1. Khỏi niờm, phõn loại và ứng dụng của immunotoxin
1.5.2 Khỏng thể đơn dũng
Khỏng thể đơn dũng là khỏng thể được tạo ra từ một dũng tương bào biệt húa từ lympho B ban đầu sau khi được kớch thớch bởi một quyết định khỏng nguyờn. Khỏng thể đơn dũng do quyết định khỏng nguyờn nào kớch thớch thỡ chỉ kết hợp đặc hiệu với quyết định khỏng nguyờn ấy mà thụi.
1.5.3. Khỏng thể đơn chuỗi – Mảnh khỏng thể
Trong cấu tạo của bất kỳ một khỏng thể tự nhiờn nào đều cú 4 vựng biến đổi (V - Variable). Sự kết hợp giữa 1 vựng biến thiờn trờn chuỗi nặng (VH) và 1 vựng biến thiờn trờn chuỗi nhẹ (VL) tạo nờn vị trớ nhận diện khỏng nguyờn (paratope). Như vậy, mỗi immunoglobulin cú hai vị trớ gắn khỏng nguyờn. Hai vị trớ này giống nhau như đỳc, qua đú một khỏng thể cú thể gắn được với 2 khỏng nguyờn giống nhau. Hai "cỏnh tay" của chữ Y cũn gọi là Fab (tức là phần nhận biết khỏng nguyờn, F: fragment, ab: antigen binding). Vựng khỏng nguyờn gắn vào khỏng thể gọi là epitope.
Cỏc khỏng thể tự nhiờn thường cú kớch thước lớn, khi cú một tỏc nhõn gõy bệnh xõm nhập vào trong cơ thể, nú được tổng hợp chậm và do cú kớch thước lớn nờn đụi khi nú được chuyển đến đớch tỏc dụng chậm với tỏc nhõn gõy bệnh. Với cụng nghệ ADN tỏi tổ hợp hiện nay, đó cú nhiều nhà khoa học nghiờn cứu tạo ra cỏc khỏng thể tỏi tổ hợp, tối ưu húa cỏc khỏng thể đú mà vẫn đảm bảo được tớnh đặc hiệu với khỏng nguyờn. Cho đến nay đó cú nhiều thế hệ khỏng thể tỏi tổ hợp được sản xuất ra.
Cỏc phõn tử khỏng thể chứa cỏc domain protein riờng biệt mà cú thể phõn tỏch bằng protease hoặc được tạo ra nhờ kỹ thuật tỏi tổ hợp. Hai mảnh khỏng thể được thiết kế gắn với khỏng nguyờn - Fab và Fv đó được tỏch dũng và bộc lộ trờn phage. Mảnh khỏng thể lớn hơn - Fab gồm cỏc phần VH - CH và VL - CL liờn kết với nhau bằng cầu disulfide, cũn mảnh khỏng thể nhỏ hơn Fv chỉ bao gồm vựng V H và VL.
Hỡnh 1.6. Sơ đồ cấu tạo của mảnh khỏng thể đơn chuỗi
Dạng tỏi tổ hợp của Fv là mảnh biến đổi đơn chuỗi (scFv). Hai vựng biến đổi trong mảnh khỏng thể tỏi tổ hợp đơn chuỗi (scFv) được nối với nhau bằng một đoạn peptide, thường gồm 15 axit amin cú trỡnh tự (Gly4Ser)3 và được biểu hiện như một chuỗi polypeptide đơn (Hỡnh 6). Đoạn nối cho phộp vựng biến đổi của chuỗi nặng (VH) kết hợp với vựng biến đổi của chuỗi nhẹ
(VL) tạo thành phõn tử đơn chuỗi. Phõn tử tỏi tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn hoạt tớnh nhận biết và liờn kết đặc hiệu với khỏng nguyờn đớch. Đặc điểm của cỏc mảnh khỏng thể khỏc nhau được túm tắt trong bảng số 1 [23, 24, 25].
Bảng 1. Một số mảnh khỏng thể đơn chuỗi
1.5.4. Một số khỏng thể đơn dũng sử dụng trong điều trị ung thƣ vỳ
Hiện nay, sử dụng cụng nghệ ADN tỏi tổ hợp cỏc nhà khoa học đó nghiờn cứu để tạo ra cỏc khỏng thể đơn dũng tỏi tổ hợp đặc hiệu với HER2 giỳp cho sự chẩn đoỏn và điều trị mang lại hiệu quả cao hơn trong UTV.
Ở Việt Nam, cỏc thuốc chữa ung thư cú bản chất khỏng thể đơn dũng cũng đó xuất hiện nhưng với giỏ thành rất cao, phạm vi ỏp dụng hẹp, khụng thể đỏp ứng được nhu cầu chữa trị của bệnh nhõn. Do đú việc nghiờn cứu và đưa vào sản xuất cỏc thuốc chữa trị ung thư bằng cụng nghệ ADN tỏi tổ hợp đang
Số húa bởi Trung tõm Học Liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mảnh khỏng thể Kớch thước Số paratop Cấu trỳc ScFv 25-30 kDa 1
Vựng VH và VL nối với nhau bằng một linker dài 15 axit amin
Fv 25 kDa
rất được quan tõm. Đối với bệnh UTV dương tớnh với HER2 thỡ bước đầu tiờn của quỏ trỡnh là tỏch được toàn bộ gen HER2, sau đú cú thể phỏt triển theo cỏc hướng quan tõm như chế tạo thuốc hay tạo cỏc kớt chẩn đoỏn sớm . Sau đõy là một số loại khỏng thể đang được sử dụng trong điều trị UTV dương tớnh với HER2:
- Khỏng thể đơn dũng khỏng HER2 từ bũ (muMAb ): muMAb là khỏng thể đơn dũng tương tỏc với khỏng nguyờn HER2 nằm trờn bề mặt của tế bào. muMAb 4D5 đem lại hiệu quả mong muốn trong việc chống lại sự phõn chia của cỏc dũng tế bào ung thư vỳ ở người in vitro cú sự biểu hiện quỏ mức thụ thể HER2 mà khụng ảnh hưởng đến cỏc dũng tế bào khụng biểu hiện quỏ mức gen này. Cỏc thử nghiệm cận lõm sàng với muMAb 4D5 trờn mẫu ghộp UTV và ung thư buồng trứng đó khẳng định tỏc dụng trị liệu của muMAb 4D5.
- Trastuzumab (Tờn thương mại: Herceptin) : được phỏt triển từ muMAb 4D5, nhưng trastuzumab cú khả năng gắn với domain trờn bề mặt ngoài tế bào của HER2 với ỏi lực lớn gấp 3 lần so ỏi lực của muMAb 4D5. Trastuzumab giống muMAb 4D5 ở khả năng ngăn chặn sự lớn lờn của khối u
in vitro, tuy nhiờn khụng giống muMAb 4D5, nú cũn cú thể cảm ứng sự gõy độc tế bào phụ thuộc khỏng thể đối với cỏc dũng tế bào ung thư vỳ.
Herceptin tỏc dụng theo 3 con đường khỏc nhau: 1. Ức chế sự phỏt triển của khối u.
Herceptin liờn kết với thụ thể protein HER2 trờn bề mặt tế bào khối u. HER2 với Herceptin gắn vào, được kộo lựi vào trong tế bào. Khi HER2 khụng cũn ở trờn bề mặt tế bào thỡ chỳng sẽ khụng thể tạo nờn tớn hiệu làm tăng trưởng và phõn chia tế bào.
Herceptin gắn vào thụ thể HER2 trờn bề mặt tế bào khối u. Sau đú cú một số tế bào trong hệ miễn dịch, cú thể là cỏc tế bào diệt tự nhiờn (NK – Natural Killer), gắn với Herceptin. Cỏc tế bào NK cú khả năng nhận ra cỏc tế bào khối u đú là bất thường và giết chết cỏc tế bào khối u.
3. Tỏc động kết hợp với hoỏ trị liệu.
Herceptin và hoỏ trị liệu tỏc động ở cỏc con đường khỏc nhau, nhưng khi kết hợp cựng nhau, cả hai loại thuốc đú cú thể hỡnh thành nờn một sự cộng tỏc. Vớ dụ, khi Herceptin được sử dụng với hoỏ trị liệu mà tấn cụng và phỏ huỷ ADN trong nhõn của cỏc tế bào khối u, Herceptin ngăn chặn khụng cho tế bào sửa chữa chỳng. Do đú sự sửa chữa khụng được thực hiện và dẫn đến tế bào sẽ bị chết. Điều này làm chậm lại quỏ trỡnh sinh trưởng của khối u. Herceptin cũng tỏc động kết hợp với cỏc loại thuốc hoỏ trị liệu khỏc và hoạt động theo cỏc con đường khỏc nhau, tuy nhiờn cỏc nhà nghiờn cứu vẫn chưa biết chớnh xỏc được quỏ trỡnh đú xảy ra như thế nào [26].
Hỡnh 1.7. Cơ chế tỏc động của Herceptin đối với tế bào UTV
Herceptin (Tratuzumab) gắn kết với vựng ngoại bào của thụ thể HER2 trờn bề mặt tế bào ung thư vỳ, ức chế sự phõn cắt vựng này để tương tỏc với cỏc thụ thể khỏc trong
họ HER, làm cảm ứng sự chết theo chương trỡnh của tế bào ung thư, giảm sự biệt húa tế bào, làm giảm sự biểu hiện của HER2…
Herceptin đó được FDA chấp thuận (1998) sử dụng lần đầu tiờn kết hợp với paclitaxel trong việc điều trị UTV di căn dương tớnh với sự biểu hiện quỏ mức thụ thể HER2.
1.5.5 Khỏng thể khỏng HER2 gắn Melitin
Một trong những liệu phỏp mới đang được quan tõm là sự kết hợp giữa phõn tử khỏng thể hướng đớch điều trị với phõn tử gõy độc tế bào. Độc tố miễn dịch (Its) kết quả của sự kết hợp này đang được hi vọng là sẽ mang lại hiệu quả cao hơn. Với hướng phỏt triển đú, chỳng tụi đó lựa chọn Melitin để tạo phõn tử đọc Its sử dụng trong điều trị ung thư vỳ. Melitin là một peptide gồm 26amino axid, chiếm 50% trọng lượng khụ của lọc độc ong, cú khả năng phỏ huỷ tế bào do phỏ vỡ cấu trỳc màng tế bào (8). Gen mó hoỏ độc tố miễn dich được tạo ra bằng cụng nghệ gen bao gồm phần mó hoỏ khỏng thể đơn chuỗi đặc hiệu HER2 và phần mó hoỏ melitin (Lờ Quang Huấn, 2004). (1)
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Sinh phẩm
Chủng E.coli TOP10 (Invitrogen) được sử dụng làm vật chủ trong thao tỏc ADN.
Chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) được sử dụng làm chủng biểu hiện. Vector tỏch dũng TOPO PCR 2.1
Vector biểu hiện pET21-a(+)
Cỏc enzyme giới hạn EcoRI, và NotI,
Anti-HER2F: 5’- TGGCGCCTCATGGACTGCCCTTACGGACCAAG- 3’
Anti-HER2R: 5’- ACCCGGGATCGGTÂCCAAGTACCTTGACC-3’
2.1.2. Húa chất và mụi trƣờng
Húa chất
Cỏc hoỏ chất tinh khiết được sử dụng trong cỏc nghiờn cứu sinh học phõn tử của BioLabs, Invitrogen, Novagen, Sigma, Fermentas và
Bioscience,... gồm:
- Cỏc húa chất dựng trong điện di polyacrylamid: Acrylamid, Bis- acrylamid Tris-HCl, Glycerol, SDS, APS, temed, …….
- Chất cảm ứng IPTG
- Cỏc húa chất dựng để tinh sạch protein: Guanidinium lysis buffer, Denaturing binding buffer, Denaturing wash buffer, Native wash buffer, Native elution buffer.
- LB lỏng: trypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%.
- LB đặc: trypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, agar 1,5%. Mụi trường được khử trựng ở 121oC, 0,8 atm trong 30 phỳt.
2.1.3. Thiết bị
Lũ vi súng (SamSung, Hàn Quốc) Mỏy li tõm (Eppendorf, Đức) Mỏy đo pH (Metter, Thuỵ Sĩ) Mỏy soi gel (Pharmacia, Mỹ) Mỏy PCR (Mỹ)
Mỏy lắc ổn nhiệt 37oC, 30oC, 28oC Cõn phõn tớch 10-4 g (Mettler Toledo) Cõn điện 10-1 g (Ohaus)
Tủ cấy vụ trựng (Sanyo, Nhật) Bộ điện di protein (Bio-Rad) Mỏy Vortex (Rotolab OSI) Mỏy đọc trỡnh tự (Mỹ) Tủ lạnh sõu (Sanyo, Nhật) Bể ổn nhiệt (Teche, OSI) Pipetman cỏc loại (Gilson) Bộ điện di ADN
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.2.1. PCR
Kỹ thuật PCR được Karl Mullis và cỏc cộng sự phỏt minh năm 1985 (giải Nobel hoỏ học năm 1993). Đõy là kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu in vitro
đoạn ADN nằm giữa hai đoạn trỡnh tự ADN đó biết (đoạn mồi). PCR là một phản ứng sinh húa phụ thuộc vào nhiệt độ, cú sự tham gia của một loại enzyme ADN polymerase chịu nhiệt và sử dụng nguyờn lý như quỏ trỡnh sao chộp ADN trong tự nhiờn.
Nguyờn tắc: Dựa trờn sự lai đặc hiệu giữa ADN mồi với ADN khuụn theo nguyờn tắc bổ sung và phản ứng kộo dài chuỗi của ADN polymerase
trong ống nghiệm (in vitro). Do đú từ một đoạn gen đó biết trước ta cú thể tổng hợp nờn số lượng lớn gen đú trong ống nghiệm.
Thành phần phản ứng, cỏc điều kiện về nhiệt độ và thời gian của toàn bộ quy trỡnh như sau:
Chương trỡnh thực hiện phản ứng PCR http://www.lrc-tnu.edu.vn Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ 0 ( C) Thời gian Chu kỳ 1 Thành phần Thể tớch (àl) Dung dịch đệm 10X dNTPs (10nM) MgCl2 (25nM) BSA 1X Primer F (10pM) Primer R (10pM) ADN mẫu
2.2.2. Cắt bằng enzyme giới hạn.
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt ADN plasmid bằng enzyme giới hạn
EcoRI:
Toàn bộ hỗn hợp trờn được giữ ở 370C, 4h.
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt ADN plasmid bằng enzyme giới hạn
NotI:
Ủ hỗn hợp 370C, thời gian 4h.
2.2.3. Phƣơng phỏp thiết kế vector biểu hiện
Thiết kế vector mang gen hermel: Vector pET-21a(+) được cắt bằng
hai enzyme giới hạn tại hai vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI và
Số húa bởi Trung tõm Học Liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thành phần Thể tớch (àl) ADN/Plasmid Dung dịch đệm 4 BSA NotI H20 Thành phần Thể tớch (àl) Plasmid Dung dịch đệm 2 EcoRI H20
NotI, gen mó hoỏ độc tố miễn dịch hermel trong vector tỏch dũng TOPO PCR 2.1 cũng được cắt bằng hai enzyme trờn. Sản phẩm cắt được tinh sạch và điện di trờn gel agarose 0.8%, sau đú được gắn vào vector biểu hiện pET-21a(+) bằng T4 ligase (BioLabs).
Sau khi gắn sản phẩm được biến nạp vào E.coli chủng TOP10. Cỏc khuẩn lạc mang vector tỏi tổ hợp được chọn lọc trờn đĩa mụi trường LB đặc cú bổ sung Apicilli (100 μg/ml) và được nuụi trong mụi trường LB lỏng (cú chứa ampicillin), Plasmid ADN sau đú được tỏch ra để kiểm tra sự cú mặt của gen mong muốn bằng PCR với cặp mồi Anti-Her2F và Anti-Her2R.
Sản phẩm thụi gel được gắn vào vector pET21a(+) cũng đó được cắt với 2 enzyme giới hạn EcoRI và NotI. Cỏc dũng tế bào cú chứa vector tỏi tổ hợp mang gen mó hoỏ độc tố miễn dịch được chọn lọc bằng cỏch so sỏnh kớch thước tương đối của ADN plasmid cũng như kết quả cắt kiểm tra bằng cỏc enzyme giới hạn EcoRI và NotI.
Kết quả này cũn được khẳng định bởi việc xỏc định trỡnh tự nucleotide của gen hermel sau khi được gắn vào vector biểu hiện pET21a(+) tại cỏc vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn EcolRI và NotI. Gen hermel chứa cỏc vựng chức năng cũng như mó mở đầu, mó kết thỳc theo đỳng thiết kế (xem phần phõn tớch trỡnh tự dưới đõy). Trỡnh tự gen hermel đó được đăng ký trong Ngõn hàng gen quốc tế với mó số: AM402973. Plasmid chứa gen hermel sau khi được xỏc định trỡnh tự được tinh sạch và biến nạp vào E.coli chủng Rosetta để biểu hiện gen tỏi tổ hợp ở nhiệt độ 37oC sau 4h cảm ứng với nồng độ 0.6 mM IPTG.
Plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2
Chủng E. coli BL21 (DE3)
Biến nạp
Chủng E. coli BL 21 (DE3) mang plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2 Biểu hiện Protein tỏi tổ hợp (độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2) Tinh sạch scFv đặc hiệu HER2
Hỡnh 2.1. Sơ đồ túm tắt quỏ trỡnh biểu hiện độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trong E. coli
Chỳ thớch: Biến nạp:
Biểu hiện:
- Làm tế bào khả biến (chủng E. coli BL 21 (DE3)) - Biến nạp plasmid tỏi tổ hợp vào tế bào khả biến - Cảm ứng bằng IPTG
- -
Xử lý mẫu
2.2.4. Phƣơng phỏp biến nạp
Biến nạp là quỏ trỡnh chuyển ADN trực tiếp từ tế bào cho sang tế bào nhận. Cơ chế của biến nạp là vi khuẩn nhận nhận trực tiếp ADN từ thể cho. Những tế bào cú khả năng nhận ADN được gọi là tế bào khả biến.
Nguyờn tắc của phƣơng phỏp
Màng tế bào cú bản chất phospho lipid kộp, tớch điện õm, do đú sẽ cản trở sự di chuyển của cỏc plasmid ngoại lai cũng là những phõn tử tớch điện õm ở bề mặt. Khi xử lớ cỏc tế bào này với CaCl2, dưới tỏc dụng của Ca2+ sẽ che chắn cỏc gốc tớch điện õm ở trờn lỗ màng và đồng thời làm cho màng tế bào xốp hơn. Sau đú khi sốc nhiệt, màng tế bào gión nở đột ngột, lỗ màng mở rộng tạo điều kiện cho plasmid xõm nhập vào tế bào một cỏch dễ dàng.
Phƣơng phỏp thực hiện
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Lấy chủng tế bào E. coli BL21 được cất giữ ở -200C.
- Nuụi cấy 1% chủng tế bào trong 2 ml mụi trường LB lỏng, nuụi lắc ở 37oC, 200 v/ph qua đờm.
- Cấy chuyển 2% dịch nuụi tế bào qua đờm sang 2 ml mụi trường LB lỏng. Nuụi lắc ở 37oC, 200 v/ph trong 3 h đến OD600 đạt 0,5 - 0,6.
- Chuyển dịch tế bào sang ống Eppendorf vụ trựng, để trờn đỏ 10 phỳt. - Ly tõm thu sinh khối (4000 v/ph, 4oC trong 5 phỳt), loại dịch nổi. - Rửa cặn tế bào bằng 300 àl CaCl2.
- Ly tõm 4000 v/ph trong 5 phỳt, loại dịch nổi.
- Hoà lại tế bào trong 60 àl CaCl2, bỳng nhẹ cho tan hết tế bào. - Để ống tế bào trong đỏ ớt nhất 1 h trước khi sử dụng cho biến nạp.
- Lấy tế bào khả biến đó chuẩn bị để trờn đỏ.
- Lấy 2 àl plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2 cho vào tế bào khả biến để trờn đỏ khoảng 30 phỳt.
- Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giõy, sau đú đặt ngay ống tế bào vào đỏ và để 2 phỳt.
- Bổ sung 250 àl mụi trường LB, nuụi lắc 200 v/ph ở 37oC trong 1 giờ. - Cấy trải 150 àl dịch tế bào nuụi cấy trờn đĩa petri cú mụi trường thạch LB chứa 1% Amp (100 àg/ml).
- Nuụi ở tủ ấm ở 37oC qua đờm.
2.2.5. Phƣơng phỏp biểu hiện
Cảm ứng mẫu
Nguyờn tắc:
Nuụi cấy cỏc thể biến nạp trong mụi trường cú chất cảm ứng promoter để protein tỏi tổ hợp cú thể được tổng hợp. Sau đú, kiểm tra protein tỏi tổ hợp