1. Khỏi niờm, phõn loại và ứng dụng của immunotoxin
2.2.6. Phƣơng phỏp điện di protein trờn gel polyacrylamide
Nguyờn tắc:
Phức hợp protein-SDS thu được sau khi biến tớnh protein bằng SDS cú điện tớch õm chỉ phụ thuộc vào kớch thước của protein mà khụng phụ thuộc vào trỡnh tự của protein đú. Nhờ đú, hỗn hợp protein sau khi biến tớnh cú thể chuyển động trong điện trường theo chiều từ cực õm đến cực dương và tỏch ra thành cỏc băng theo kớch thước trờn gel polyacrylamid.
Protein trong gel polyacrylamide được phỏt hiện bằng cỏch nhuộm với Coomasie Brilliant Blue (CBB) và quan sỏt bằng mắt thường.
Cỏch tiến hành:
Chuẩn bị gel polyacrylamid:
• Gel phõn tỏch: H2O Tris-HCl (pH = 8; 3M) Acrylamide Glycerol APS.10% SDS.10% Temed • Gel cụ mẫu: H2O Tris-HCl (pH = 6,8 M ; 0,5 M) 3,125 ml 0,625 ml 2,1 ml 1 ml 25 àl 25 àl 4 àl 1,385 ml 0,625 ml 0,425 ml
APS.10% SDS.10% Temed 25 àl 12,5 àl 3 àl
• Xử lý mẫu: Hỳt 1 ml dịch sau phản ứng ly tõm 12.000 v/p, thu cặn tế bào. Hũa lại trong 40 àl H2O + 10 àl SDS Sample, biến tớnh ở 100oC trong 5 phỳt.
• Tra mẫu: Lấy 15 àl dịch protein đó biến tớnh tra vào mỗi giếng.
• Chạy điện di: Điện di theo chiều thẳng đứng với cường độ dũng điện 40 mA, trong thời gian khoảng 40 phỳt.
Nhuộm bản gel: Bằng dung dịch CBB được pha trong dung dịch tẩy gel. Sau đú tẩy bản gel và xỏc định kết quả.
2.2.7. Phƣơng phỏp tinh sạch protein tỏi tổ hợp bằng cột ỏi lực Ni2+
Cột sắc ký ỏi lực Ni2+ được thiết kế để tinh sạch protein tỏi tổ hợp cú chứa 6 gốc histidine. Đõy là đuụi Histag được mó húa bởi cỏc bộ 3 mó húa nằm trờn vector do nhà sản xuất thiết kế cú ỏi lực mạnh đối với Ni2+. Cú thể dựng cột sắc ký ỏi lực Nikel resin để tinh sạch những protein tỏi tổ hợp được biểu hiện trong nhiều loại vật chủ khỏc nhau.
Qui trỡnh:
• Ly tõm thu cặn tế bào từ 50 ml mụi trường.
• Bổ sung 8 ml Guanidin Lysis Buffer (6 M Guanidin hydrochloride, Sodium phosphate 20 nM, pH 7.8, NaCl 500 mM), vortex nhẹ.
• Dựng siờu õm để phỏ tế bào trong 5 phỳt.
• Ly tõm 5.000 v/p, thu dịch nổi để chuyển lờn cột Ni. Đảo đều trong 30 phỳt ở nhiệt độ phũng. Cố định cột theo chiều thẳng đứng cho dịch chảy ra từ từ.
• Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Binding Buffer (8 M Urea; 20 mM Sodium phosphate pH = 7,8; NaCl 500 mM).
• Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Wash Buffer (8 M Urea; Sodium phosphate 20 mM pH = 6; NaCl 500 mM).
• Rửa cột 4 lần bằng 8 ml Native Wash Buffer (Native Purification Buffer và Imidazole pH = 6).
• Thu protein scFv đặc hiệu Her2 bằng 6 ml Native Elution Buffer, thu 6 phõn đoạn mỗi phõn đoạn 1 ml.
2.2.8.Phƣơng phỏp phõn tớch khối phổ
Chức năng của mỏy khối phổ :
Thụng thường sau khi biểu hiện một gen người ta cú thể thu được một protein. Nếu dừng ở mức độ điện di trờn gel acrylamid thỡ ta chỉ biết được về khối lượng của protein theo cỏc băng và khụng thể khẳng định một cỏch chắc chắn rằng băng đú, theo lý thuyết trựng với khối lượng protein cần biểu hiện, chớnh là protein mong muốn. Làm weston blot cú thể khẳng định chắc chắn hơn. Tuy nhiờn, khụng phải mọi protein đều cú khỏng thể hoặc khỏng nguyờn tương ứng, hoặc nếu cú thỡ phải mất nhiều cụng sức, thời gian gõy miễn dịch, tinh chế khỏng nguyờn... để dựng cho weston blot. Phương phỏp phõn tớch khối phổ cú thể xỏc định khối lượng và trỡnh tự protein.
Cấu tạo : Mỏy gồm một đĩa đựng mẫu, mỏy bắn laser, một ống trũn đảo chiều điện cực liờn tục và detector.
Hỡnh 2.2. Mụ hỡnh mỏy phõn tớch khối phổ
Nguyờn tắc hoạt động của mỏy khối phổ : Đầu tiờn protein được tinh chế theo quy trỡnh, cắt bằng enzyme trypsin rồi đưa vào mỏy. Enzyme trypsin
cắt polypeptide tại những điểm nhất định trờn chuỗi (giống enzyme giới hạn ở cỏc nucleic acid). Vỡ ta biết trước trỡnh tự protein quan tõm nờn cú thể dự đoỏn được cỏc mảnh polypeptide sau khi bị cắt.
Đưa mẫu đó xử lý trypsin vào đĩa và cho mỏy chạy. Laser bắn vào đĩa sẽ ion húa cỏc mảnh peptide (làm cho chỳng tớch điện dương) và làm cho chỳng bật ra, bay vào ống. Ống này cú chiều dài nhất định, 4 phớa gắn hai loại điện cực (+) và (-) và ống cú thể xoay trũn, do đú cỏc điện cực đổi chiều liờn tục làm cho cỏc mảnh polypeptide khụng bỏm được vào thành mà bay theo chiều xoắn ốc. Vận tốc bay của một mảnh polypeptide phụ thuộc vào hai yếu tố là điện tớch (z) và khối lượng (m) của nú. Mỏy khối phổ đo được thời gian, biết trước quóng đường nờn tớnh được vận tốc, từ đú xỏc định được chỉ số m/z của mảnh polypeptide. Cỏc tớn hiệu được phỏt hiện bởi detector và khuếch đại, cuối cựng biểu diễn trờn đồ thị ở dạng cỏc đỉnh (pick). Mỗi đỉnh tương ứng với một mảnh polypeptide.
Đú là với mỏy MS, cũn đối với mỏy MS/MS thỡ đõy mới là MS thứ nhất, cho phộp hiển thị cỏc mảnh của một polypeptide bị cắt bằng trypsin. Lần MS thứ hai cho phộp khẳng định chắc chắn 1 mảnh nhất định nhờ hệ thống lọc. Ta cú thể thiết lập chương trỡnh sao cho mỏy loại bỏ tất cả cỏc mảnh khỏc và chỉ cho phộp cỏc mảnh mong muốn đi qua.
Phõn tớch kết quả :
- Thứ nhất : Từ m/z của cỏc đoạn polypeptide cú kớch thước đủ nhỏ,
người ta cú thể xỏc định trước cỏc trỡnh tự đú và lập thành cơ sở dữ liệu (database). Vỡ protein bao gồm 20 amino acid cú khối lượng khỏc nhau do đú khối lượng của một trỡnh tự đủ nhỏ núi lờn được trỡnh tự của nú. (Giả sử Valin cú khối lượng là 3, methionine là 5 thỡ một mảnh cú khối lượng là 8 sẽ cú trỡnh tự Valin-Methionine hoặc Methionine-Valin) - Thứ hai là phổ cắt của đoạn polypeptide cũng cú ý nghĩa
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET-21A(+) MANG GEN MÃ HOÁ ĐỘC TỐ MIấN DỊCH HERMEL
3.1.1. Cắt gen Hermel.
Nguyờn liệu ban đầu gen mó hoỏ độc tố miễn dịch Hermel trong vector tỏch dũng PCR2.1- TOPO do nhúm nghiờn cứu phũng cụng Nghệ tế bào động vật, viện Cụng Nghệ Sinh học cung cấp được cắt bằng 2 enzyme giới hạn
EcoRI và NotI. Sản phẩm cắt được kiểm tra trờn gel agarose (Hỡnh 3.1A) sau đú gen Hermel được tinh sạch thu lại từ gel agarose, kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch thể hiện trờn hỡnh 3.1B. M1 1 M2 2 900 bp scFv 700 bp A B
Hỡnh 3.1. Kết quả cắt thu gen Hermel với 2 đầu dớnh bổ sungcủa 2 enzyme EcoRI và NotI tương ứng.
M1, M2: Chỉ thị phõn tử ADN 100 bp và 1 kb tương ứng (Fermentas), 1: Sản phẩm cắt vector tỏch dũng chứa gen Hermel bằng enzyme EcoRI và NotI, 2: Sản phẩm
Từ hỡnh ảnh điện di, ta thấy sản phẩm cắt ngoài băng của vector pCR2.1-TOPO cũn xuất hiện một băng cú kớch thước tương đương với kớch thước gen Hermel. Như vậy, dưới tỏc dụng của cỏc enzyme giới hạn, gen mó húa cho độc tố miễn dịch Hermel đó được cắt rời ra khỏi vector tỏch dũng và cú hai đầu dớnh tương ứng của hai enzyme giới hạn đó thiết kế sẵn sàng cho việc gắn vào vector biểu hiện. Tuy nhiờn, để thu được đoạn gen Hermel tinh sạch cú hai đầu dớnh, chỳng tụi cắt thu vựng gel agarose chứa băng ADN
Hermel và tiến hành tinh sạch thu đoạn gen Hermel bằng kit QIAGEN. Kết quả lượng ADN Hermel thu được với hai đầu bổ sung được tạo bởi hai enzyme EcoRI và NotI đảm bảo cho phản ứng tiếp theo.
3.1.2. CẮT VECTOR pET-21A(+)
Vector biểu hiện được sử dụng là vector pET-21a(+), đõy là vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli với nhiều ưu điểm đặc biệt. Nú cú chứa promotor T7 điều khiển sự phiờn mó cho gen antiHER2 với mức độ tương đối cao trong tế bào E. coli. Bản đồ của vector này cú vựng cắt gắn đa vị (Multiple Cloning Site - MCS) chứa nhiều điểm cắt giới hạn trong đú cú chứa một điểm cắt của
EcoRI và NotI. Ngoài ra, nú cũn cú đuụi His-Tag giỳp thuận tiện trong tinh sạch protein tỏi tổ hợp. Túm lại, đõy là một hệ vector khỏ tiện ớch trong việc biểu hiện cỏc protein ngoại lai.
Vector này được xử lý với hai enzyme giới hạn EcoRI và NotI. Ở đõy, mục đớch của chỳng tụi là thu được vector pET-21a(+) mở vũng và cú hai đầu dớnh lần lượt bổ sung với hai đầu dớnh của gen mó húa cho anti-HER2 Hermel đó xử lý ở trờn. Sản phẩm sau khi cắt bằng hai enzyme giới hạn được điện di trờn gel agarose và thu nhận lại bằng kit QIAgen. Kết quả thu được thể hiện trờn hỡnh 3.2.
Vector
1 M
6 kb
pET-21a(+)
5 kb
Hỡnh 3.2. Hỡnh ảnh điện di vector pET-21a(+) sau khi cắt mở vũng với 2 enzyme EcoRI và NotI
M: Chỉ thị phõn tử ADN 1 kb (Fermentas), 1: vector pET-21a(+) sau khi cắt mở vũng với 2 enzyme EcoRI và NotI
3.1.3 GẮN GEN HERMEL VÀO PET-21a(+) VÀ CHỌN DềNG PLASMID TÁI TỔ HỢP.
Đoạn gen Hermel sẽ được gắn vào vector tỏch dũng pET-21a(+) bằng enzyme T4 ligase (BioLabs) phương phỏp như đó trỡnh bày ở mục 2.2.
Sau khi gắn, sản phẩm được biến nạp vào chủng E. coli TOP10, nhờ bộ mỏy tổng hợp của tế bào vi khuẩn. Cỏc khuẩn lạc mang vector tỏi tổ hợp được chọn lọc bằng cỏch nuụi chủng E. coli TOP10 trờn mụi trường LB đặc cú bổ sung Ampicillin (100 μg/ml). Sau khi biến nạp trờn đĩa mụi trường LB thạch cú bổ sung Amp, chỳng tụi thu được cỏc khuẩn lạc riờng rẽ. Trong cỏc khuẩn lạc này chắc chắn cú chứa vector pET-21a(+) do trong vector này cú chứa gen khỏng Amp nờn tế bào cú chứa pET-21a(+) thỡ mới tồn tại được trờn mụi trường Amp.
Hỡnh 3.3. Hỡnh ảnh đĩa petri cú chứa khuẩn lạc sau khi biến nạp
Để chọn được vector tỏi tổ hợp mang gen mong muốn chỳng tụi tiến hành nuụi 5 khuẩn lạc, sau đú tiến hành tỏch thu ADN plasmid. Sản phẩm được điện di kiểm tra cựng với vector pET-21a(+) gốc. Kết quả được thể hiện ở hỡnh 3.4:
1 2 3 4 G 5
Hỡnh 3.4. Ảnh điện di plasmid tỏch từ cỏc khuẩn lạc và vector pET-21a(+) gốc
1 – 5: plasmid tỏch từ khuẩn lạc 1-5 G: vector pET-21a(+) gốc
Theo nguyờn tắc điện di, phõn tử ADN nào cú kớch thước càng lớn thỡ di chuyển càng chậm, trờn ảnh chụp quan sỏt được, nếu ADN cú kớch thước lớn sẽ tạo thành băng ADN cao hơn so với cỏc phõn tử ADN cú kớch thước nhỏ hơn. Vector biểu hiện tỏi tổ hợp ngoài phần gốc vector cũn gắn thờm đoạn gen mó húa cho mảnh khỏng thể anti-HER2 theo thiết kế nờn khi di chuyển sẽ chậm hơn vector gốc pET-21a(+). Quan sỏt trờn kết quả điện di hỡnh 3.4, chỳng tụi nhận thấy cú sự chờnh lệch ở cỏc đường chạy cỏc plasmid tỏch từ khuẩn lạc và plasmid gốc. Cỏc băng của plasmid từ khuẩn lạc số 1 đến số 4 là cao hơn cỏc băng của plasmid gốc. Do đú, cú khả năng cỏc plasmid này chớnh là vector biểu hiện mang gen Hermel. Để khẳng định điều này chỳng tụi tiến hành cắt kiểm tra dũng plasmid số 2 với 2 enzyme EcoRI và
NotI. Kết quả thể hiện trờn hỡnh 3.5.
M 1 2
Hỡnh 3.5. Kiểm tra kết quả chọn dũng plasmid tỏi tổ hợp mang gen Hermel.
M: Chỉ thị phõn tử ADN 1: Gen Hermel
Trờn ảnh điện di cú thể thấy, dũng plasmid số 2 sau khi xử lý với 2 enzyme EcoRI và NotI, ngoài băng vector, xuất hiện thờm 1 băng cú kớch thước đỳng là kớch thước gen Hermel. Như vậy, cú thể khẳng định sơ bộ là chỳng tụi đó đưa được gen mong muốn vào vector biểu hiện. Tuy nhiờn, để khẳng định chắc chắn đú chớnh là đoạn gen Hermel đồng thời kiểm tra chiều và khung đọc của gen trong vector biểu hiện, chỳng tụi tiến hành xỏc định trỡnh tự gen.
3.1.4 Xỏc định trỡnh tự gen Hermel
Chỳng tụi sử dụng plasmid tỏi tổ hợp làm khuụn cho phản ứng xac định trỡnh tự với mồi T7F(R) xuụi hoặc ngược, sau đú tinh sạch sản phẩm, làm khụ trong mỏy speed-vac. Mẫu được đem xỏc định trỡnh tự nucleotide trờn mỏy xỏc định trỡnh tự ABI PRISMR 3100-Avant Genetic Analyzer (ABI, Mỹ) tại Viện Cụng nghệ sinh học. Kết quả thể hiện trờn hỡnh 3.6.
1 H
M A S M T G G Q Q M G R G S E F D M D
1 catatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggctccGAATTCGATATGGAC
1 10 20 30 40 50 21 C P Y G P K K K R K V G G Q I Q M T Q S 61 TGCCCTTACGGACCAAAGAAAAAGAGGAAGGTAGGTGGACAGATCCAAATGACTCAGTCA 61 70 80 90 100 110 41 P S S V S A S V G D R V T I T C K A S Q 121 CCATCTTCTGTATCTGCTTCAGTCGGAGATAGGGTTACAATCACTTGCAAAGCCTCACAA 121 130 140 150 160 170 61 D V S I G V A W Y Q Q K P G K A P K L L 181 GATGTCTCAATAGGTGTCGCATGGTATCAACAGAAACCTGGTAAGGCCCCTAAGTTGTTG 181 190 200 210 220 230 81 I Y S A S Y R Y T G V P S R F S G S G S 241 ATCTACTCAGCCTCATACAGATACACCGGAGTACCATCAAGGTTCTCAGGTTCTGGATCA 241 250 260 270 280 290 101 G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y 301 GGTACTGACTTTACCTTGACCATTTCATCATTGCAGCCAGAGGATTTTGCAACCTATTAT 301 310 320 330 340 350
361 TGCCAGCAATACTACATCTACCCTTACACCTTCGGACAAGGAACAAAAGTTGAGATTAAG 361 370 380 390 400 410 141 S S G G G G S G G G G S G G E V Q L V E 421 TCATCAGGTGGAGGAGGTTCAGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGTGAAGTACAATTAGTCGAA 421 430 440 450 460 470 161 S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G 481 TCAGGAGGTGGTTTGGTTCAACCTGGAGGATCATTAAGGTTGTCTTGTGCAGCATCTGGT 481 490 500 510 520 530 181 F T F T D Y T M D W V R Q A P G K G L E 541 TTCACATTCACCGATTACACAATGGATTGGGTTAGACAGGCCCCTGGAAAGGGTTTGGAG 541 550 560 570 580 590 201 W V A D V N P N S G G S I Y N Q R F K G 601 TGGGTCGCCGACGTCAACCCTAATTCTGGTGGATCAATCTATAACCAGAGATTCAAGGGA 601 610 620 630 640 650 221 R F T L S V D R S K N T L Y L Q M N S L 661 AGGTTCACCTTGTCAGTGGATAGGTCTAAGAACACCTTGTATTTGCAGATGAACTCATTG 661 670 680 690 700 710 241 R A E D T A V Y Y C A R N L G P S F Y F 721 AGGGCTGAGGATACAGCCGTTTACTACTGTGCCAGAAATTTGGGACCTTCTTTCTACTTC 721 730 740 750 760 770 261 D Y W G Q G T L V T V S S G I G A V L K 781 GACTACTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACCGTATCTTCAGGTATTGGAGCTGTATTGAAA 781 790 800 810 820 830 281 V L T T G L P A L I S W I K R Q R Q Q H 841 GTCTTAACCACCGGTTTGCCTGCCTTGATATCTTGGATCAAGAGGCAGAGGCAGCAGCAC 841 850 860 870 880 890 301 H H H H H A A A L E H H H H H H * 901 CACCATCATCACCATGCGGCCGCactcgagcaccaccaccaccaccactga 901 910 920 930 940 950
Hỡnh 3.6. Trỡnh tự gen Hermel trong vector pET-21a(+) và trỡnh tự axit amin suy diễn của protein tỏi tổ hợp Hermel
Sau khi xỏc định trỡnh tự, chỳng tụi thu được kết quả trỡnh tự gen mó húa độc tố miễn dịch Hermel hoàn toàn trựng khớp với thiết kế cú chứa cỏc vựng chức năng như mó khởi đầu, mó kết thỳc,... Phõn tử protein suy diễn từ
trỡnh tự nucleotide thu được cho thấy gen Hermel đó được gắn đỳng chiều, đỳng khung đọc và khớp với cỏc yếu tố cần thiết cho quỏ trỡnh phiờn mó và dịch mó tạo ra protein tỏi tổ hợp. Đồng thời phõn tử protein tạo ra cũng cú chứa 6 gốc His giỳp cho việc tinh sạch mảnh độc tố miễn dịch được dễ dàng. Theo tớnh toỏn lý thuyết, phõn tử protein thu được sẽ cú kớch thước là 34,47 kDa. Đến đõy chỳng tụi cú thể khẳng định đó thiết kế thành cụng vector biểu hiện pET-21a(+)/Hermel.
3.2 BIỂU HIỆN VÀ TỐI ƢU HOÁ BIỂU HIỆN GEN HERMEL 3.2.1 biến nạp plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/hermel vào tế bào E. coli
BL21(DE3)
Vector biểu hiện pET-21a(+) là vector được thiết kế cho việc biểu hiện cỏc gen ngoại lai trong vi khuẩn E. coli với nhiều ưu điểm. Vector này được rất nhiều phũng thớ nghiệm trờn thế giới cũng như trong nước sử dụng trong việc sản xuất protein tỏi tổ hợp.
E. coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram õm được ưa chuộng nhất trong sản xuất protein tỏi tổ hợp. Một trong những lý do là vỡ những thao tỏc kỹ thuật với E. coli khỏ dễ dàng và chuẩn húa ở mọi phũng thớ nghiệm. Thụng thường, tất cả cỏc chủng E. coli dựng trong biểu hiện đều xuất phỏt từ chủng E. coli
K-12 hay B. Trong đề tài này, chỳng tụi đó chọn chủng E. coli BL21(DE3) làm chủng biểu hiện.
Để tạo ra chủng vi khuẩn cú khả năng sản xuất khỏng thể tỏi tổ hợp đặc hiệu HER2 gắn mellitin, trước hết plasmid tỏi tổ hợp phải được đưa vào chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3). Cú rất nhiều phương phỏp đó được ỏp dụng như phương phỏp xung điện, phương phỏp biến nạp,… Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi tiến hành theo phương phỏp biến nạp đưa plasmid tỏi tổ hợp vào tế bào E. coli dưới tỏc dụng của nhiệt và ion Ca2+. Sau khi biến nạp