1. Khỏi niờm, phõn loại và ứng dụng của immunotoxin
3.1.4. Xỏc định trỡnh tự gen hermel.
Chỳng tụi sử dụng plasmid tỏi tổ hợp làm khuụn cho phản ứng xac định trỡnh tự với mồi T7F(R) xuụi hoặc ngược, sau đú tinh sạch sản phẩm, làm khụ trong mỏy speed-vac. Mẫu được đem xỏc định trỡnh tự nucleotide trờn mỏy xỏc định trỡnh tự ABI PRISMR 3100-Avant Genetic Analyzer (ABI, Mỹ) tại Viện Cụng nghệ sinh học. Kết quả thể hiện trờn hỡnh 3.6.
1 H
M A S M T G G Q Q M G R G S E F D M D
1 catatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggctccGAATTCGATATGGAC
1 10 20 30 40 50 21 C P Y G P K K K R K V G G Q I Q M T Q S 61 TGCCCTTACGGACCAAAGAAAAAGAGGAAGGTAGGTGGACAGATCCAAATGACTCAGTCA 61 70 80 90 100 110 41 P S S V S A S V G D R V T I T C K A S Q 121 CCATCTTCTGTATCTGCTTCAGTCGGAGATAGGGTTACAATCACTTGCAAAGCCTCACAA 121 130 140 150 160 170 61 D V S I G V A W Y Q Q K P G K A P K L L 181 GATGTCTCAATAGGTGTCGCATGGTATCAACAGAAACCTGGTAAGGCCCCTAAGTTGTTG 181 190 200 210 220 230 81 I Y S A S Y R Y T G V P S R F S G S G S 241 ATCTACTCAGCCTCATACAGATACACCGGAGTACCATCAAGGTTCTCAGGTTCTGGATCA 241 250 260 270 280 290 101 G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y 301 GGTACTGACTTTACCTTGACCATTTCATCATTGCAGCCAGAGGATTTTGCAACCTATTAT 301 310 320 330 340 350
361 TGCCAGCAATACTACATCTACCCTTACACCTTCGGACAAGGAACAAAAGTTGAGATTAAG 361 370 380 390 400 410 141 S S G G G G S G G G G S G G E V Q L V E 421 TCATCAGGTGGAGGAGGTTCAGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGTGAAGTACAATTAGTCGAA 421 430 440 450 460 470 161 S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G 481 TCAGGAGGTGGTTTGGTTCAACCTGGAGGATCATTAAGGTTGTCTTGTGCAGCATCTGGT 481 490 500 510 520 530 181 F T F T D Y T M D W V R Q A P G K G L E 541 TTCACATTCACCGATTACACAATGGATTGGGTTAGACAGGCCCCTGGAAAGGGTTTGGAG 541 550 560 570 580 590 201 W V A D V N P N S G G S I Y N Q R F K G 601 TGGGTCGCCGACGTCAACCCTAATTCTGGTGGATCAATCTATAACCAGAGATTCAAGGGA 601 610 620 630 640 650 221 R F T L S V D R S K N T L Y L Q M N S L 661 AGGTTCACCTTGTCAGTGGATAGGTCTAAGAACACCTTGTATTTGCAGATGAACTCATTG 661 670 680 690 700 710 241 R A E D T A V Y Y C A R N L G P S F Y F 721 AGGGCTGAGGATACAGCCGTTTACTACTGTGCCAGAAATTTGGGACCTTCTTTCTACTTC 721 730 740 750 760 770 261 D Y W G Q G T L V T V S S G I G A V L K 781 GACTACTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACCGTATCTTCAGGTATTGGAGCTGTATTGAAA 781 790 800 810 820 830 281 V L T T G L P A L I S W I K R Q R Q Q H 841 GTCTTAACCACCGGTTTGCCTGCCTTGATATCTTGGATCAAGAGGCAGAGGCAGCAGCAC 841 850 860 870 880 890 301 H H H H H A A A L E H H H H H H * 901 CACCATCATCACCATGCGGCCGCactcgagcaccaccaccaccaccactga 901 910 920 930 940 950
Hỡnh 3.6. Trỡnh tự gen Hermel trong vector pET-21a(+) và trỡnh tự axit amin suy diễn của protein tỏi tổ hợp Hermel
Sau khi xỏc định trỡnh tự, chỳng tụi thu được kết quả trỡnh tự gen mó húa độc tố miễn dịch Hermel hoàn toàn trựng khớp với thiết kế cú chứa cỏc vựng chức năng như mó khởi đầu, mó kết thỳc,... Phõn tử protein suy diễn từ
trỡnh tự nucleotide thu được cho thấy gen Hermel đó được gắn đỳng chiều, đỳng khung đọc và khớp với cỏc yếu tố cần thiết cho quỏ trỡnh phiờn mó và dịch mó tạo ra protein tỏi tổ hợp. Đồng thời phõn tử protein tạo ra cũng cú chứa 6 gốc His giỳp cho việc tinh sạch mảnh độc tố miễn dịch được dễ dàng. Theo tớnh toỏn lý thuyết, phõn tử protein thu được sẽ cú kớch thước là 34,47 kDa. Đến đõy chỳng tụi cú thể khẳng định đó thiết kế thành cụng vector biểu hiện pET-21a(+)/Hermel.
3.2 BIỂU HIỆN VÀ TỐI ƢU HOÁ BIỂU HIỆN GEN HERMEL 3.2.1 biến nạp plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/hermel vào tế bào E. coli
BL21(DE3)
Vector biểu hiện pET-21a(+) là vector được thiết kế cho việc biểu hiện cỏc gen ngoại lai trong vi khuẩn E. coli với nhiều ưu điểm. Vector này được rất nhiều phũng thớ nghiệm trờn thế giới cũng như trong nước sử dụng trong việc sản xuất protein tỏi tổ hợp.
E. coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram õm được ưa chuộng nhất trong sản xuất protein tỏi tổ hợp. Một trong những lý do là vỡ những thao tỏc kỹ thuật với E. coli khỏ dễ dàng và chuẩn húa ở mọi phũng thớ nghiệm. Thụng thường, tất cả cỏc chủng E. coli dựng trong biểu hiện đều xuất phỏt từ chủng E. coli
K-12 hay B. Trong đề tài này, chỳng tụi đó chọn chủng E. coli BL21(DE3) làm chủng biểu hiện.
Để tạo ra chủng vi khuẩn cú khả năng sản xuất khỏng thể tỏi tổ hợp đặc hiệu HER2 gắn mellitin, trước hết plasmid tỏi tổ hợp phải được đưa vào chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3). Cú rất nhiều phương phỏp đó được ỏp dụng như phương phỏp xung điện, phương phỏp biến nạp,… Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi tiến hành theo phương phỏp biến nạp đưa plasmid tỏi tổ hợp vào tế bào E. coli dưới tỏc dụng của nhiệt và ion Ca2+. Sau khi biến nạp
dịch nuụi cấy được trải trờn đĩa mụi trường LB thạch cú bổ sung chất khỏng sinh Ampicillin 100 àg/ml và nuụi ở 37oC qua đờm. Kết quả biến nạp được thể hiện ở hỡnh 3.7.
Hỡnh 3.7. Kết quả biến nạp plasmid tỏi tổ hợp vào E. coli BL21
Từ kết quả biến nạp, ta thấy trờn đĩa mụi trường nuụi cấy cú khỏng sinh chọn lọc xuất hiện nhiều khuẩn lạc, những khuẩn lạc này chớnh là cỏc dũng tế bào E. coli BL21 mang vector tỏi tổ hợp. Những khuẩn lạc này được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu hiện protein ngoại lai.
3.2.2. Biểu hiện gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trong E. coli
3 khuẩn lạc phỏt triển tốt đỏnh số 1, 2 và 3 được chọn và nuụi cấy hoạt húa trong mụi trường LB lỏng qua đờm ở 37oC, nuụi lắc 200 vũng/phỳt.
Theo hướng dẫn của hóng Novagen (hóng cung cấp vector pET), điều kiện biểu hiện ban đầu được đưa ra là cảm ứng bằng IPTG ở nồng độ 1 mM, nuụi lắc 37oC, sau 4 h protein sẽ được biểu hiện. Để thu được lượng tế bào
cần thiết cho quỏ trỡnh biểu hiện nờn chỳng tụi đó hũa dịch nuụi cấy qua đờm vào mụi trường LB lỏng theo tỷ lệ 4% và nuụi cấy ở cựng điều kiện trờn trong khoảng 3 h rồi đem đo OD600 đạt khoảng 1,8 thỡ bổ sung IPTG vào mụi
trường nuụi cấy với nồng độ cuối cựng đạt 1 mM. Sau 4 h thu mẫu và chạy điện di trờn gel polyacrylamid để kiểm tra kết quả. Dưới đõy hỡnh 3.8 là hỡnh ảnh điện di để kiểm tra kết quả biểu hiện gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn HER2 trong E. coli.
Chất cảm ứng IPTG rất cần thiết cho việc khởi đầu tổng hợp protein. IPTG làm cho operon Lac chuyển từ trạng thỏi bất hoạt sang trạng thỏi hoạt động và protein được tổng hợp. Theo như tớnh toỏn lý thuyết khỏng thể tỏi tổ hợp đặc hiệu khỏng nguyờn HER2 cú kớch thước là 34.47kDa. Trờn hỡnh 3.8 cho thấy xuất hiện băng protein ở cỏc giếng số 1, 2 và 3 cú kớch thước nằm ở khoảng giữa 25 và 35 kDa mà ở giếng 6 (mẫu khụng cảm ứng) khụng thấy xuất hiện băng này. Để chắc chắn rằng độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 được biểu hiện chỳng tụi đó so sỏnh với mẫu nuụi cựng (khụng bổ sung IPTG) và kết quả hỡnh 11 cho thấy ở mẫu này khụng xuất hiện băng protein trờn. Mặc dự mức độ biểu hiện của gen tỏi tổ hợp cũn thấp, nhưng chỳng tụi cú thể kết luận rằng sơ bộ đó biểu hiện thành cụng độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trong E. coli. Để cú thể thu được lượng khỏng thể tỏi tổ hợp lớn hơn, chỳng tụi tiến hành tối ưu sự biểu hiện của gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trong chủng vi khuẩn E. coli
BL21(DE3).
1 2 3 4 5 6 kDa
66 43
34,47 kDa
Hỡnh 3.8. Điện di kiểm tra kết quả biểu hiện độc tố miễn dịch Hermel
1-3: mẫu sau cảm ứng của khuẩn lạc số 1-3, 4: thang protein chuẩn, 5: mẫu nuụi cựng, 6: mẫu trước cảm ứng
3.3 NGHIấN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HểA ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYấN HER2 TRONG E. COLI
Với mục đớch thu được lượng lớn độc tố miễn dịch HER2, chủng E. coli
chứa plasmid tỏi tổ hợp được nuụi cấy trong cỏc điều kiện (pH mụi trường, hàm lượng oxy, nồng độ khỏng sinh, nhiệt độ nuụi cấy, nồng độ IPTG) khỏc nhau để lựa chọn được điều kiện nuụi cấy thớch hợp nhất.
3.3.1. Ảnh hƣởng của pH lờn khả năng sinh tổng hợp độc tố miễn dịch Hermel
Cỏc loài vi sinh vật khỏc nhau cú thể sinh trưởng tốt trong mụi trường cú pH khỏc nhau. Hầu hết cỏc vi khuẩn cú pH tối thiểu là pH = 4 và pH cực đại là pH = 9, pH thớch hợp là vào khoảng giữa 6 và 8. Trong nghiờn cứu này, chủng E. coli BL21 mang plasmid tỏi tổ hợp được nuụi cấy trong 4 bỡnh nuụi
cấy ở cựng điều kiện nuụi cấy (như mụ tả trong phần phương phỏp) với cựng loại mụi trường LB lỏng nhưng cú pH khỏc nhau (pH 6,0; 7,0; 7,4; và pH 8). Sau 4 h cảm ứng với IPTG, tế bào ở cỏc bỡnh nuụi cấy được thu lại để kiểm tra hàm lượng protein bằng điện di polyacrylamid.
kDa 1 2 3 4 5
66 43 35
25 34,47 kDa
Hỡnh 3.9. Ảnh hưởng của pH mụi trường đến khả năng biểu hiện độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2
1: Thang protein chuẩn. 2-5: lượng protein ở cỏc giỏ trị pH 6,0; 7,0; 7,4 và 8,0.
Kết quả hỡnh 3.9 cho thấy, pH mụi trường cú ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng biểu hiện độc tố miễn dịch Hermel của chủng E. coli
BL21. Mẫu nuụi cấy với pH mụi trường là 8 cú băng protein mờ nhất hay lượng protein thu được là thấp nhất. Ngược lại với cỏc mẫu cú pH mụi trường là 6,0; 7,0 và 7.4 thỡ băng protein cú kớch thước xuất hiện đậm hơn so với băng protein ở pH là 8. Tuy nhiờn, chỳng tụi đó chọn pH = 7,4 (pH mụi
trường LB) để biểu hiện gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2.
3.3.2. Ảnh hƣởng của oxy lờn khả năng biểu hiện của gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2
Hàm lượng oxy cú ảnh hưởng khỏ lớn tới sự sinh trưởng cũng như khả năng biểu hiện protein của cỏc chủng vi khuẩn. Hơn nữa, E. coli là chủng vi sinh vật hiếu khớ. Vỡ vậy, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt để lựa chọn độ thoỏng khớ thớch hợp cho chủng E. coli BL21 tổng hợp được hàm lượng độc tố miễn dịch Hermel cao nhất.
Thớ nghiệm được làm như sau: chủng E. coli BL21 được nuụi cấy trong 3 bỡnh nuụi cấy cú tỷ lệ mụi trường nuụi cấy / dung tớch nuụi cấy (mt/dt) lần lượt là: 1/5; 1/10 và 1/25.
Sau 4 h cảm ứng với IPTG, tế bào ở cỏc ống nuụi được thu lại để kiểm tra hàm lượng protein bằng điện di polyacrylamid.
66 43
35 34,47 kDa 25
18
Hỡnh 3.10. Ảnh hưởng của oxy đến khả năng biểu hiện của khỏng thể tỏi tổ hợp đặc hiệu HER2
1: thang protein chuẩn. 2-4: lượng protein ở cỏc bỡnh nuụi cấy cú tỷ lệ mụi trường/ dung tớch là 1/5; 1/10 và 1/25.
Kết quả ở hỡnh 3.10 cho thấy, ứng với mỗi nồng độ oxy khỏc nhau, thỡ hàm lượng độc tố miễn dịch Hermel được tổng hợp khỏc nhau. Ở mẫu cú độ thoỏng khớ là cao nhất (bỡnh cú tỷ lệ mt/dt là 1/25) thỡ ta thấy rằng khụng biểu hiện được protein tỏi tổ hợp. Cũn ở 2 mẫu nuụi trong bỡnh cú tỷ lệ mt/dt là 1/10 và 1/25 thỡ ta thấy xuất hiện băng protein với kớch thước là 34.47 ứng với độc tố miễn dịch Hermel. Tuy vậy, mẫu cú nồng độ oxy thấp nhất cú băng protein là đậm nhất ứng với hàm lượng protein tỏi tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất.
Từ kết quả trờn cho thấy rằng với lượng oxy nhiều thỡ khụng biểu hiện được protein tỏi tổ hợp này. Trong quỏ trỡnh thiết kế gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2, gen này đó được gắn một đoạn gen gõy
độc. Khi lượng oxy được cung cấp nhiều dẫn đến sự tăng sinh của tế bào xảy ra mạnh mẽ, lượng protein tỏi tổ hợp được tổng hợp nhiều. Nhưng đến một khoảng thời gian nhất định, do gen độc tố được tổng hợp nhiều dẫn đến sự chết đồng loạt của cỏc tế bào. Nờn trong trường hợp này protein tỏi tổ hợp khụng biểu hiện được.
3.3.3. Khảo sỏt nồng độ khỏng sinh
Trong mụi trường nuụi cấy ban đầu, ampicillin (Amp) được coi là ỏp lực chọn lọc đối với những dũng tỏi tổ hợp mang gen khỏng Amp. Vỡ thế, chỉ tế bào chứa plasmid tỏi tổ hợp cú mang gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 mới cú khả năng sinh trưởng trong mụi trường cú Amp. Để tỡm ra nồng độ Amp thớch hợp nhất cho quỏ trỡnh sinh tổng hợp protein chỳng tụi đó tiến hành khảo sỏt nồng độ Amp thớch hợp trong mụi trường nuụi cấy. Chủng E. coli được nuụi cấy trong 3 bỡnh nuụi cấy ở cựng điều kiờn (như phần phương phỏp), pH = 7,4; chỉ khỏc ở nồng độ Amp trong mụi trường (100 àg/ml, 150 àg/ml và 200 àg/ml).
Kết quả điện di trờn hỡnh 3.11 cho thấy, trong mụi trường cú nồng độ Amp là 100 àg/ml, 150 àg/ml và 200 àg/ml thỡ khả năng biểu hiện protein tỏi tổ hợp là như nhau. Vỡ vậy, chỳng tụi đó chọn nồng độ Amp thấp nhất là nồng độ thớch hợp để biểu hiện chủng này.
66 43 35 34,47 kDa 25 18
Hỡnh 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ Amp đến khả năng biểu hiện của độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2
1-3: Lượng protein ở nồng độ Amp 100 àg/ml, 150 àg/ml và 200 àg/ml. 4: thang protein chuẩn
3.3.4. Khảo sỏt nhiệt độ nuụi cấy
Ngoài cỏc yếu tố kể trờn, thỡ yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và biểu hiện độc tố miễn dịch Hermel của chủng đú là nhiệt độ nuụi cấy. Nghiờn cứu khả năng biểu hiện của chủng E. coli BL21 mang
plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2 ở cỏc nhiệt độ nuụi cấy khỏc nhau 28oC, 30oC và 37oC trong cựng điều kiện nuụi cấy (như mụ tả trong phần phương phỏp kết hợp với cỏc điều kiện đó lựa chọn được ở trờn).
66 43 35 25 18 34,47 kDa 14
Hỡnh 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy đến khả năng biểu hiện protein tỏi tổ hợp Hermel
1-2; 4: lượng protein ở nhiệt độ 28oC, 30oC và 37oC, 3: thang protein chuẩn
Kết quả ở hỡnh 3.12 cho thấy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả năng biểu hiện độc tố miễn dịch Hermel của chủng nghiờn cứu. Ở nhiệt độ 28oC và 30oC khụng thấy xuõt hiện băng protein ở kớch thước 34,47 kDa, chứng tỏ độc tố miễn dịch Hermel khụng được tổng hợp ở nhiệt độ nuụi cấy này. Cũn ở nhiệt độ nuụi cấy là 37oC thỡ đó biểu hiện được độc tố miễn dịch Hermel.
3.3.5. Ảnh hƣởng của IPTG
IPTG (isopropyl β - D- thiogalactoside) là chất cảm ứng đối với T7 lac promoter. Promoter này điều khiển trực tiếp quỏ trỡnh biểu hiện gen mó húa độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2. Vỡ vậy, IPTG cú tỏc động trực tiếp và rất lớn đến khả năng tổng hợp độc tố miễn dịch Hermel. IPTG cú giỏ thành rất cao nờn việc khảo sỏt cỏc nồng độ IPTG thấp hơn để giảm chi phớ là điều rất cần thiết. Vỡ vậy trong nghiờn cứu này, chỳng tụi đó nghiờn cứu ảnh
hưởng của dải nồng độ IPTG từ 1 – 3 mM. Chủng E. coli BL21 mang plasmid tỏi tổ hợp HER2 được nuụi cấy trong cựng điều kiện (như mụ tả trong phần phương phỏp kết hợp với cỏc điều kiện đó lựa chọn được ở trờn). Cỏc thớ nghiệm này chỉ khỏc nhau ở nồng độ IPTG được sử dụng để cảm ứng là 1 mM, 2 mM và 3 mM. 1 2 3 4 kDa 66 43 35 34,47 kDa 25 18 14
Hỡnh 3.13. Ảnh hưởng của IPTG đến khả năng biểu hiện của độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2
1-3: lượng protein được tổng hợp ở nồng độ IPTG 1mM, 2mM và 3 mM. 4: thang protein chuẩn
Kết quả hỡnh 3.13 cho thấy, IPTG cú ảnh hưởng rất lớn đến sự biểu hiện protein tỏi tổ hợp HER. Lượng protein tăng dần với nồng độ IPTG. Ở nồng độ IPTG là 3 mM cho băng protein là đậm nhất hay lượng protein tỏi tổ
hợp được tổng hợp nhiều nhất. Do vậy, đó chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG là 3 mM.
3.3.6. Khảo sỏt thời gian thu mẫu
Để lựa chọn được thời điểm mà tại đú lượng protein được tổng hợp cao nhất, chỳng tụi đó tiến hành khảo sỏt thời gian thu mẫu khỏc nhau (sau 3, 4 và 12 h thu mẫu). Tế bào E. coli mang plasmid tỏi tổ hợp HER2 được nuụi cấy trong bỡnh nuụi cấy dưới cỏc điều kiện lựa chọn ở trờn. Sau 3, 4 và 12 h thu mẫu một lần và kết quả được phõn tớch bằng điện di trờn gel polyacrylamid.
kDa 1 2 3 4
35 25
34,47 kDa
18
Hỡnh 3.14. Lượng protein tỏi tổ hợp_HER2 được tổng hợp theo thời gian