Định danh, nuôi trồng và đánh giá hoạt tính sinh học của nấm mối đen thu thập tại đại ninh lâm đồng

BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỒ CHÍ MINH PHẠM NGỌC HƯƠNG ĐỊNH DANH, NI TRỒNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẨM MƠI ĐEN THU THẬP TẠI ĐẠI NINH - LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ma ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC sĩ THÀNH PHỔ HỊ CHÍ MINH NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày .tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Trịnh Ngọc Nam - Chủ tịch Hội đồng PGS TS Võ Thanh Sang - Phản biện TS Hồ Bảo Thuỳ Quyên - Phản biện TS Hồ Thiên Hoàng - ủy viên TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỊNG VIỆN TRƯỞNG VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THựC PHẨM BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỊ CHÍ MINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC sĩ Họ tên học viên: Phạm Ngọc Hương MSHV: 20126161 Ngày, tháng, năm sinh: 09/01/1992 Nơi sinh: Campuchia Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐÈ TÀI: Định danh, ni trồng đánh giá hoạt tính sinh học nấm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng NHIỆM VỤ VÃ NỘI DƯNG: Nhiệm vụ: Định danh, ni trồng đánh giá hoạt tính sinh học nấm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng Nội dung nghiên cứu luận văn tốt nghiệp: ♦ ♦♦ Định danh phương pháp mô tả hình thái kết hợp sinh học phân tử chủng nấm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng ♦ ♦ ♦ ♦♦ Nhân giống nuôi trồng nấm mối đen tự nhiên thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng ♦♦ Phân tích hàm lượng số hợp chất polyphenol cao chiết thể nấm phương pháp HPLC - DAD ♦♦ Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết: hoạt tính kháng oxi hóa khả ức chế tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4T1 ♦ ♦♦ So sánh kết với hai chủng nấm mối đen nuôi trồng thương mại Việt Nam nội dung nêu II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo 2715/QĐ-ĐHCH ngày 30/11/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/5/2022 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thị Kim Anh Tp Hồ Chỉ Minh, ngày tháng năm 20 NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM Bộ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THựC PHẨM (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Cảm ơn ba mẹ cho có sống thật ý nghĩa Sau q trình học tập nghiên cứu, tơi hoàn thành luận văn tốt nghiệp với đề tài “Định danh, ni trồng đánh giá hoạt tính sinh học nấm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng”, dự án tâm huyết nghiệp kể từ tốt nghiệp đại học bắt đầu với nghề nuôi trồng nấm Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Kim Anh, người Cô giáo đồng hành, định hướng, tận tâm bảo tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM, quý Thầy Cô Viện đào tạo Quốc tế sau đại học Viện Công nghệ Sinh học Thực Phẩm tạo điều kiện truyền đạt cho kiến thức q báu giúp tơi có thêm nhiều dam mê, định hướng khoa học hiểu biết sâu rộng lĩnh vực cơng tác Xin cảm ơn anh chị bạn bè Viện Công nghệ Sinh học ứng dụng, đặc biệt bạn Lê Thanh Nhàn động viên, hỗ trợ nhiệt tình suốt q trình để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Đồng cảm ơn anh chị đồng nghiệp, bạn lớp CHSH10B đồng hành khích lệ tơi suốt q trình học thạc sĩ Mặc dù luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót, góp ý q báu q Thầy Cơ động lực để tơi hồn thiện kiến thức nhiều TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC sĩ Danh pháp khoa học nấm mối đen tự nhiên thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng hai chủng nấm mối đen nuôi trồng thương mại có nguồn gốc từ Trung Quốc Thái Lan xác định Hymenopeỉlis raphanipes Ba chủng giống nấm mối đen nhân giống nuôi trồng thành công giá thể mùn cưa cao su phối trộn với 10% cám gạo điều kiện nhiệt độ 25-28°C Cơng trình cơng trình định danh xác tên lồi, phân tích hàm lượng polyphenol xác định hoạt tính sinh học nấm Hymenopellỉs raphanipes Việt Nam Trong nghiên cứu cao chiết ethanol nấm sấy thăng hoa từ ba chủng nấm mối đen sử dụng để khảo sát đặc tính kháng oxy hóa phương pháp bắt gốc tự DPPH khả gây độc tế bào mơ hình dịng tế bào ung thư biểu mơ tuyến vú 4T1 Kết phân tích kháng oxy hóa cho thấy ba cao chiết khảo sát có khả loại bỏ gốc tự DPPH cao chiết TM1 cho kết kháng oxy hóa cao với giá trị IC50 = 3,088 ± 0,088 mg/ml Đồng thời ba loại cao chiết (Đại Ninh, TM1, TM2) cịn có khả gây độc tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4T1 với giá trị IC50 23,283 ± 5,058 pg/ml, 16,975 ± 5,791 pg/ml 19,727 ± 1,360 Jig/ml Nhìn chung, cao chiết từ chủng nấm mối đen thương mại TM1 cho hiệu kháng oxi hóa gây độc tế bào ung thư tốt hai loại cao chiết lại điều kiện thí nghiệm 11 ABSTRACT The scientific name of the wild rooting shank harvested in Dai Ninh - Lam Dong and two commercial Chinese and Thailand mushroom strains were both identified as Hymenopellis raphanipes Three strains of rooting shank have been successfully cloned and cultivated on a substrate of rubber sawdust and 10% rice bran at a temperature of 25-28°C This might me the first work to explicitly identify the species, analyze polyphenol content, and establish the biological activity of Hymenopellis raphanipes in Vietnam In this study, ethanol extracts of freeze-dried fruiting bodies of three strains of rooting shank were used to investigate their antioxidant properties using the DPPH freeradical scavenging assay and their cytotoxic activity on the 4T1 mammary carcinoma cell line The results of the antioxidant analysis showed that all three extracts had the ability to scavenge DPPH radicals, with TM1 extract showing the highest antioxidant activity with an IC50 value of 3.088 ± 0.088 mg/ml In addition, the three extracts (Dai Ninh, TM1, TM2) also had the ability to kill 4T1 mammary carcinoma cells with IC50 values of 23.283 ± 5.058 pg/ml, 16.975 ± 5.791 pg/ml and 19.727 ± 1.360 pg/ml, respectively Overall, the extract from the commercial TM1 strain of rooting shank showed superior antioxidant and cytotoxic activity than the two remaining extracts under the same experimental conditions iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp thạc sĩ “Định danh, ni trồng đánh giá hoạt tính sinh học nấm mối đen thu thập Đại Ninh - Lâm Đồng” cơng trình nghiên cứu thân tơi Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Học viên (Chữ ký) Phạm Ngọc Hương IV MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC sĩ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG BIỂU X DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ LĨNH vực NGHIÊN cứu 1.1 Tổng quan nấm mối đen 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố 1.1.2 Tình hình ni trồng nấm mối đen 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng hoạt tính sinh học 1.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng 1.1.3.2 Hoạt tính kháng oxi hóa 11 1.1.3.3 Hoạt tính ức chế tế bào khối u 13 1.1.3.4 Một số hoạt tính khác 15 1.1.4 Các phương pháp phân loại nấm mối đen 17 1.2 Sự khác đề tài cơng trình nghiên cứu khác 17 CHƯƠNG 2.1 2.1.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 Nguyên vật liệu 19 Chủng nấm .19 V 2.1.2 Hóa chất mồi 19 2.1.3 Dòng tế bào nguyên bào sợi 23 2.2 Dụng cụ - Thiết bị 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Định danh mơ tả hình thái kết hợp sinh học phân tử mẫu nấm mối đen 24 2.3.1.1 Mơ tả hình thái 24 2.3.1.2 Phương pháp tách chiết DNA, PCR xây dựng phátsinh lồi 25 2.3.2 Nhân giống ni trồng nấm mối đen 26 2.3.2.1 Nhân giống nấm môi trường PDA, meo hạt, meo quemì 26 2.3.2.2 Ni trồng thể nấm mối đen mùn cưa cao su 27 2.3.3 Phương pháp chiết cao nấm mối đen .27 2.3.4 Phân tích hàm lượng số hợp chất polyphenol có cao chiết thể nấm 28 2.3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết thể nấm 30 2.3.5.1 Hoạt tính kháng oxi hóa: khả bắt gốc tự DPPH 30 2.3.5.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào tế bào ung thư vú 4T1 tế bào đối chứng nguyên bào sợi (fibroblast) 31 2.3.5.3 Xử lí số liệu .33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 34 3.1 Định danh mơ tả hình thái kết hợp sinh học phân tử mẫu nấm mối đen 34 3.1.1 Mơ tả hình thái 34 3.1.2 Xây dựng phát sinh loài 40 3.2 Nhân giống nuôi trồng nấm mối đen 41 3.2.1 Nhân giống nấm môi trường PDA, meo hạt, meo que mì 42 3.2.2 Ni trồng thể nấm mối đen mùn cưa cao su 44 3.3 Phân tích hàm lượng số hợp chất polyphenol có cao chiết thể nấm 50 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học 53 3.4.1 Kết kháng oxy hóa cao chiết nấm nghiên cứu 53 VI