thang protein chuẩn 3.3.4 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy Ngồi yếu tố kể trên, yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng biểu độc tố miễn dịch Hermel chủng nhiệt độ nuôi cấy Nghiên cứu khả biểu chủng E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET-21a(+)/HER2 nhiệt độ nuôi cấy khác 28oC, 30oC 37oC điều kiện nuôi cấy (như mô tả phần phương pháp kết hợp với điều kiện lựa chọn trên) Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên kDa http://www.lrc-tnu.edu.vn - 52 - 66 43 35 25 18 34,47 kDa 14 Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả biểu protein tái tổ hợp Hermel 1-2; 4: lượng protein nhiệt độ 28oC, 30oC 37oC, 3: thang protein chuẩn Kết hình 3.12 cho thấy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả biểu độc tố miễn dịch Hermel chủng nghiên cứu Ở nhiệt độ 28oC 30oC không thấy xuât băng protein kích thước 34,47 kDa, chứng tỏ độc tố miễn dịch Hermel không tổng hợp nhiệt độ ni cấy Cịn nhiệt độ ni cấy 37oC biểu độc tố miễn dịch Hermel 3.3.5 Ảnh hƣởng IPTG IPTG (isopropyl  - D- thiogalactoside) chất cảm ứng T7 lac promoter Promoter điều khiển trực tiếp trình biểu gen mã hóa độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng ngun Her2 Vì vậy, IPTG có tác động trực tiếp lớn đến khả tổng hợp độc tố miễn dịch Hermel IPTG có giá thành cao nên việc khảo sát nồng độ IPTG thấp để giảm chi phí điều cần thiết Vì nghiên cứu này, chúng tơi nghiên cứu ảnh Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 53 - hưởng dải nồng độ IPTG từ – mM Chủng E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp HER2 nuôi cấy điều kiện (như mô tả phần phương pháp kết hợp với điều kiện lựa chọn trên) Các thí nghiệm khác nồng độ IPTG sử dụng để cảm ứng mM, mM mM kDa 66 43 35 34,47 kDa 25 18 14 Hình 3.13 Ảnh hưởng IPTG đến khả biểu độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên Her2 1-3: lượng protein tổng hợp nồng độ IPTG 1mM, 2mM mM 4: thang protein chuẩn Kết hình 3.13 cho thấy, IPTG có ảnh hưởng lớn đến biểu protein tái tổ hợp HER Lượng protein tăng dần với nồng độ IPTG Ở nồng độ IPTG mM cho băng protein đậm hay lượng protein tái tổ Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 54 - hợp tổng hợp nhiều Do vậy, chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG mM 3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu Để lựa chọn thời điểm mà lượng protein tổng hợp cao nhất, chúng tơi tiến hành khảo sát thời gian thu mẫu khác (sau 3, 12 h thu mẫu) Tế bào E coli mang plasmid tái tổ hợp HER2 ni cấy bình ni cấy điều kiện lựa chọn Sau 3, 12 h thu mẫu lần kết phân tích điện di gel polyacrylamid kDa 35 25 34,47 kDa 18 Hình 3.14 Lượng protein tái tổ hợp_HER2 tổng hợp theo thời gian 1: thang protein chuẩn; 2-4: lượng protein tái tổ hợp thời điểm 4, 12 h Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 55 - Kết điện di hình 3.14 cho thấy, thu mẫu sau h 12 h cho lượng protein Cịn thu mẫu sau h cho lượng protein nhiều Bởi vậy, chọn thời điểm h sau cảm ứng để thu mẫu 3.3.7 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP HERMEL Ở CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP Đà LỰA CHỌN Sau lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp, tiến hành biểu chủng E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp HER2 bình ni cấy với điều kiện lựa chọn (pH môi trường 7,4; nồng độ Amp 100 g/ml; nồng độ IPTG mM; nhiệt độ nuôi cấy 37 oC; h sau cảm ứng thu mẫu) 10 kDa 66 43 35 34,47 25 kDa 18 14 Hình 3.15 Điện di độc tố miễn dịch Hermel gel polyacrylamid 12,5% 1: mẫu trước cảm ứng, 2-9: mẫu sau cảm ứng, 10: thang protein chuẩn Kết hình 3.15 cho thấy băng protein kích thước 34,47 kDa xuất đậm giếng số – Chứng tỏ chủng biểu tốt điều kiện ni cấy lựa chọn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 56 - 3.4 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP HERMEL, KHẲNG ĐỊNH BẰNG KHỐI PHỔ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH 3.4.1 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP HER2 Protein tái tổ hợp sau biểu thành công bị lẫn protein khác Để thu protein tinh sạch, tiến hành tinh protein tái tổ hợp cột sắc ký lực Ni2+ (như phần phương pháp) Để tinh protein này, sử dụng 900 l dịch phá tế bào (thực phá tế bào tương tự bước điện di protein), bổ sung vào 240 l dung dịch chứa hạt Ni-NTA Magnetic Agarose 5% Hỗn hợp ủ lắc 1h nhằm tạo điều kiện cho protein chứa đuôi His-tag liên kết với hạt Ni-NTA, sau hỗn hợp đưa lên giá từ phút loại dịch Cặn thu phức protein-hạt Ni-NTA, để loại bỏ hồn tồn protein khơng đặc hiệu (khơng liên kết với hạt Ni-NTA), rửa cặn thêm vài lần đệm rửa (Wash Buffer), loại dịch Sau bổ sung đệm tách (Elution Buffer), đảo đều, ủ giá từ thu dịch Dịch dung dịch protein cần tinh sạch, Elution Buffer có tác dụng phá vỡ liên kết protein hạt Ni-NTA Dịch protein sau tinh đem chạy điện di gel polyarylamide Tricine-SDS-Page Kết điện di hình 3.16 cho thấy xuất băng protein kích thước 34,47 kDa chứng tỏ tinh thành công protein tái tổ hợp HER2 Để khẳng định chắn kết thu độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên Her2 tiếp tục tiến hành khối phổ nhận diện trình tự axit amin Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 57 - kDa 66 43 35 34,47 kDa 25 18 14 Hình 3.16 Điện di độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên Her2 gel polyacrylamid 3.4.2 PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ PROTEIN TÁI TỔ HỢP Sử dụng độc tố miễn dịch đặc hiệu HER2 tinh cột Ni-NTA để phân tích cấu trúc bậc khối phổ Trong trình phân tích protein (kháng thể) xử lý với trypsin Theo lý thuyết, trypsin cắt protein vị trí axit amin R (Arginine) K (Lysine) Kết phân tích thực tế chúng tơi nhận chứng minh sản phẩm biểu tinh có cấu trúc bậc (trình tự amino axit) phù hợp với trình tự tính tốn lý thuyết Khi so sánh với liệu Ngân hàng liệu quốc tế sản phẩm mà chúng tơi nhận chứa đoạn peptide thuộc trình tự kháng thể kháng HER2 (hoặc tên gọi khác anti-Erbb2) Kết nhận diện đoạn peptide phân tích khối phổ trình bày bảng 3.1, bảng 3.2, bảng 3.3 bảng 3.4 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 58 - Bảng 3.1 Đoạn peptide nhận diện LLIYSASYR gi|22219205 Mass: 23797 Total score: 44 Peptides matched: Chain L, Crystal Structure Of The Anti-Erbb2 Fab2c4 Check to include this hit in error tolerant search or archive report Query 11 12 13 Observed 543.51 543.52 543.52 Mr(expt) 1085.00 1085.02 1085.02 Mr(calc) 1084.59 1084.59 1084.59 14 543.52 1085.03 1084.59 Delta Miss Score 0.41 (12) 0.43 44 0.43 (11) 0.44 Rank Peptide LLIYSASYR LLIYSASYR LLIYSASYR LLIYSASYR (7) Bảng 3.2 Đoạn peptide nhận diện FTLSEIK gi|4502747 Mass: 43149 Total score: 43 cyclin-dependent kinase [Homo sapiens] Check to include this hit in error Query Observed Mr(expt) Mr(calc) 419.39 836.76 836.46 419.39 836.77 836.46 419.40 836.78 836.46 Peptides matched: tolerant search or Delta Miss Score 0.30 43 0.31 (22) 0.32 (23) archive report Rank Peptide FTLSEIK FTLSEIK FTLSEIK Bảng 3.3 Đoạn peptide nhận diện FTLSVDR gi|22219206 Mass: 23925 Total score: 43 Peptides matched: Chain H, Crystal Structure Of The Anti-Erbb2 Fab2c4 Check to include this hit in error tolerant search or archive report Query Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Rank Peptide 419.39 836.76 836.44 0.32 43 FTLSVDR 419.39 836.77 836.44 0.33 (22) FTLSVDR 419.40 836.78 836.44 0.34 (16) FTLSVDR Bảng 3.4 Đoạn peptide nhận diện NTLYLQMDSLR gi|11137444 Mass: 10200 Total score: 39 Peptides matched: immunoglobulin heavy chain variable region [Homo sapiens] Query Observed 24 677.11 Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Rank 1352.20 1352.68 -0.48 39 Peptide NTLYLQMDSLR Đến chúng tơi khẳng định thu nhận thành công độc tố miễn dịch đặc hiệu HER2 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 59 - 3.4.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN HERMEL Để kiểm tra tính đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên HER2, tiến hành kiểm tra phản ứng ELISA Kết ELISA thể bảng 3.5 hình 3.50 Bảng 3.5 Kết xác định ELISA sản phẩm scFv sau tinh cột Ni-NTA 0,14 0,12 0,1 0,08 Series1 0,06 0,04 Mẫu 0,02 OD450nm-650nm ĐC(-) 0,015 ĐC (+) 0,129 scFv 0,12 scFv/10 0,09 ĐC(-) ĐC (+) scFv scFv/10 Hình 3.17 Kết ELISA sản phẩm scFv Đối chứng âm giếng không chứa sản phẩm scFv Đối chứng dương dung dịch kháng thể kháng HER2 (100 ng/ml) Hãng Genscrip scFv dung dịch sau tinh (100 ng/ml) scFv/10 dung dịch sau tinh (10 ng/ml) Kết ELISA cho thấy độc tố miễn dịch sau tinh có khả nhận biết liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HER2 tương đương với đối chứng dương (kháng thể đặc hiệu HER2 Hãng Genscrip) Kết cho phép lần khẳng định kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 thu có khả nhận biết liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HER2 tương đương với sản phẩm hãng Genscrip kiểm tra ELISA Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 60 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  KẾT LUẬN Đã thiết kế thành công vector biểu gen hermel mã hoá độc tố miễn dịch bao gồm phần mã hoá kháng thể nhận biết thụ thể HER2 ung thư vú phần mã hoá peptide làm tan tế bào mellitin Đã biểu thành công gen hermel E.coli chủng BL21DE3 nhiệt độ 37oC sau cảm ứng 0,6 mM IPTG Đã nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện biểu gen mã hóa độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên Her2 E coli Chủng biểu tốt điều kiện: pH môi trường 7,4; nồng độ Amp 100 g/ml; nồng độ IPTG mM; nhiệt độ nuôi cấy 37oC; h sau cảm ứng thu mẫu Đã tinh thành công kháng thể tái tổ hơp đặc hiệu HER2, độc tố miễn dịch thu có độ tinh cao sau tinh cột lực NiKel khẳng định kết phân tích khối phổ Xác định hoạt tính Hermel liên kết đặc hiệu kháng nguyên HER2 tương đương kháng thể chuẩn  KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu điều kiện tinh kháng thể tái tổ hợp quy mô lớn để thu nhận đủ lượng kháng thể tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu sâu tác dụng dược lý Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng kháng thể kháng HER2 chẩn đoán điều trị ung thư vú Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 61 - TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Thanh Dịu, Lã Thị Huyền, Phạm Như Trọng, Lê Quang Huấn, (2007), Tách dịng xác định trình tự gen HER2/neu đặc hiệu ung thư vú, Hội nghị Khoa học sống, Đại Học Quy Nhơn, 10/8/2007, Tr 668-671 Phạm Văn Ty (2001), Miễn dịch học, NXB ĐHQG Hà Nội, Tr 39-59 Đái Duy Ban, Trương Nam Hải, Đinh Duy Kháng, Lê Thị Minh Chính Lê Thanh Hòa, (2006), Sinh học phân tử ung thư vú NXB Khoa học kĩ thuật Nguyễn Bá Đức, (2001), Bài giảng ung thư học lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kic thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB khoa học kĩ thuật TÀI LIỆU TIẾNG ANH Andrechek, E R., Hardy, W R., Siegel, P M., Rudnicki, M A., Cardiff, R D., Muller, W J, (2000), “Amplification of the neu/erbB-2 oncogene in a mouse model of mammary tumorigenesis”, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 3444-9 Berrington de Gonzalez, A., and Darby, S (11/28/2007), “Risk of cancer from diagnostic X-rays” Bianco AR, (2004), “Targeting c-erb2 and other receptors of the c-erB family: rationale and clinical applications”, J Chemother; 16:52-54 Bingham,S.A., Luben, R., et al (2003), “Are imprecise methods obscuring a relation between fat and breast cancer?”, Lancet, 362; 9379; 212-214 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 62 - Boyd, N.F., Stone, J et al (2003), “Dietary fat and breast cancer risk revisited: a meta-analysis of the published literature”, Br J Cancer, 89; 9; 1672-85 10 Cho, H-S, Leahy DJ, (2002), “Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether”, Science 297, 1330-3 11 Cho, H S, Mason, K., Ramyar, K X., Stanley, A M., Gabelli, S B., Denney, D W., Jr., & Leahy, D J, (2003), “Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab”, Nature 421, 756-60 12 Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer (2002), “Breast cancer and breastfeeding: collaborative reanalysis of individual data from 47 epidemiological studies in 30 countries, including 50302 women with breast cancer and 96973 women without the disease”, Lancet, 360; 9328; 187-95 13 D Graus-Porta, R R Beerli, J M Daly, and N E Hynes, (1997), “ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling”, Embo J 16, 1647-55 14 Endogenous Hormones Breast Cancer Collaborative Group (2003), “Body Mass Index, Serum Sex Hormones, and Breast Cancer Risk in Postmenopausal Women”, JNCI Cancer Spectrum, 95; 16; 1218-1226 15 Feldman, A.M., Koch, W J & Force, T L (2007), “Developing strategies to link basic cardiovascular sciences with clinical drug development: another opportunity for translational sciences”, Clin Pharmacol Ther 81, 887-92 16 Hobday TJ; Perez EA, (2005), “Molecularly targeted therapies for breast cancer”, Cancer Control 12, 73-81 17 Hunter, D.J., and Willett , W.C (1993), “Diet, body size, and breast cancer”, Epidemiol Rev, 15; 1; 110-32.(55)Jeffrey S Ross and Jonathan A Fletcher, (1998), “The HER-2/neu Oncogene in Breast Cancer: Prognostic Factor, Predictive Factor, and Target for Therapy”, Stem Cells; 16; pp.413-428 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 63 - 18 Lawlor, D.A., Okasha, M et al (2003), “Associations of adult measures of childhood growth with breast cancer: findings from the British Women's Heart and Health Study”, Br J Cancer, 89; 1; 81-7 19 Linggi B, Carpenter G, (2006), “ErbB receptors: new insights on mechanisms and biology”, Trends Cell Biol; 16:649-656 20 Marchbanks PA, McDonald JA, Wilson HG, et al, (2002), “Oral contraceptives and the risk of breast cancer”, New England Journal of Medicine; 346(26):2025–2032 21 Morris, J K., Lin, W., Hauser, C., Marchuk, Y., Getman, D & Lee, K.-F, (1999), “Rescue of the cardiac defect in ErbB2 mutant mice reveals essential roles of ErbB2 in peripheral nervous system development”, Neuron 23, 273-83 22 Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J Biotechnol 74, 277 23 Muyldermans, S., Lauwereys, M (1999), “Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies”, J Mol Recognit 12:131-140 24 Philipp Holliger & Peter Hudson, (2005), “Engineered antibody fragment and the rise of single domains”, natural biotechnology, www.nature.com/naturebiotechnology 25 Steve G Whalen, and Michael P DiGiovanna, Athanassios Argiris, Chun-Xia Wang, (2004), “Synergistic Interactions between Tamoxifen and Trastuzumab (Herceptin)”, Yale Cancer Center, Vol 10, 1409–1420 26 Sundaresan S, Penuel E, Sliwkowski MX, (1999), “The biology of human epidermal growth factor receptor 2”, Curr Oncol Rep;1:16-22 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 64 - 27 Tokuda, Y, (2003), “Antibodies as molecular target-based therapy: trastuzumab”, Int J Clin Oncol 8:224-229 28 Weigelt B, Hu Z, He X, Livasy C, Carey LA, Ewend MG, Glas AM, Perou CM, Van't Veer LJ, (2005), “Molecular portraits and 70-gene prognosis signature are preserved throughout the metastatic process of breast cancer”, Cancer Res 65, 9155-8 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... dạng ung thư vú dương tính với HER2 tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu kháng nguyên Her2? ??’ Số hóa Trung tâm Học Liệu... VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn phƣơng Hoa NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2 Ngành: Sinh học Chuyên... 3.2.2 Biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 tế bào E coli BL 21(DE3)……………………………………… 45 3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2