1. Khỏi niờm, phõn loại và ứng dụng của immunotoxin
3.3.6 Khảo sỏt thời gian thu mẫu
Để lựa chọn được thời điểm mà tại đú lượng protein được tổng hợp cao nhất, chỳng tụi đó tiến hành khảo sỏt thời gian thu mẫu khỏc nhau (sau 3, 4 và 12 h thu mẫu). Tế bào E. coli mang plasmid tỏi tổ hợp HER2 được nuụi cấy trong bỡnh nuụi cấy dưới cỏc điều kiện lựa chọn ở trờn. Sau 3, 4 và 12 h thu mẫu một lần và kết quả được phõn tớch bằng điện di trờn gel polyacrylamid.
kDa 1 2 3 4
35 25
34,47 kDa
18
Hỡnh 3.14. Lượng protein tỏi tổ hợp_HER2 được tổng hợp theo thời gian
1: thang protein chuẩn; 2-4: lượng protein tỏi tổ hợp tại cỏc thời điểm 4, 3 và 12 h.
Kết quả điện di trờn hỡnh 3.14 cho thấy, thu mẫu sau 3 h và 12 h cho lượng protein ớt hơn. Cũn thu mẫu sau 4 h cho lượng protein nhiều nhất. Bởi vậy, chỳng tụi chọn thời điểm tại 4 h sau khi cảm ứng để thu mẫu.
3.3.7. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP HERMEL Ở CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐÃ LỰA CHỌN
Sau khi đó lựa chọn cỏc điều kiện nuụi cấy thớch hợp, tiến hành biểu hiện chủng E. coli BL21 mang plasmid tỏi tổ hợp HER2 trong bỡnh nuụi cấy với cỏc điều kiện đó lựa chọn được (pH mụi trường là 7,4; nồng độ Amp là 100 àg/ml; nồng độ IPTG là 3 mM; nhiệt độ nuụi cấy là 37 oC; 4 h sau cảm ứng sẽ thu mẫu). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 66 43 35 34,47 25 kDa 18 14
Hỡnh 3.15. Điện di độc tố miễn dịch Hermel trờn gel polyacrylamid 12,5%
1: mẫu trước cảm ứng, 2-9: mẫu sau cảm ứng, 10: thang protein chuẩn
Kết quả hỡnh 3.15 cho thấy băng protein ở kớch thước 34,47 kDa xuất hiện rất đậm ở cỏc giếng số 2 – 9. Chứng tỏ chủng biểu hiện tốt ở cỏc điều kiện nuụi cấy đó lựa chọn được.
3.4. TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP HERMEL, KHẲNG ĐỊNH BẰNG KHỐI PHỔ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH.
3.4.1. TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP HER2
Protein tỏi tổ hợp sau khi biểu hiện thành cụng vẫn bị lẫn cỏc protein khỏc. Để thu được protein tinh sạch, chỳng tụi đó tiến hành tinh sạch protein tỏi tổ hợp bằng cột sắc ký ỏi lực Ni2+ (như phần phương phỏp).
Để tinh sạch protein này, chỳng tụi sử dụng 900 àl dịch phỏ tế bào (thực hiện phỏ tế bào tương tự như bước điện di protein), bổ sung vào đú 240
àl dung dịch chứa hạt Ni-NTA Magnetic Agarose 5%. Hỗn hợp này được ủ lắc 1h nhằm tạo điều kiện cho cỏc protein chứa đuụi His-tag liờn kết với hạt Ni-NTA, sau đú hỗn hợp được đưa lờn giỏ từ trong 1 phỳt rồi loại dịch nổi. Cặn thu được chớnh là phức protein-hạt Ni-NTA, để loại bỏ hoàn toàn protein khụng đặc hiệu (khụng liờn kết với hạt Ni-NTA), rửa cặn thờm vài lần bằng đệm rửa (Wash Buffer), rồi loại dịch nổi. Sau đú bổ sung đệm tỏch (Elution Buffer), đảo đều, ủ trờn giỏ từ rồi thu dịch nổi. Dịch nổi chớnh là dung dịch protein cần tinh sạch, do Elution Buffer cú tỏc dụng phỏ vỡ liờn kết giữa protein và hạt Ni-NTA.
Dịch protein sau khi tinh sạch được đem chạy điện di trờn gel polyarylamide Tricine-SDS-Page.
Kết quả điện di trờn hỡnh 3.16 cho thấy chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kớch thước 34,47 kDa chứng tỏ đó tinh sạch thành cụng protein tỏi tổ hợp HER2.
Để khẳng định chắc chắn kết quả thu được là độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 chỳng tụi đó tiếp tục tiến hành khối phổ nhận diện trỡnh tự axit amin.
kDa 1 2 3 4 5 6 66 43 35 25 34,47 kDa 18 14
Hỡnh 3.16. Điện di độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trờn gel polyacrylamid
3.4.2. PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ PROTEIN TÁI TỔ HỢP.
Sử dụng độc tố miễn dịch đặc hiệu HER2 đó tinh sạch trờn cột Ni-NTA để phõn tớch cấu trỳc bậc nhất bằng khối phổ. Trong quỏ trỡnh phõn tớch protein (khỏng thể) được xử lý với trypsin. Theo lý thuyết, trypsin sẽ cắt protein tại cỏc vị trớ axit amin R (Arginine) và K (Lysine). Kết quả phõn tớch thực tế chỳng tụi nhận được đó chứng minh sản phẩm biểu hiện và tinh sạch cú cấu trỳc bậc nhất (trỡnh tự amino axit) là phự hợp với trỡnh tự tớnh toỏn lý thuyết. Khi so sỏnh với cỏc dữ liệu trong Ngõn hàng dữ liệu quốc tế thỡ sản phẩm mà chỳng tụi nhận được chứa cỏc đoạn peptide thuộc trỡnh tự của khỏng thể khỏng HER2 (hoặc tờn gọi khỏc là anti-Erbb2).
Kết quả nhận diện cỏc đoạn peptide khi phõn tớch khối phổ được trỡnh bày tại cỏc bảng 3.1, bảng 3.2, bảng 3.3 và bảng 3.4.
Bảng 3.1. Đoạn peptide được nhận diện là LLIYSASYR 1. gi|22219205
Mass: 23797 Total score: 44 Peptides matched: 4
Chain L, Crystal Structure Of The Anti-Erbb2 Fab2c4
Check to include this hit in error tolerant search or archive report
Query
Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Rank Peptide
11 12 13 14 543.51 543.52 543.52 543.52 1085.00 1085.02 1085.02 1085.03 1084.59 1084.59 1084.59 1084.59 0.41 0.43 0.43 0.44 0 0 0 0 (12) 44 (11) (7) 7 1 2 3 LLIYSASYR LLIYSASYR LLIYSASYR LLIYSASYR
Bảng 3.2. Đoạn peptide được nhận diện là FTLSEIK 2. gi | 45 02 74 7
Mass: 43149 Total score: 43 Peptides matched: 3
cyclin-dependent kinase 9 [Homo sapiens] Check to
include this hit in error
tolerant search or archive report
Query Observed
Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Rank Peptide
3 4 5 419.39 419.39 419.40 836.76 836.77 836.78 836.46 836.46 836.46 0.30 0.31 0.32 0 0 0 43 (22) (23) 1 1 1 FTLSEIK FTLSEIK FTLSEIK
Bảng 3.3. Đoạn peptide được nhận diện là FTLSVDR
3.
gi|
222
192
06
Mass: 23925 Total score: 43 Peptides matched: 3
Chain H, Crystal Structure Of The Anti-Erbb2 Fab2c4
Check to include this hit in error tolerant search or archive report
111 374 44
immunoglobulin heavy chain variable region [Homo sapiens]
Quer y Obse rved
Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Rank
Peptide
24 677.11 1352.20 1352.68 -0.48 0 39 1 NTLYLQMDSLR
Đến đõy chỳng tụi cú thể khẳng định đó thu nhận thành cụng độc tố miễn dịch đặc hiệu HER2.
Số húa bởi Trung tõm Học Liệu – Đại học Thỏi Nguyờn
3.4.3. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN HERMEL
Để kiểm tra tớnh đặc hiệu của khỏng thể với khỏng nguyờn HER2, chỳng tụi đó tiến hành kiểm tra bằng phản ứng ELISA. Kết quả ELISA được thể hiện trờn bảng 3.5 và hỡnh 3.50
Bảng 3.5. Kết quả xỏc định 0,14 ELISA của sản phẩm scFv sau
khi tinh sạch trờn cột Ni-NTA
0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 Series1 ĐC(-) ĐC (+) scFv scFv/10 Hỡnh 3.17. Kết quả ELISA sản phẩm scFv
1. Đối chứng õm là giếng khụng chứa sản phẩm scFv
2. Đối chứng dương là dung dịch khỏng thể khỏng HER2 (100 ng/ml) của Hóng Genscrip
3. scFv là dung dịch sau tinh sạch (100 ng/ml) 4. scFv/10 là dung dịch sau tinh sạch (10 ng/ml)
Kết quả ELISA cho thấy độc tố miễn dịch sau tinh sạch cú khả năng nhận biết và liờn kết đặc hiệu với khỏng nguyờn HER2 tương đương với đối chứng dương (khỏng thể đặc hiệu HER2 của Hóng Genscrip). Kết quả này cho phộp một lần nữa khẳng định khỏng thể đặc hiệu khỏng nguyờn HER2 đó thu được cú khả năng nhận biết và liờn kết đặc hiệu với khỏng nguyờn HER2 tương đương với sản phẩm của hóng Genscrip khi kiểm tra bằng ELISA.
http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mẫu
OD450nm-650nm ĐC(-)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đó thiết kế thành cụng vector biểu hiện gen hermel mó hoỏ độc tố miễn dịch bao gồm phần mó hoỏ khỏng thể nhận biết thụ thể HER2 trong ung thư vỳ và phần mó hoỏ peptide làm tan tế bào mellitin.
2. Đó biểu hiện thành cụng gen hermel trong E.coli chủng BL21DE3 ở nhiệt độ 37oC sau khi cảm ứng 0,6 mM IPTG.
3. Đó nghiờn cứu tối ưu húa cỏc điều kiện biểu hiện gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trong E. coli. Chủng biểu hiện tốt nhất ở cỏc điều kiện: pH mụi trường là 7,4; nồng độ Amp là 100
àg/ml; nồng độ IPTG là 3 mM; nhiệt độ nuụi cấy là 37oC; 4 h sau cảm ứng sẽ thu mẫu.
4. Đó tinh sạch thành cụng khỏng thể tỏi tổ hơp đặc hiệu HER2, độc tố miễn dịch thu được cú độ tinh sạch rất cao sau khi tinh sạch trờn cột ỏi lực NiKel và khẳng định bằng kết quả phõn tớch khối phổ.
5. Xỏc định hoạt tớnh Hermel liờn kết đặc hiệu khỏng nguyờn HER2 tương đương khỏng thể chuẩn.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiờn cứu điều kiện tinh sạch khỏng thể tỏi tổ hợp ở quy mụ lớn hơn để thu nhận đủ lượng khỏng thể tỏi tổ hợp phục vụ cho cỏc nghiờn cứu sõu hơn về tỏc dụng dược lý.
2. Nghiờn cứu thử nghiệm và ứng dụng khỏng thể khỏng HER2 trong chẩn đoỏn và điều trị ung thư vỳ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Thanh Dịu, Ló Thị Huyền, Phạm Như Trọng, Lờ Quang Huấn, (2007), Tỏch dũng và xỏc định trỡnh tự gen HER2/neu đặc hiệu ung thư vỳ, Hội nghị Khoa học và sự sống, Đại Học Quy Nhơn, 10/8/2007, Tr. 668-671.
2. Phạm Văn Ty (2001), Miễn dịch học, NXB ĐHQG Hà Nội, Tr. 39-59. 3. Đỏi Duy Ban, Trương Nam Hải, Đinh Duy Khỏng, Lờ Thị Minh Chớnh và Lờ Thanh Hũa, (2006), Sinh học phõn tử của ung thư vỳ. NXB Khoa học kĩ thuật.
4. Nguyễn Bỏ Đức, (2001), Bài giảng ung thư học lõm sàng, NXB Y học, Hà Nội. 5. Lờ Trần Bỡnh, Phan Văn Chi, Nụng Văn Hải, Trương nam Hải, Lờ Quang Huấn (2003), Áp dụng cỏc kic thuật phõn tử trong nghiờn cứu tài nguyờn sinh vật Việt Nam, NXB khoa học và kĩ thuật.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
5. Andrechek, E. R., Hardy, W. R., Siegel, P. M., Rudnicki, M. A., Cardiff, R. D.,
Muller, W. J, (2000), “Amplification of the neu/erbB-2 oncogene in a mouse model of mammary tumorigenesis”, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 3444-9. 6. Berrington de Gonzalez, A., and Darby, S (11/28/2007), “Risk of cancer from diagnostic X-rays”.
7. Bianco AR, (2004), “Targeting c-erb2 and other receptors of the c-erB family: rationale and clinical applications”, J Chemother; 16:52-54.
8. Bingham,S.A., Luben, R., et al (2003), “Are imprecise methods obscuring a relation between fat and breast cancer?”, Lancet, 362; 9379; 212-214.
9. Boyd, N.F., Stone, J. et al (2003), “Dietary fat and breast cancer risk revisited: a meta-analysis of the published literature”, Br J Cancer, 89; 9; 1672-85.
10. Cho, H-S, Leahy DJ, (2002), “Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether”, Science 297, 1330-3.
11. Cho, H. S, Mason, K., Ramyar, K. X., Stanley, A. M., Gabelli, S. B., Denney,
D. W., Jr., & Leahy, D. J, (2003), “Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab”, Nature 421, 756-60.
12. Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer (2002), “Breast cancer and breastfeeding: collaborative reanalysis of individual data from 47 epidemiological studies in 30 countries, including 50302 women with breast cancer and 96973 women without the disease”, Lancet, 360; 9328; 187-95. 13. D Graus-Porta, R R Beerli, J M Daly, and N E Hynes, (1997), “ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling”, Embo J 16, 1647-55.
14. Endogenous Hormones Breast Cancer Collaborative Group (2003), “Body Mass Index, Serum Sex Hormones, and Breast Cancer Risk in Postmenopausal Women”, JNCI Cancer Spectrum, 95; 16; 1218-1226.
15. Feldman, A.M., Koch, W. J & Force, T. L (2007), “Developing strategies to link basic cardiovascular sciences with clinical drug development: another opportunity for translational sciences”, Clin Pharmacol Ther 81, 887-92. 16. Hobday TJ; Perez EA, (2005), “Molecularly targeted therapies for breast cancer”, Cancer Control 12, 73-81.
17. Hunter, D.J., and Willett , W.C (1993), “Diet, body size, and breast cancer”,
Epidemiol Rev, 15; 1; 110-32.(55)Jeffrey S. Ross and Jonathan A. Fletcher, (1998), “The HER-2/neu Oncogene in Breast Cancer: Prognostic Factor, Predictive Factor, and Target for Therapy”, Stem Cells; 16; pp.413-428.
18. Lawlor, D.A., Okasha, M. et al (2003), “Associations of adult measures of childhood growth with breast cancer: findings from the British Women's Heart and Health Study”, Br J Cancer, 89; 1; 81-7.
19. Linggi B, Carpenter G, (2006), “ErbB receptors: new insights on mechanisms and biology”, Trends Cell Biol; 16:649-656.
20. Marchbanks PA, McDonald JA, Wilson HG, et al, (2002), “Oral
contraceptives and the risk of breast cancer”, New England Journal of Medicine; 346(26):2025–2032.
21. Morris, J. K., Lin, W., Hauser, C., Marchuk, Y., Getman, D. & Lee, K.-F, (1999), “Rescue of the cardiac defect in ErbB2 mutant mice reveals essential roles of ErbB2 in peripheral nervous system development”, Neuron 23, 273-83.
22. Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J. Biotechnol. 74, 277.
23. Muyldermans, S., Lauwereys, M (1999), “Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies”, J. Mol. Recognit. 12:131-140.
24. Philipp Holliger & Peter Hudson, (2005), “Engineered antibody fragment and the rise of single domains”, natural biotechnology,
www.nature.com/naturebiotechnology.
25. Steve G. Whalen, and Michael P. DiGiovanna, Athanassios Argiris, Chun-Xia Wang, (2004), “Synergistic Interactions between Tamoxifen and Trastuzumab (Herceptin)”, Yale Cancer Center, Vol. 10, 1409–1420.
26. Sundaresan S, Penuel E, Sliwkowski MX, (1999), “The biology of human epidermal growth factor receptor 2”, Curr Oncol Rep;1:16-22.
27. Tokuda, Y, (2003), “Antibodies as molecular target-based therapy: trastuzumab”, Int. J. Clin. Oncol. 8:224-229.
28. Weigelt B, Hu Z, He X, Livasy C, Carey LA, Ewend MG, Glas AM, Perou CM, Van't Veer LJ, (2005), “Molecular portraits and 70-gene prognosis signature are preserved throughout the metastatic process of breast cancer”, Cancer Res 65, 9155-8.