1. Khỏi niờm, phõn loại và ứng dụng của immunotoxin
1.5.5 Khỏng thể khỏng HER2 gắn Melitin
Một trong những liệu phỏp mới đang được quan tõm là sự kết hợp giữa phõn tử khỏng thể hướng đớch điều trị với phõn tử gõy độc tế bào. Độc tố miễn dịch (Its) kết quả của sự kết hợp này đang được hi vọng là sẽ mang lại hiệu quả cao hơn. Với hướng phỏt triển đú, chỳng tụi đó lựa chọn Melitin để tạo phõn tử đọc Its sử dụng trong điều trị ung thư vỳ. Melitin là một peptide gồm 26amino axid, chiếm 50% trọng lượng khụ của lọc độc ong, cú khả năng phỏ huỷ tế bào do phỏ vỡ cấu trỳc màng tế bào (8). Gen mó hoỏ độc tố miễn dich được tạo ra bằng cụng nghệ gen bao gồm phần mó hoỏ khỏng thể đơn chuỗi đặc hiệu HER2 và phần mó hoỏ melitin (Lờ Quang Huấn, 2004). (1)
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Sinh phẩm
Chủng E.coli TOP10 (Invitrogen) được sử dụng làm vật chủ trong thao tỏc ADN.
Chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) được sử dụng làm chủng biểu hiện. Vector tỏch dũng TOPO PCR 2.1
Vector biểu hiện pET21-a(+)
Cỏc enzyme giới hạn EcoRI, và NotI,
Anti-HER2F: 5’- TGGCGCCTCATGGACTGCCCTTACGGACCAAG- 3’
Anti-HER2R: 5’- ACCCGGGATCGGTÂCCAAGTACCTTGACC-3’
2.1.2. Húa chất và mụi trƣờng
Húa chất
Cỏc hoỏ chất tinh khiết được sử dụng trong cỏc nghiờn cứu sinh học phõn tử của BioLabs, Invitrogen, Novagen, Sigma, Fermentas và
Bioscience,... gồm:
- Cỏc húa chất dựng trong điện di polyacrylamid: Acrylamid, Bis- acrylamid Tris-HCl, Glycerol, SDS, APS, temed, …….
- Chất cảm ứng IPTG
- Cỏc húa chất dựng để tinh sạch protein: Guanidinium lysis buffer, Denaturing binding buffer, Denaturing wash buffer, Native wash buffer, Native elution buffer.
- LB lỏng: trypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%.
- LB đặc: trypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, agar 1,5%. Mụi trường được khử trựng ở 121oC, 0,8 atm trong 30 phỳt.
2.1.3. Thiết bị
Lũ vi súng (SamSung, Hàn Quốc) Mỏy li tõm (Eppendorf, Đức) Mỏy đo pH (Metter, Thuỵ Sĩ) Mỏy soi gel (Pharmacia, Mỹ) Mỏy PCR (Mỹ)
Mỏy lắc ổn nhiệt 37oC, 30oC, 28oC Cõn phõn tớch 10-4 g (Mettler Toledo) Cõn điện 10-1 g (Ohaus)
Tủ cấy vụ trựng (Sanyo, Nhật) Bộ điện di protein (Bio-Rad) Mỏy Vortex (Rotolab OSI) Mỏy đọc trỡnh tự (Mỹ) Tủ lạnh sõu (Sanyo, Nhật) Bể ổn nhiệt (Teche, OSI) Pipetman cỏc loại (Gilson) Bộ điện di ADN
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.2.1. PCR
Kỹ thuật PCR được Karl Mullis và cỏc cộng sự phỏt minh năm 1985 (giải Nobel hoỏ học năm 1993). Đõy là kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu in vitro
đoạn ADN nằm giữa hai đoạn trỡnh tự ADN đó biết (đoạn mồi). PCR là một phản ứng sinh húa phụ thuộc vào nhiệt độ, cú sự tham gia của một loại enzyme ADN polymerase chịu nhiệt và sử dụng nguyờn lý như quỏ trỡnh sao chộp ADN trong tự nhiờn.
Nguyờn tắc: Dựa trờn sự lai đặc hiệu giữa ADN mồi với ADN khuụn theo nguyờn tắc bổ sung và phản ứng kộo dài chuỗi của ADN polymerase
trong ống nghiệm (in vitro). Do đú từ một đoạn gen đó biết trước ta cú thể tổng hợp nờn số lượng lớn gen đú trong ống nghiệm.
Thành phần phản ứng, cỏc điều kiện về nhiệt độ và thời gian của toàn bộ quy trỡnh như sau:
Chương trỡnh thực hiện phản ứng PCR http://www.lrc-tnu.edu.vn Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ 0 ( C) Thời gian Chu kỳ 1 Thành phần Thể tớch (àl) Dung dịch đệm 10X dNTPs (10nM) MgCl2 (25nM) BSA 1X Primer F (10pM) Primer R (10pM) ADN mẫu
2.2.2. Cắt bằng enzyme giới hạn.
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt ADN plasmid bằng enzyme giới hạn
EcoRI:
Toàn bộ hỗn hợp trờn được giữ ở 370C, 4h.
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt ADN plasmid bằng enzyme giới hạn
NotI:
Ủ hỗn hợp 370C, thời gian 4h.
2.2.3. Phƣơng phỏp thiết kế vector biểu hiện
Thiết kế vector mang gen hermel: Vector pET-21a(+) được cắt bằng
hai enzyme giới hạn tại hai vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI và
Số húa bởi Trung tõm Học Liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thành phần Thể tớch (àl) ADN/Plasmid Dung dịch đệm 4 BSA NotI H20 Thành phần Thể tớch (àl) Plasmid Dung dịch đệm 2 EcoRI H20
NotI, gen mó hoỏ độc tố miễn dịch hermel trong vector tỏch dũng TOPO PCR 2.1 cũng được cắt bằng hai enzyme trờn. Sản phẩm cắt được tinh sạch và điện di trờn gel agarose 0.8%, sau đú được gắn vào vector biểu hiện pET-21a(+) bằng T4 ligase (BioLabs).
Sau khi gắn sản phẩm được biến nạp vào E.coli chủng TOP10. Cỏc khuẩn lạc mang vector tỏi tổ hợp được chọn lọc trờn đĩa mụi trường LB đặc cú bổ sung Apicilli (100 μg/ml) và được nuụi trong mụi trường LB lỏng (cú chứa ampicillin), Plasmid ADN sau đú được tỏch ra để kiểm tra sự cú mặt của gen mong muốn bằng PCR với cặp mồi Anti-Her2F và Anti-Her2R.
Sản phẩm thụi gel được gắn vào vector pET21a(+) cũng đó được cắt với 2 enzyme giới hạn EcoRI và NotI. Cỏc dũng tế bào cú chứa vector tỏi tổ hợp mang gen mó hoỏ độc tố miễn dịch được chọn lọc bằng cỏch so sỏnh kớch thước tương đối của ADN plasmid cũng như kết quả cắt kiểm tra bằng cỏc enzyme giới hạn EcoRI và NotI.
Kết quả này cũn được khẳng định bởi việc xỏc định trỡnh tự nucleotide của gen hermel sau khi được gắn vào vector biểu hiện pET21a(+) tại cỏc vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn EcolRI và NotI. Gen hermel chứa cỏc vựng chức năng cũng như mó mở đầu, mó kết thỳc theo đỳng thiết kế (xem phần phõn tớch trỡnh tự dưới đõy). Trỡnh tự gen hermel đó được đăng ký trong Ngõn hàng gen quốc tế với mó số: AM402973. Plasmid chứa gen hermel sau khi được xỏc định trỡnh tự được tinh sạch và biến nạp vào E.coli chủng Rosetta để biểu hiện gen tỏi tổ hợp ở nhiệt độ 37oC sau 4h cảm ứng với nồng độ 0.6 mM IPTG.
Plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2
Chủng E. coli BL21 (DE3)
Biến nạp
Chủng E. coli BL 21 (DE3) mang plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2 Biểu hiện Protein tỏi tổ hợp (độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2) Tinh sạch scFv đặc hiệu HER2
Hỡnh 2.1. Sơ đồ túm tắt quỏ trỡnh biểu hiện độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trong E. coli
Chỳ thớch: Biến nạp:
Biểu hiện:
- Làm tế bào khả biến (chủng E. coli BL 21 (DE3)) - Biến nạp plasmid tỏi tổ hợp vào tế bào khả biến - Cảm ứng bằng IPTG
- -
Xử lý mẫu
2.2.4. Phƣơng phỏp biến nạp
Biến nạp là quỏ trỡnh chuyển ADN trực tiếp từ tế bào cho sang tế bào nhận. Cơ chế của biến nạp là vi khuẩn nhận nhận trực tiếp ADN từ thể cho. Những tế bào cú khả năng nhận ADN được gọi là tế bào khả biến.
Nguyờn tắc của phƣơng phỏp
Màng tế bào cú bản chất phospho lipid kộp, tớch điện õm, do đú sẽ cản trở sự di chuyển của cỏc plasmid ngoại lai cũng là những phõn tử tớch điện õm ở bề mặt. Khi xử lớ cỏc tế bào này với CaCl2, dưới tỏc dụng của Ca2+ sẽ che chắn cỏc gốc tớch điện õm ở trờn lỗ màng và đồng thời làm cho màng tế bào xốp hơn. Sau đú khi sốc nhiệt, màng tế bào gión nở đột ngột, lỗ màng mở rộng tạo điều kiện cho plasmid xõm nhập vào tế bào một cỏch dễ dàng.
Phƣơng phỏp thực hiện
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Lấy chủng tế bào E. coli BL21 được cất giữ ở -200C.
- Nuụi cấy 1% chủng tế bào trong 2 ml mụi trường LB lỏng, nuụi lắc ở 37oC, 200 v/ph qua đờm.
- Cấy chuyển 2% dịch nuụi tế bào qua đờm sang 2 ml mụi trường LB lỏng. Nuụi lắc ở 37oC, 200 v/ph trong 3 h đến OD600 đạt 0,5 - 0,6.
- Chuyển dịch tế bào sang ống Eppendorf vụ trựng, để trờn đỏ 10 phỳt. - Ly tõm thu sinh khối (4000 v/ph, 4oC trong 5 phỳt), loại dịch nổi. - Rửa cặn tế bào bằng 300 àl CaCl2.
- Ly tõm 4000 v/ph trong 5 phỳt, loại dịch nổi.
- Hoà lại tế bào trong 60 àl CaCl2, bỳng nhẹ cho tan hết tế bào. - Để ống tế bào trong đỏ ớt nhất 1 h trước khi sử dụng cho biến nạp.
- Lấy tế bào khả biến đó chuẩn bị để trờn đỏ.
- Lấy 2 àl plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2 cho vào tế bào khả biến để trờn đỏ khoảng 30 phỳt.
- Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giõy, sau đú đặt ngay ống tế bào vào đỏ và để 2 phỳt.
- Bổ sung 250 àl mụi trường LB, nuụi lắc 200 v/ph ở 37oC trong 1 giờ. - Cấy trải 150 àl dịch tế bào nuụi cấy trờn đĩa petri cú mụi trường thạch LB chứa 1% Amp (100 àg/ml).
- Nuụi ở tủ ấm ở 37oC qua đờm.
2.2.5. Phƣơng phỏp biểu hiện
Cảm ứng mẫu
Nguyờn tắc:
Nuụi cấy cỏc thể biến nạp trong mụi trường cú chất cảm ứng promoter để protein tỏi tổ hợp cú thể được tổng hợp. Sau đú, kiểm tra protein tỏi tổ hợp bằng phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide để phỏt hiện băng protein tỏi tổ hợp.
Cỏch tiến hành:
• Lấy 1 khuẩn lạc chứa plasmid tỏi tổ hợp cho vào mụi trường LB lỏng chứa khỏng sinh thớch hợp, nuụi lắc 200 v/p, 37oC, qua đờm.
• Cấy chuyển sang mụi trường LB lỏng chứa khỏng sinh thớch hợp với tỷ lệ chủng là 2%.
• Nuụi lắc 200 v/p, 37oC đến khi đạt OD600 thớch hợp.
• Thu mẫu trước cảm ứng, sau đú bổ sung vào dịch nuụi chất cảm ứng IPTG với nồng độ thớch hợp.
Nuụi với chế độ và thời gian thớch hợp cho sự biểu hiện. Thu mẫu sau cảm ứng.
2.2.6. Phƣơng phỏp điện di protein trờn gel polyacrylamid
Nguyờn tắc:
Phức hợp protein-SDS thu được sau khi biến tớnh protein bằng SDS cú điện tớch õm chỉ phụ thuộc vào kớch thước của protein mà khụng phụ thuộc vào trỡnh tự của protein đú. Nhờ đú, hỗn hợp protein sau khi biến tớnh cú thể chuyển động trong điện trường theo chiều từ cực õm đến cực dương và tỏch ra thành cỏc băng theo kớch thước trờn gel polyacrylamid.
Protein trong gel polyacrylamide được phỏt hiện bằng cỏch nhuộm với Coomasie Brilliant Blue (CBB) và quan sỏt bằng mắt thường.
Cỏch tiến hành:
Chuẩn bị gel polyacrylamid:
• Gel phõn tỏch: H2O Tris-HCl (pH = 8; 3M) Acrylamide Glycerol APS.10% SDS.10% Temed • Gel cụ mẫu: H2O Tris-HCl (pH = 6,8 M ; 0,5 M) 3,125 ml 0,625 ml 2,1 ml 1 ml 25 àl 25 àl 4 àl 1,385 ml 0,625 ml 0,425 ml
APS.10% SDS.10% Temed 25 àl 12,5 àl 3 àl
• Xử lý mẫu: Hỳt 1 ml dịch sau phản ứng ly tõm 12.000 v/p, thu cặn tế bào. Hũa lại trong 40 àl H2O + 10 àl SDS Sample, biến tớnh ở 100oC trong 5 phỳt.
• Tra mẫu: Lấy 15 àl dịch protein đó biến tớnh tra vào mỗi giếng.
• Chạy điện di: Điện di theo chiều thẳng đứng với cường độ dũng điện 40 mA, trong thời gian khoảng 40 phỳt.
Nhuộm bản gel: Bằng dung dịch CBB được pha trong dung dịch tẩy gel. Sau đú tẩy bản gel và xỏc định kết quả.
2.2.7. Phƣơng phỏp tinh sạch protein tỏi tổ hợp bằng cột ỏi lực Ni2+
Cột sắc ký ỏi lực Ni2+ được thiết kế để tinh sạch protein tỏi tổ hợp cú chứa 6 gốc histidine. Đõy là đuụi Histag được mó húa bởi cỏc bộ 3 mó húa nằm trờn vector do nhà sản xuất thiết kế cú ỏi lực mạnh đối với Ni2+. Cú thể dựng cột sắc ký ỏi lực Nikel resin để tinh sạch những protein tỏi tổ hợp được biểu hiện trong nhiều loại vật chủ khỏc nhau.
Qui trỡnh:
• Ly tõm thu cặn tế bào từ 50 ml mụi trường.
• Bổ sung 8 ml Guanidin Lysis Buffer (6 M Guanidin hydrochloride, Sodium phosphate 20 nM, pH 7.8, NaCl 500 mM), vortex nhẹ.
• Dựng siờu õm để phỏ tế bào trong 5 phỳt.
• Ly tõm 5.000 v/p, thu dịch nổi để chuyển lờn cột Ni. Đảo đều trong 30 phỳt ở nhiệt độ phũng. Cố định cột theo chiều thẳng đứng cho dịch chảy ra từ từ.
• Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Binding Buffer (8 M Urea; 20 mM Sodium phosphate pH = 7,8; NaCl 500 mM).
• Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Wash Buffer (8 M Urea; Sodium phosphate 20 mM pH = 6; NaCl 500 mM).
• Rửa cột 4 lần bằng 8 ml Native Wash Buffer (Native Purification Buffer và Imidazole pH = 6).
• Thu protein scFv đặc hiệu Her2 bằng 6 ml Native Elution Buffer, thu 6 phõn đoạn mỗi phõn đoạn 1 ml.
2.2.8.Phƣơng phỏp phõn tớch khối phổ
Chức năng của mỏy khối phổ :
Thụng thường sau khi biểu hiện một gen người ta cú thể thu được một protein. Nếu dừng ở mức độ điện di trờn gel acrylamid thỡ ta chỉ biết được về khối lượng của protein theo cỏc băng và khụng thể khẳng định một cỏch chắc chắn rằng băng đú, theo lý thuyết trựng với khối lượng protein cần biểu hiện, chớnh là protein mong muốn. Làm weston blot cú thể khẳng định chắc chắn hơn. Tuy nhiờn, khụng phải mọi protein đều cú khỏng thể hoặc khỏng nguyờn tương ứng, hoặc nếu cú thỡ phải mất nhiều cụng sức, thời gian gõy miễn dịch, tinh chế khỏng nguyờn... để dựng cho weston blot. Phương phỏp phõn tớch khối phổ cú thể xỏc định khối lượng và trỡnh tự protein.
Cấu tạo : Mỏy gồm một đĩa đựng mẫu, mỏy bắn laser, một ống trũn đảo chiều điện cực liờn tục và detector.
Hỡnh 2.2. Mụ hỡnh mỏy phõn tớch khối phổ
Nguyờn tắc hoạt động của mỏy khối phổ : Đầu tiờn protein được tinh chế theo quy trỡnh, cắt bằng enzyme trypsin rồi đưa vào mỏy. Enzyme trypsin
cắt polypeptide tại những điểm nhất định trờn chuỗi (giống enzyme giới hạn ở cỏc nucleic acid). Vỡ ta biết trước trỡnh tự protein quan tõm nờn cú thể dự đoỏn được cỏc mảnh polypeptide sau khi bị cắt.
Đưa mẫu đó xử lý trypsin vào đĩa và cho mỏy chạy. Laser bắn vào đĩa sẽ ion húa cỏc mảnh peptide (làm cho chỳng tớch điện dương) và làm cho chỳng bật ra, bay vào ống. Ống này cú chiều dài nhất định, 4 phớa gắn hai loại điện cực (+) và (-) và ống cú thể xoay trũn, do đú cỏc điện cực đổi chiều liờn tục làm cho cỏc mảnh polypeptide khụng bỏm được vào thành mà bay theo chiều xoắn ốc. Vận tốc bay của một mảnh polypeptide phụ thuộc vào hai yếu tố là điện tớch (z) và khối lượng (m) của nú. Mỏy khối phổ đo được thời gian, biết trước quóng đường nờn tớnh được vận tốc, từ đú xỏc định được chỉ số m/z của mảnh polypeptide. Cỏc tớn hiệu được phỏt hiện bởi detector và khuếch đại, cuối cựng biểu diễn trờn đồ thị ở dạng cỏc đỉnh (pick). Mỗi đỉnh tương ứng với một mảnh polypeptide.
Đú là với mỏy MS, cũn đối với mỏy MS/MS thỡ đõy mới là MS thứ nhất, cho phộp hiển thị cỏc mảnh của một polypeptide bị cắt bằng trypsin. Lần MS thứ hai cho phộp khẳng định chắc chắn 1 mảnh nhất định nhờ hệ thống lọc. Ta cú thể thiết lập chương trỡnh sao cho mỏy loại bỏ tất cả cỏc mảnh khỏc và chỉ cho phộp cỏc mảnh mong muốn đi qua.
Phõn tớch kết quả :
- Thứ nhất : Từ m/z của cỏc đoạn polypeptide cú kớch thước đủ nhỏ,
người ta cú thể xỏc định trước cỏc trỡnh tự đú và lập thành cơ sở dữ liệu (database). Vỡ protein bao gồm 20 amino acid cú khối lượng khỏc nhau do đú khối lượng của một trỡnh tự đủ nhỏ núi lờn được trỡnh tự của nú. (Giả sử Valin cú khối lượng là 3, methionine là 5 thỡ một mảnh cú khối lượng là 8 sẽ cú trỡnh tự Valin-Methionine hoặc Methionine-Valin) - Thứ hai là phổ cắt của đoạn polypeptide cũng cú ý nghĩa
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET-21A(+) MANG GEN MÃ HOÁ ĐỘC TỐ MIấN DỊCH HERMEL
3.1.1. Cắt gen Hermel.
Nguyờn liệu ban đầu gen mó hoỏ độc tố miễn dịch Hermel trong vector tỏch dũng PCR2.1- TOPO do nhúm nghiờn cứu phũng cụng Nghệ tế bào động vật, viện Cụng Nghệ Sinh học cung cấp được cắt bằng 2 enzyme giới hạn
EcoRI và NotI. Sản phẩm cắt được kiểm tra trờn gel agarose (Hỡnh 3.1A) sau đú gen Hermel được tinh sạch thu lại từ gel agarose, kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch thể hiện trờn hỡnh 3.1B. M1 1 M2 2 900 bp scFv 700 bp A B
Hỡnh 3.1. Kết quả cắt thu gen Hermel với 2 đầu dớnh bổ sungcủa 2 enzyme EcoRI