Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên her2

Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) được xác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quần thể tế bào mà ở đó có biểu hiện những kháng nguyên hoặc thụ thể bề mặt đặc hiệu. Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết và làm tan tế bào ung thư vú biểu hiện quá mức HER2 một yếu tố phát triển biểu mô biểu hiện mạnh ở 25-30% bệnh nhân ung thư vú. ITs được tạo ra bằng việc kết hợp giữa 2 yếu tố : (1) chất gây độc (toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng đích theo các phương pháp hoá học (7) hoặc bằng công nghệ ADN tái tổ hợp. HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào. Cho đến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thể tạo dimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu. Sự khuếch đại gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào ung thư vú. Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư. Tính chất này làm cho HER2 trở thành một đích hữu hiệu để chẩn đoán sớm cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -2- Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới. Điều trị ung thư vú cũng như nhiều loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targeted effect). Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trường hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị thấp. Những nghiên cứu gần đây về các marker sinh học trong ung thư vú đã mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điều trị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhược điểm của các liệu pháp truyền thống. Một trong số thuốc có bản chất kháng thể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là HERCEPTIN. Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên Her2’’

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn phƣơng Hoa NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2 Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Quang Huấn Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………1 Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………… Khái niêm, phân loại ứng dụng immunotoxin……………………….3 1.2 Tình hình ung thƣ vú (UTV) giới Việt Nam 1.2.1.Trên giới 1.2.2.Ở Việt Nam 1.3 Giới thiệu ung thƣ vú……………………………………………………5 1.3.1 Khái niệm chung bệnh UTV 1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú 1.3.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán 1.3.4 Các phƣơng pháp điều trị 1.4 Kháng nguyên Her2 đặc hiệu tế ung thƣ vú 10 1.4.1 Khái quát kháng nguyên HER2 10 1.4.2 Cấu trúc HER2 11 1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2 11 1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2 11 1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 chế gây ung thƣ HER2….13 1.5 Khái quát chung kháng thể - Kháng thể đơn dòng 16 1.5.1 Cấu tạo chung kháng thể 16 1.5.2 Kháng thể đơn dòng 17 1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi - Mảnh kháng thể………………………… 17 1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng điều trị ung thƣ vú …19 1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin………………………………22 Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Sinh phẩm 23 2.1.2 Hoá chất .Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .Error! Bookmark not defined 2.2.1 Phƣơng pháp PCR……………………………………………….24 2.2.2 Cắt enzym giới hạn 26 2.2.3 Phƣơng pháp thiết kế vector biểu 26 2.2.4 Phƣơng pháp biến nạp 29 2.2.5 Phƣơng pháp biểu protein tái tổ hợp 30 2.2.6 Phƣơng pháp điện di protein gel polyacrylamide 31 2.2.7 Phƣơng pháp tính protein tái tổ hợp cột lực Ni2+ 32 2.2.8 Phƣơng pháp phân tích khối phổ 33 Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Thiết kế vector biểu pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch hermel 36 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 3.1.1 Cắt gen Hermel 36 3.1.2.Cắt vector pET-21A(+) 36 3.1.3 Gắn gen hermel vào vector pET-21A(+) chọn dòng plasmid tái tổ hợp……………………………………………………………………… 38 3.1.4 Xác định trình tự gen hermel ……………………………………Error! Bookmark not defined 3.2 Biểu tối ƣu hoá biểu gen hermel ………………………….Error! Bookmark not defined 3.2.1 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli BL21(DE3) .Er ror! Bookmark not defined 3.2.2 Biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 tế bào E coli BL 21(DE3)……………………………………… 45 3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 E coli 46 3.3.1.Ảnh hƣởng pH lên khả sinh tổng hợp độc tố miễn dịch herme 47 3.3.2 Ảnh hƣởng oxi lên khả biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………………………………………48 3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………………………………………50 3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy …………………………………………… Error! Bookmark not defined 3.3.5 Ảnh hƣởng IPTG………………………………………………….52 3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu……………………………………………54 3.3.7 Biểu protein tái tổ hợp hermel điều kiện thích hợp lựa chọn…………………………………………………………………………….55 3.4 Tinh sach protein tái tổ hợp hermel, khẳng định khối phổ xác đinh hoạt tính………………………………………………………… 56 3.4.1 Tinh protein tái tổ hợp HER2…………………………………… 56 3.4.2 Phân tích khối phổ protein tái tổ hợp…………………………………….57 3.4.3 Xác đinh hoạt tính protein hermel………………………………… 59 Kết luận kiến nghị ……………………………………………………… Error! Bookmark not defined Tài liệu tham khảo ……………………………………………………………Error! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn THUËT NGữ VIếT TắT Stt 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Ký hiệu Tên đầy đủ ADN Axit Deoxyribonucleic Amp Ampicillin bp Base pair (cặp bazơ nitơ) ddNTP Dideoxynucleotide dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid PE Pseudomonas exotoxin EtBr Ethidium Bromide HRP Horseradish peroxidase IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside IR Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn) Ka Kanamycin kDa Kilo Dalton LB M«i tr-êng Lauria Betani DT Diphtheria toxin LRR Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine) LTA Axit lipoteichoic NASBA Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa trình tự axit nucleic) OD PCR Optical Density (MËt ®é quang häc) SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA utv ung th- vó v/ph vßng/phót X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- β - D-galactopyranoside Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) S húa bi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -1- MỞ ĐẦU Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) xác định chất gây độc cho tế bào, tạo để giết cách chọn lọc quần thể tế bào mà có biểu kháng nguyên thụ thể bề mặt đặc hiệu Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết làm tan tế bào ung thư vú biểu mức HER2 yếu tố phát triển biểu mô biểu mạnh 25-30% bệnh nhân ung thư vú ITs tạo việc kết hợp yếu tố : (1) chất gây độc (toxins) có chất protein (2) tác nhân hướng đích theo phương pháp hố học (7) cơng nghệ ADN tái tổ hợp HER2 loại thụ thể thuộc họ yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng biệt hố tế bào Cho đến chưa tìm thấy ligand đặc hiệu HER2; nhiên tạo dimer với thân với thụ thể khác họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy đường truyền tín hiệu Sự khuếch đại gen HER2 nhiễm sắc thể 17 dẫn đến tăng biểu thụ thể HER2 bề mặt tế bào ung thư vú Biểu mức HER2 biến đổi tế bào thành dạng ác tính làm tăng trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có khuếch đại gen HER2 biểu mức gen tế bào ung thư Tính chất làm cho HER2 trở thành đích hữu hiệu để chẩn đốn sớm đích cơng liệu pháp điều trị miễn dịch Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -2- Ung thư vú hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao bệnh ung thư nữ giới Điều trị ung thư vú nhiều loại ung thư khác theo liệu pháp truyền thống hoá trị liệu xạ trị liệu hiệu tiêu diệt khối u cao lại có nhược điểm lớn, tác dụng lên quan bình thường xung quanh (non-targeted effect) Mặt khác, phương pháp đa phần áp dụng trường hợp khối u phát triển giai đoạn muộn nên có hiệu điều trị thấp Những nghiên cứu gần marker sinh học ung thư vú mở hướng điều trị mới, thông minh đầy triển vọng, liệu pháp điều trị cơng đích (targeted therapy), loại bỏ gần hoàn toàn nhược điểm liệu pháp truyền thống Một số thuốc có chất kháng thể đặc hiệu HER2 FDA chấp thuận để điều trị cho bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 giai đoạn cuối HERCEPTIN Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo kít chẩn đốn loại thuốc có hiệu điều trị cao dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu kháng nguyên Her2’’ Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... ung thư vú dương tính với HER2 chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu kháng nguyên Her2? ??’ Số hóa Trung tâm... biểu kháng nguyên thụ thể bề mặt đặc hiệu Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết làm tan tế bào ung thư vú biểu mức HER2 yếu tố phát triển biểu mô biểu mạnh 25-30% bệnh nhân ung thư. .. 3.2.2 Biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 tế bào E coli BL 21(DE3)……………………………………… 45 3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2