1. Khỏi niờm, phõn loại và ứng dụng của immunotoxin
2.2.4. Phƣơng phỏp biến nạp
Biến nạp là quỏ trỡnh chuyển ADN trực tiếp từ tế bào cho sang tế bào nhận. Cơ chế của biến nạp là vi khuẩn nhận nhận trực tiếp ADN từ thể cho. Những tế bào cú khả năng nhận ADN được gọi là tế bào khả biến.
Nguyờn tắc của phƣơng phỏp
Màng tế bào cú bản chất phospho lipid kộp, tớch điện õm, do đú sẽ cản trở sự di chuyển của cỏc plasmid ngoại lai cũng là những phõn tử tớch điện õm ở bề mặt. Khi xử lớ cỏc tế bào này với CaCl2, dưới tỏc dụng của Ca2+ sẽ che chắn cỏc gốc tớch điện õm ở trờn lỗ màng và đồng thời làm cho màng tế bào xốp hơn. Sau đú khi sốc nhiệt, màng tế bào gión nở đột ngột, lỗ màng mở rộng tạo điều kiện cho plasmid xõm nhập vào tế bào một cỏch dễ dàng.
Phƣơng phỏp thực hiện
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Lấy chủng tế bào E. coli BL21 được cất giữ ở -200C.
- Nuụi cấy 1% chủng tế bào trong 2 ml mụi trường LB lỏng, nuụi lắc ở 37oC, 200 v/ph qua đờm.
- Cấy chuyển 2% dịch nuụi tế bào qua đờm sang 2 ml mụi trường LB lỏng. Nuụi lắc ở 37oC, 200 v/ph trong 3 h đến OD600 đạt 0,5 - 0,6.
- Chuyển dịch tế bào sang ống Eppendorf vụ trựng, để trờn đỏ 10 phỳt. - Ly tõm thu sinh khối (4000 v/ph, 4oC trong 5 phỳt), loại dịch nổi. - Rửa cặn tế bào bằng 300 àl CaCl2.
- Ly tõm 4000 v/ph trong 5 phỳt, loại dịch nổi.
- Hoà lại tế bào trong 60 àl CaCl2, bỳng nhẹ cho tan hết tế bào. - Để ống tế bào trong đỏ ớt nhất 1 h trước khi sử dụng cho biến nạp.
- Lấy tế bào khả biến đó chuẩn bị để trờn đỏ.
- Lấy 2 àl plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2 cho vào tế bào khả biến để trờn đỏ khoảng 30 phỳt.
- Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giõy, sau đú đặt ngay ống tế bào vào đỏ và để 2 phỳt.
- Bổ sung 250 àl mụi trường LB, nuụi lắc 200 v/ph ở 37oC trong 1 giờ. - Cấy trải 150 àl dịch tế bào nuụi cấy trờn đĩa petri cú mụi trường thạch LB chứa 1% Amp (100 àg/ml).
- Nuụi ở tủ ấm ở 37oC qua đờm.