Mục tiêu nghiên cứu
Thu nhận được sản phẩm thủy phân từ hàu và vẹmxanh mangcác hoạt tính sinh học như khángoxy hóa, ức chế ACE.
Xác định điều kiện thủy phân tối ưu để thu được sản phẩm từ hàu và vẹm xanh bằng enzyme protease Đánh giá khả năng thu gom gốc tự do DPPH và ABTS của các sản phẩm thủy phân, đồng thời xác định giá trị IC50.
Xác định năng lực khử của các sản phẩm thủy phân thông qua độ hấp thụ tối đa tại bước sóng 700 nm Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm thủy phân Đánh giá khả năng ức chế ACE của các sản phẩm thủy phân và xác định giá trị IC50.
Xác định trình tự peptit trong sản phẩm thủy phân thông qua phương pháp LC-MS/MS Đánh giá tương tác giữa các peptit thủy phân và ACE bằng phương pháp docking phân tử.
Thu được sản phẩm thủy phân sấy phun và đánh giá được hoạt tính sinh học của mẫu bột thủy phân sau khi sấy phun.
So sánh vàđánh giá hoạttính sinh học của 2 sản phẩm thủy phân từ hàu vàvẹm xanh.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Cungcấp đượccác điều kiện thủy phân phù hợpnhằm thu nhận sản phẩm thủy phân từ hàu và vẹm xanh mangcác hoạt tính sinh học (kháng oxy hóa, ức chếACE).
Mô phỏng sự tương tác của các trình tư peptit thủy phân từ hàu và vẹm xanh với enzyme ACE đã được thực hiện, giúp phân tích khả năng ức chế ACE của các peptit này.
Thu nhận và đánh giá sơ bộ bột peptit sấy phun
Nghiên cứu này nhằm phát triển các sản phẩm peptide có hoạt tính sinh học từ hàu và vẹm xanh, mang lại lợi ích cho sức khỏe con người, đồng thời cung cấp dữ liệu quý giá cho các nghiên cứu chuyên sâu trong tương lai.
TỔNG QUAN
Tổng quan về hàu, vẹm xanh
Hàu Thái Bình Dương, thuộc họ ngao, có vỏ dày và chắc, thường hình bầu dục hoặc tam giác Vỏ bên trái lớn và lõm sâu, bao phủ phần thân mềm, trong khi vỏ bên phải nhỏ và phẳng Loài này rất phổ biến và đóng vai trò quan trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu Hàu thường sống riêng lẻ hoặc thành cụm trên đá ven biển và cửa sông Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ từ 8 đến 22°C và độ mặn từ 24-28 ppt, nhưng cũng có thể chịu được độ mặn thấp trong thời gian ngắn Khả năng phát triển của hàu Thái Bình Dương rất đa dạng, cho phép chúng sống trong nhiều môi trường khác nhau, kể cả những nơi không phù hợp cho các loài hàu bản địa Thức ăn của hàu chủ yếu là sinh vật phù du và các loài sống trong bùn, cát và nước biển Hàu có kích thước lớn hơn so với các loài trai và sò nhỏ nhờ vào kích thước vỏ lớn hơn cơ thể.
Vẹm xanh (P viridis) là một loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có giá trị kinh tế cao trong họ Mytilidae Vỏ của chúng có hình dáng giống chiếc thìa hoặc trái xoài, với hai mảnh vỏ kích thước tương đồng nhưng không đều nhau ở các cạnh Bề mặt vỏ có các vòng sinh trưởng nhỏ và dày, màu sắc chủ yếu là xanh đậm, trong khi mặt trong thường có màu trắng bạc mịn màng, và viền ngoài của vỏ có màu xanh lục nhạt.
Tên tiếng anh: Green Mussel
Vẹm xanh thường sinh sống ở các khu vực nước ấm, nhiệt đới và cận nhiệt đới như Thái Lan, Trung Quốc, Philippines và New Zealand Tại Việt Nam, chúng có mặt ở nhiều vùng bãi triều thuộc các tỉnh như Quảng Bình, Bình Thuận, Thừa Thiên Huế, Hải Phòng, Bình Định, Hà Tĩnh, Khánh Hòa và Kiên Giang Loài vẹm này thích nghi với môi trường nước có độ mặn từ 20 đến 30 ppt và thường bám vào các loại đá, sỏi và san hô bằng cách tạo ra sợi tơ để gắn kết với các vật cứng dưới đáy biển.
Hình 1.1 Hình dạng của vẹmp viridis (A)Mau đượcthu nhận ởBrazil (B) Mau được thu nhận ởKhánh Hòa, Việt Nam [12, 13] ố
1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và một số công dụng
Hàu là thực phẩm giàu protein, được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc để hỗ trợ sức khỏe và điều trị các bệnh mãn tính Nghiên cứu cho thấy hàu Thái Bình Dương có hàm lượng protein cao từ 50-56%, cùng với các axit amin cần thiết, khoáng chất như natri, kali, magie, canxi, kẽm, và vitamin B12, B1, A.
Hàu có hàm lượng dinh dưỡng phong phú, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như nâng cao khả năng miễn dịch, hỗ trợ sức khỏe tim mạch, cải thiện chức năng não, bảo vệ mắt, làm đẹp da và tăng cường sức khỏe sinh lý.
Vẹm xanh là hải sản giàu dinh dưỡng với nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm protein, axit amin, khoáng chất, vitamin và omega 3 Loại hải sản này chứa ít chất béo, calo và cholesterol, giúp giảm nguy cơ bệnh tim mạch, phòng ngừa Alzheimer, và tăng cường hoạt động của não Vẹm xanh còn có vai trò quan trọng trong ngăn ngừa và điều trị các vấn đề như thoái hóa khớp, thấp khớp, viêm khớp, và loãng xương Ngoài ra, vẹm còn chứa glycosaminoglycan, bao gồm axit hyaluronic, chondroitin sulfate và keratin sulfate, giúp xây dựng cấu trúc khớp và sụn, mang lại tác dụng kháng viêm tự nhiên và nhiều lợi ích cho sức khỏe xương khớp.
Một số axit amin như arginine, axit glutamic, histidine và lysine có khả năng chống oxy hóa Vòng thơm trong cấu trúc của phenylalanine cũng tương tác với các gốc tự do, tạo ra các phân tử ổn định, từ đó tăng cường hoạt tính chống oxy hóa Các axit amin này đã được tìm thấy với hàm lượng đáng kể trong hàu và vẹm xanh nuôi ở Việt Nam, cho thấy tiềm năng sản xuất các peptit thủy phân có khả năng chống oxy hóa.
Bảng 1.1 Thành phần các axit amin và protein có trongmẫu hàu và vẹm xanh [15].
Axit amin được chia thành hai loại: axit amin thiết yếu và axit amin không thiết yếu Trong bảng phân tích, các giá trị trung bình được phân biệt bằng chữ cái đầu khác nhau, cho thấy sự khác biệt hàm lượng axit amin giữa hai đối tượng là hàu và vẹm xanh Ngoài ra, chữ cái khác biệt thứ hai thể hiện sự so sánh hàm lượng axit amin giữa hàu và vẹm, với các giá trị sai khác có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
1.1.3 Tình hình nuôi trong tại Việt Nam ỉ.1.3 ỉ Hàu
Nghề nuôi hàu tại Việt Nam đã trở thành nguồn thu nhập mới cho cư dân ven biển nhờ quy trình đơn giản, chi phí thấp và lợi nhuận cao hơn so với nhiều hình thức nuôi trồng thủy sản khác Hiện nay, hàu không chỉ được nuôi để cung cấp cho thị trường mà còn được thả vào khu vực nuôi tôm sú, giúp làm sạch môi trường và giảm thiểu chi phí quản lý Sự phát triển của ngành nuôi trồng hàu đang mở ra triển vọng tích cực trong việc khắc phục hệ sinh thái.
8 sinh thái rừng ngập mặn ở các tỉnh miền Nam, những nơi đã gặp thiệt hại do hoạt động nuôitôm trước đây.
Hàu được nuôi trồng phổ biến tại nhiều địa điểm như huyện Long Sơn (BR - VT), Hà Tĩnh, Nghệ An, Hải Phòng, Cần Giờ (TP Hồ Chí Minh), Quảng Ninh, Huế và nhiều nơi khác Đặc biệt, Long Sơn được xem là "mỏ hàu" của miền Nam, nổi bật trong toàn tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.
Diện tích nuôi hàu trung bình tại VT là khoảng 2000 m2 mỗi hộ, với sản lượng hàng năm đạt khoảng 2000 tấn cho loại hàu 20 - 30 con/kg Hàu thường được nuôi trên bè đơn hoặc kết hợp với bè nuôi cá, mang lại phương thức nuôi hàu hiệu quả với vốn đầu tư không lớn và không cần cung cấp thức ăn cho hàu.
Trong nghiên cứu tại đầm Lập An, tỉnh Thừa Thiên Huế, các nhà khoa học đã tiến hành đánh giá năng suất của năm loài hàu nuôi trên giá thể lốp cao su, bao gồm hàu Cửa sông (Crassostrea rivularis), hàu Đá (S cucullata), và hàu ốc (Crassostrea sp2) Kết quả nghiên cứu này góp phần quan trọng vào việc phát triển nghề nuôi hàu bền vững trong khu vực.
Mỏ vịt (Crassostrea sp1) và hàu Thái Bình Dương (C gigas) cùng với hàu Cửa sông là những loài hàu phổ biến nhất hiện nay Phương pháp nuôi hàu chủ yếu được áp dụng tại đầm Lập, góp phần phát triển ngành nuôi trồng thủy sản.
Việc sử dụng giá thể lốp cao su trong nuôi hàu kết hợp với dây vỏ hàu trên diện tích khoảng 129 ha đang được áp dụng Tình hình tiêu thụ hàu tại đây chủ yếu là hàu đã tách sạch vỏ Giá thành của hàu phụ thuộc vào kích thước, ví dụ như hàu loại I (dưới 10 con/kg) có giá dao động từ 35.000 - 40.000 đồng/kg.
Hình 1.2 Năm loàihàuđược nuôi tại đâm Lập An (A) Hàu cửa sông (c rivularis / CrassơtreaariakensisỴ (B) Hàu sữa Thái Bình Dương (C gigcis) (C) HàuMỏ vịt
(Crassotrea sp1.) (D) Hàu ốc (Crassotrea sp2) (E) Hàu Đá (S cucullaía) [20]
Nghề nuôi vẹm xanh ở Việt Nam đã phát triển từ lâu, chủ yếu tại các vùng ven biển như Thái Bình, Phú Yên, Quảng Ninh, Khánh Hòa và Thanh Hóa Năm 2020, sản lượng nhuyễn thể chiếm 8,2% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản cả nước, với ước tính khoảng 300.000 - 350.000 tấn vẹm xanh được khai thác mỗi năm Theo dữ liệu từ FAO (2010), Việt Nam đứng thứ 8 trong danh sách 10 quốc gia hàng đầu thế giới về sản lượng nuôi nhuyễn thể, nhưng lại dẫn đầu về tốc độ tăng trưởng trung bình hàng năm với 24,9% Sản lượng nuôi nhuyễn thể của Việt Nam đã tăng từ 21,3 nghìn tấn vào năm 1998.
100 nghìn tấn (2003), và 170 nghìn tấn vào năm 2008.
Tổng quan về peptit
Nghiên cứu cho thấy rằng protein trong khẩu phần ăn cung cấp nhiều peptit có hoạt tính sinh học, với kích thước chuỗi peptit dao động từ 2 đến 20 gốc axit amin Thành phần trình tự axit amin đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến hoạt tính của các peptit này.
1.2.2 Các hoạt tỉnh sinh học của peptit
Peptit có nhiều hoạt tính khác nhau, bao gồm điều hòa miễn dịch, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chống huyết khối, hạ cholesterol máu và hạ huyết áp Đặc biệt, một số peptit đã được phát hiện có đặc tính đa chức năng.
Các phân đoạn peptit và sản phẩm thủy phân protein cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với protein hoặc hỗn hợp axit amin, cho thấy vai trò quan trọng của peptit trong hoạt động chống oxy hóa Nghiên cứu đã xác định rằng peptit chứa nhiều axit amin kỵ nước và histidine có khả năng thu gom gốc tự do DPPH cao Ngoài ra, sự hiện diện của các axit amin thơm như tryptophan và tyrosine ở đầu C của peptit cũng góp phần làm tăng khả năng thu gom gốc tự do.
Các peptide kháng khuẩn đang thu hút sự chú ý trong điều trị bệnh nhờ khả năng tiêu diệt vi khuẩn nhanh chóng mà không gặp phải tình trạng kháng thuốc như các loại kháng sinh truyền thống Chúng thường chứa các axit amin mang điện tích dương như lysine và arginine, với kích thước nhỏ hơn 50 axit amin, trong đó khoảng 50% là axit amin kỵ nước Cấu trúc lưỡng tính của các peptide này được coi là yếu tố quan trọng giải thích cho hoạt động kháng khuẩn của chúng.
1.2.2.3 Hoạttỉnh ức chế angiotensin -I- converting —enzyme (ACE)
Peptit hạ huyết áp đang thu hút sự chú ý lớn do tỷ lệ bệnh hạ huyết áp ngày càng tăng, được xem là yếu tố nguy cơ cho các bệnh tim mạch Các peptit này đã chứng minh hiệu quả trong việc ngăn ngừa và điều trị tăng huyết áp thông qua cơ chế ức chế enzyme ACE, enzyme có khả năng chuyển đổi angiotensin I thành angiotensin II - một chất co mạch mạnh Hơn nữa, ACE cũng làm bất hoạt bradykinin, một chất giãn mạch, dẫn đến tăng huyết áp Các hợp chất ức chế ACE có khả năng giảm hoạt động của enzyme này, từ đó làm giảm nồng độ angiotensin II và tạo ra tác dụng giãn mạch trên hệ thống mạch máu Nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng thuốc ức chế ACE có hiệu quả trong việc điều trị tăng huyết áp.
ACE làm giảmđáng kể tỷ lệ mắc bệnh và tử vongở bệnh nhân nhồi máu cơ tim hoặc suy tim [29]
Cấu trúc của các peptit ức chế ACE thường bao gồm các gốc axit amin kỵ nước, như chuỗi thơm hoặc phân nhánh, ở đầu C Ngoài ra, sự hiện diện của axit amin mang điện tích dương như lysine hoặc arginine ở đầu C của peptit cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt động ức chế ACE, cho thấy khả năng tương tác giữa chất ức chế và vị trí liên kết anion của ACE.
Một số peptit có hoạt tính opioid được tìm thấy trong protein sữa và dịch thủy phân gluten lúa mì, có ảnh hưởng tích cực đến hệ thần kinh Các peptit từ sữa cũng có khả năng điều hòa miễn dịch, kích thích sự tăng sinh tế bào lympho ở người và các hoạt động thực bào của đại thực bào.
Tình hình nghiên cứu
1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
In 2008, Jiapei Wang and colleagues hydrolyzed protein from the oyster species Crassostrea talienwhanensis Crosse using pepsin, resulting in the isolation of a pure peptide with the sequence WYPWTQRF, which exhibited ACE inhibitory activity with an IC50 value of 66 pmol/l.
Năm 2010, Xiu-Ping Dong và cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân từ thịt hàu (Crassostrea tahenwhannensis) bằng ba loại protease: papain, neutrase và alcalase, cho thấy các phân đoạn peptit nhỏ hơn 1 kDa có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất Cùng năm, Kazuhiro Shiozaki và cộng sự xác định được peptit ức chế ACE có trình tự DLTDY từ quá trình thủy phân protein hàu (C gigas) bằng trypsin Đến năm 2014, Umayaparvathi và cộng sự công bố các peptit thu được từ dịch thủy phân protein của hàu (Saccostrea cucullata) với khả năng kháng oxy hóa mạnh, thể hiện qua phản ứng thu gom gốc DPPH đạt 85,7 ± 0,37% và năng lực khử.
Nghiên cứu cho thấy ODvoonm đạt giá trị 2,63 ± 0,2 tại nồng độ 1 mg/ml Các peptit SCAP1, SCAP3 và SCAP7 đã được xác định có khả năng loại bỏ gốc DPPH cao nhất, với SCAP1 (LANAK, MW= 515,29 Da), SCAP3 (PSLVGRPPVGKLTL, MW= 1432,89 Da) và SCAP7 (VKVLLEHPVL, MW= 1145,75 Da) Đặc biệt, peptit SCAP1 cũng cho thấy hoạt tính chống lại dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HT-29.
Nghiên cứu của Li Zhang và cộng sự năm 2015 đã thực hiện thủy phân hàu Thái Bình Dương bằng ba loại protease thương mại, đạt hiệu suất thủy phân cao nhất là 39,89% Sản phẩm thu được có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh như Staphylococcus aureus (ATCC 27217) và Listeria monocytogenes.
(ATCC 19111), Escherichia coll (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853), Vibrio harveyỉ (VIB571), Vibrioparahaemolytỉcus (ATCC 17802) vàVibrio anguillarum (LMG4437) [37].
Năm 2018, hoạt tính giảm mệt mỏi và chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân hàu
Nghiên cứu của Jianyin Miao và cộng sự về bang protease từ Ostrea rìvularis cho thấy rằng dịch thủy phân sau khi phân tách bằng màng lọc 6 kDa tạo ra hai phân đoạn (6 kDa) Kết quả cho thấy phân đoạn 1 có khả năng giảm mệt mỏi trên chuột mạnh nhất, với thời gian bơi kéo dài đáng kể (67,79%), tăng hàm lượng glycogen cơ (45,65%) và glycogen gan (49,01%), đồng thời giảm hàm lượng nitơ urê máu (18,44%) Phân đoạn 1 cũng thể hiện khả năng kháng oxy hóa tốt hơn rõ rệt so với phân đoạn 2.
Năm 2019, Wan Li và các cộng sự đã nghiên cứu và xác định hai peptit có hoạt tính điều hòa miễn dịch, được chiết xuất từ dịch thủy phân hàu (Crassostrea hongkongensis), với các trình tự là DNSIAMESMK và LLQLGSGR.
Năm 2013, Normah và cộng sự đã thực hiện đánh giá vị đắng của dịch thủy phân vẹm xanh (P viridis) bằng phương pháp cảm quan Kết quả cho thấy sản phẩm thủy phân ở điều kiện pH 9, E/S 3% có mức độ thủy phân cao hơn so với pH 7, E/S 5% Cả hai sản phẩm đều có vị hơi đắng nhưng không vượt quá vị đắng của dung dịch caffein tiêu chuẩn.
Năm 2015, M Vijaykrishnaraj và cộng sự đã nghiên cứu và sản xuất mì ống không chứa gluten từ vẹm xanh (Perna canaliculus) Nghiên cứu xác định tổng hoạt tính chống oxy hóa của vẹm xanh là 14,5 mg đương lượng axit ascorbic (AAE)/g dịch chiết, với hoạt tính thu gom gốc tự do đạt 36% và năng lực khử đạt 76% so với đối chứng.
K L Sreejamole và cộng sự (2016) đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết vẹm (P viridis) bằng các dung môi methanol, ethyl axetat và nước/ethanol Trong đó, chiếtxuấtbang ethyl axetat cho khảnăng loại bỏ gốc DPPH tốt nhất(IC50 là0,616 mg/ml), và chiết xuất methanolthể hiện hoạt tính thu gom superoxide anion tốt hơn so với chiết xuấtnước/ethanol (Giá trị IC50 tương ứng là 2,79 và 3,88 mg/ml) Ngoài ra, cả ba chất chiết xuất đều có khả năng ức chế oxy hóa p-carotene với sự khác biệt đáng kể về giátrị hấpthụ ởbước sóng 492 nm so với đối chứng [40].
1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Vào giai đoạn 2003-2004, TS Lê Minh Viễn, người đứng đầu Công ty Nuôi trồng thủy sản và thương mại Viễn Thành, đã nghiên cứu sản xuất hàu giống qua phương pháp sinh sản nhân tạo và nuôi hàu thương phẩm Năm 2004, Sở Khoa học và Công nghệ TP HCM đã kiểm tra và đánh giá kết quả dự án này Phương pháp này, đã được áp dụng thành công ở nhiều quốc gia trong vài thập kỷ qua, cho phép sản xuất hàu có ngoại hình đẹp, kích cỡ đồng đều, vỏ mỏng và tỷ lệ thịt/vỏ lên đến 25% Đặc biệt, mức hao hụt trong quá trình khai thác hàu thương phẩm rất thấp, chỉ khoảng 3-5%.
Vào tháng 12/2013, Sở Khoa học và Công nghệ Quảng Ninh đã hợp tác với Trung tâm Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm (Hà Nội) để nghiên cứu quy trình sản xuất các sản phẩm từ hàu, bao gồm hàu sấy khô, nem hàu và hàu tẩm gia vị, nhằm mở rộng thị trường cho sản phẩm hàu thương phẩm chất lượng Đồng thời, sản phẩm ruốc hàu Vân Đồn cũng đã được đưa vào chương trình thúc đẩy thương mại.
OCOP dành cho các sản phẩm nôngnghiệp địa phương tạitỉnh Quảng Ninh vàonăm
Kể từ năm 2015, Vân Đồn đã được hỗ trợ tài chính nhằm nâng cao khả năng sản xuất, chuẩn hóa quy trình sản xuất, thiết kế nhận diện thương hiệu, cải thiện bao bì và xây dựng website để quảng bá sản phẩm.
Công ty Dược - Trang thiết bị y tế Bình Định (BIDIPHAR) đã nâng cao giá trị hàu thương phẩm thông qua dự án xây dựng mô hình sản xuất giống và chế biến thực phẩm chức năng từ hàu trong giai đoạn 2011 - 2014 Dự án này thuộc chương trình phát triển bền vững, góp phần vào sự phát triển của ngành thủy sản địa phương.
Trong giai đoạn 2011-2015, việc hỗ trợ ứng dụng và chuyển giao tiến bộ khoa học công nghệ đã góp phần quan trọng vào sự phát triển kinh tế - xã hội ở nông thôn và miền núi Một trong những kết quả nổi bật là quy trình sản xuất bộ hàu đông khô từ hàu tươi, kết hợp giữa các phương pháp chiết xuất truyền thống và kỹ thuật đông khô, với sản phẩm được làm khô ở nhiệt độ âm.
Nghiên cứu về vẹm xanh tại Việt Nam hiện tập trung vào đặc điểm sinh trưởng và sinh sản Cụ thể, trong môi trường nuôi tôm hùm lồng ở Khánh Hòa, vẹm xanh có tốc độ tăng trưởng chiều dài vỏ đạt khoảng 4.6 mm/tháng và khối lượng phần thân mềm trung bình là 1,1 g/tháng sau 11 tháng nuôi Về sinh sản, tỷ lệ đực cái là 1:0,84 và vẹm xanh tham gia sinh sản lần đầu vào tháng 9.
Cơ SỞ LÝ THUYẾT
Nguyên liệu
Mau hàu (C gigas) và vẹm xanh (P viridis) được thu hoạch từ trang trại Long Sơn, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, trong quý II hàng năm (từ đầu tháng 4 đến cuối tháng 6) Trong quá trình thu nhận và vận chuyển, hàu và vẹm xanh được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4°C) Sau khi đưa về phòng thí nghiệm, mẫu được cân, xay nhỏ và sấy khô đến khi đạt khối lượng ổn định.
SEB-Neutral PL là một enzyme protease lỏng, chuyên dụng cho việc phân hủy protein, giúp tăng cường độ hòa tan và phân tán của protein Enzyme này hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ từ 35 đến 60°C và pH từ 5,5 đến 7,5, với hoạt tính đạt 750 IU Sản phẩm được cung cấp bởi Công ty TNHH Dịch vụ Đầu tư và Xúc tiến Thương mại Hưng Thịnh Việt Nam.
Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Bảng 2.1 Danh sách các thiết bị sử dụng trongthí nghiệm
STT Thiết bị Hãngsản xuất
3 Máy đo quang phổ Thermo Scientific
6 Máy ly tâm falcon Hettich
7 Máy ly tâm lạnh Hettich
9 Nồi hấp tiệt trùng STURDY
Bảng 2.2 Danh sách các hóachất sử dụng trong thí nghiệm
STT Hóa chất Công thứchóa học Hãng
4 Axit axetic CH3COOH Xilong
9 Copper (II)sulfate CUSO4.5H2O Xilong
13 Ethylene glycol (CH2OH)2 Xilong
22 N-Hippuryl-His-Leu hydrate - Sigma
23 Ninhydrin CốH4(CO)2C(OH)2 Merck
24 n-propanol ch3 ch 2ch2 oh JHD
26 Potassium ferricyanide K3Fe(CN)ó Xilong
27 Sodium acetate CH3COONa.3H2O Xilong
28 Sodium carbonate Na2CO3 Xilong
32 Sodium tetraborate Na2 [B4 O5 (OH)4 ] Fisher
Bảng 2.3 Danh sách cácdụng cụ sử dụng trong thí nghiệm
1 Bình định mức (50mL, 100mL) Đức
2 Bình tam giác (100mL, 250mL) Đức
3 Cốc thủy tinh (100mL,250mL, 500mL) Đức
5 Đầu tip (100 pL, 200 pL, 1000 pL) Trung Quốc
8 Giá đỡống nghiệm Việt Nam
9 Hộp đựng đầu tip Trung Quốc
13 Ống đong(100 mL, 250 mL) Đức
14 ỏng nghiệm có nắp Đức
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng thủy phân
Hàu và vẹm xanh, mỗi loại 5 kg, được mua và chuẩn bị cho các thí nghiệm Sau khi thu mua, chúng được chuyển về phòng thí nghiệm ở nhiệt độ lạnh 4°C, sau đó tiến hành tách thịt thủ công và rửa sạch nhiều lần Tiếp theo, thịt hàu và vẹm xanh được xay nhuyễn bằng máy xay Tefal BL438166 trong ba lần, mỗi lần kéo dài một phút Cuối cùng, mẫu thịt đã xay được sấy khô ở nhiệt độ 40°C.
-50±2°c đến khi đạt khối lượng không đổi đểthu được nguyên liệu bộthàu và vẹm xanh [39, 45].
Hình 2.1 Nguyên liệu sau khixay nhỏ và sấyđếnkhiđạtkhối lượngkhôngđẫi (A)
2.3.2 Phương pháp thủy phẫn bằng protease
Chuẩn bị hỗn hợp cơ chắt (hàu hoặc vẹm xanh) và enzyme protease với các tỷ lệ E/S khảo sát là 0, 2, 4, 6, 8, 10% trong bình tam giác 250 ml Các điều kiện thủy phân được cố định bao gồm nhiệt độ 55°C, pH 7,0 và thời gian phản ứng 30 phút Sau đó, hỗn hợp được đun ở 90°C trong 15 phút để dừng phản ứng Cuối cùng, ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch thủy phân, với các thí nghiệm được lặp lại hai lần Sản phẩm thủy phân tạo thành được đánh giá bằng phương pháp ninhydrin, trong đó ninhydrin (1,5 g) được chuẩn bị trong 10 ml đệm axetat, sau đó bổ sung lần lượt 30 ml ethylene glycol, 15 ml n-propanol và 15 ml n-butyl alcohol Hút 3 ml dịch thủy phân và 1 ml dung dịch ninhydrin vào ống nghiệm, trộn đều và đun sôi trong 20 phút để xảy ra phản ứng Sau khi đun xong, nhanh chóng làm lạnh ống nghiệm trong bồn nước đá Cuối cùng, hút 1 ml ethanol (40% v/v) để phản ứng màu diễn ra Độ hấp thụ của các mẫu phản ứng được đo ở bước sóng 570 nm, sử dụng glycine làm đường chuẩn, và hàm lượng sản phẩm thủy phân được tính theo nồng độ mol suy ra từ đường chuẩn của glycine.
Chuẩn bị hỗn hợp co chất (hàu hoặc vẹm xanh) và enzyme protease trong bình tam giác 250 ml với tỷ lệ E/S đã xác định Tiến hành thủy phân trong khoảng thời gian 120, 240, 360, 480 và 600 phút, duy trì pH 7,0 và nhiệt độ 55°C Sau khi phản ứng kết thúc, đun hỗn hợp ở 90°C trong 15 phút để dừng phản ứng Cuối cùng, ly tâm hỗn hợp ở tốc độ 13.000 vòng/phút.
15 phút để thu dịch thủy phân Sản phẩm thủy phân tạo thành được đánh giá bằng phưong pháp ninhydrin Các thí nghiệm đượclặplại ba lần. Độ pH
Sau khi xác định tỷ lệ E/S và thời gian phản ứng tối ưu cho việc thủy phân hàu và vẹm xanh bằng enzyme protease, nghiên cứu tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của độ pH môi trường ở các mức 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; và 8,0 tại nhiệt độ 55°C Sau thời gian phản ứng, hỗn hợp được đun ở 90°C trong 15 phút để ngừng phản ứng Cuối cùng, dịch thủy phân được thu được bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút Sản phẩm thu được được đánh giá bằng phương pháp ninhydrin và các thí nghiệm được lặp lại ba lần.
2.3.2.2 Xácđịnh hiệu suấtthủy phân (DH%)
Hiệu suất thủy phân được xác định bằng phương pháp so màu ninhydrin, dựa trên sự oxy hóa của axit amin, dẫn đến việc tạo ra aldehyde, ammoniac và axit camonic Các axit amin có khối lượng phân tử nhỏ và ammoniac sẽ oxy hóa ninhydrin, tạo ra phức hợp màu xanh tím với độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 570 nm Để thực hiện, ninhydrin (1,5 g) được hòa tan trong 10 ml đệm axetat, sau đó bổ sung 60 ml ethylene glycol, 15 ml n-propanol và 15 ml n-butyl alcohol Cuối cùng, hút 3 ml dịch thủy phân và 1 ml dung dịch ninhydrin vào ống nghiệm, trộn đều và đun sôi hỗn hợp trong 20 phút để phản ứng xảy ra.
Sau khi đun xong, nhanh chóng làm lạnh ống nghiệm chứa hỗn hợp phản ứng trong bồn nước đá Tiếp theo, hút 1 ml ethanol (40% v/v) để kích thích phản ứng màu Đo độ hấp thụ của phản ứng màu ở bước sóng 570 nm, sử dụng glycine làm chất chuẩn Giá trị DH% được tính theo công thức: DH = [(A2 - A1) / A2] x 100%, trong đó A2 là hàm lượng sản phẩm sau thủy phân (111M) và A1 là hàm lượng sản phẩm mẫu đối chứng (mM) Các thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác.
Sau khi thực hiện quá trình thủy phân, các sản phẩm từ hàu và vẹm xanh sẽ được đông khô Sản phẩm đông khô này sẽ được sử dụng để đánh giá các hoạt tính sinh học.
2.3.3 Phương pháp xác định tong hàm lượng protein [47]
Tổng lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry, dựa trên cường độ màu sản phẩm khử của phức hợp đồng - protein với phosphomolipden - phosphovonphramate trong thuốc thử F - C Giá trị cường độ màu tại bước sóng 750 nm có mối quan hệ tương ứng với hàm lượng protein có trong mẫu.
Chuẩn bị hỗn hợp bằng cách kết hợp 0,5 ml mẫu (dịch thủy phân hoặc bột sấy phun) với 2,5 ml dung dịch có tỷ lệ A:B:C là 50:1:1 Dung dịch A bao gồm NaOH 0,1M và Na2CO3 2%; dung dịch B là Na2SO4 1%; và dung dịch C là CuSO4.5H2O 0,5% Sau khi lắc đều, ủ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra Tiếp theo, bổ sung 0,25 ml thuốc thử F-C 0,5 N, đồng nhất và ủ thêm 60 phút Đo độ hấp thụ màu ở bước sóng 750 nm bằng máy quang phổ UV-Vis và tính toán hàm lượng protein tổng số dựa trên đường chuẩn BSA Các thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.
2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
2.3.4 ỉ Hoạttỉnh thu gom gốc tự do DPPH [49]
Phản ứng được thực hiện bằng cách hút 1,0 ml dịch thủy phân với các nồng độ khác nhau (20, 40, 60, 80 và 100 mg/ml) và trộn với 4,0 ml DPPH 0,076 mM hòa tan trong methanol Sau khi lắc đều, hỗn hợp được giữ trong bóng tối ở 25°C.
Trong nghiên cứu này, độ hấp thụ màu của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 517 nm bằng máy UV-Vis sau 30 phút Tỷ lệ thu gom gốc DPPH được tính bằng công thức: Tỷ lệ thu gom (%) = [(Ađối chứng - Amàu) / Ađối chứng] x 100, trong đó Ađối chứng là độ hấp thụ của mẫu đối chứng (dung dịch DPPH không chứa dịch thủy phân) và Amàu là độ hấp thụ của mẫu thử Đường chuẩn được xây dựng từ các nồng độ axit ascorbic để thay thế cho các dịch thủy phân, và các thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác.
2.3.4.2 Hoạttỉnh thu gom gốc ABTS [50]
Để chuẩn bị dung dịch gốc tự do ABTS’+, trộn dung dịch A (ABTS 7 mM) và dung dịch B (natri persulfate 2,45 mM) theo tỷ lệ 1:1 trong cốc thủy tinh Sau đó, khuấy đều hỗn hợp và ủ trong 16 giờ ở 25°C trong bóng tối Sau thời gian ủ, pha loãng hỗn hợp bằng nước cất hai lần cho đến khi độ hấp thụ màu đạt giá trị 0,70 ± 0,02 tại bước sóng 734 nm Phản ứng sẽ bắt đầu sau khi hoàn tất các bước chuẩn bị.
Trong nghiên cứu này, 100 pl dịch thủy phân ở các nồng độ khác nhau (20, 40, 60, 80, và 100 mg/ml) được trộn với 3 ml dung dịch ABTS’+, sau đó lắc và ủ trong bóng tối trong 6 phút Độ hấp thụ màu được đo ở bước sóng 734 nm, và phần trăm hoạt động thu gom gốc ABTS được tính bằng công thức: [(Ađối chứng — Amẫu) / Ađối chứng] x 100, với Ađối chứng là độ hấp thụ của dung dịch ABTS’+ không chứa dịch thủy phân và Amẫu là độ hấp thụ của mẫu thử Đường chuẩn được xây dựng bằng cách sử dụng một loạt nồng độ axit ascorbic để thay thế cho các dịch thủy phân, và các thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác.
Hút lần lượt 1,0 ml dịch thủy phân được pha loãng với các nồng độ khác nhau (50,
To prepare the solution, combine 2.5 ml of 1% potassium ferricyanide with 2.5 ml of a 0.2 M phosphate buffer at pH 6.6 in a test tube Mix the solution thoroughly and incubate it at 50°C for 20 minutes After the incubation period, add 2.5 ml of 10% trichloroacetic acid and proceed to centrifuge the mixture.
Để thực hiện quy trình, quay 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi Hút 2,5 ml dịch nổi vào ống nghiệm mới, sau đó bổ sung lần lượt 2,5 ml nước cất hai lần và 0,5 ml ferric chloride 0,1% Tiến hành đồng nhất hỗn hợp và ủ trong 10 phút Đo độ hấp thụ màu của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng đã chỉ định.
KẾT QUẢ NGHIÊN CÚƯ
Hoạt tính kháng oxy hóa
3.2.1 Hoạt tính thu gom gốc tự do DPPH
Hoạt tính thu gom gốc DPPH của dịch thủy phân từ hàu và vẹm xanh ở các nồng độ khác nhau cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa khả năng thu gom gốc tự do DPPH và nồng độ mẫu Cụ thể, dịch thủy phân từ hàu đạt hoạt tính thu gom cao nhất là 87,40 ± 0,84% ở nồng độ 100 mg/ml, tương tự như các nghiên cứu trước đây về sản phẩm thủy phân từ hàu c gigas và hàu cucuUata với hoạt tính thu gom lần lượt là 85,25% và 85,7% Tuy nhiên, hoạt tính thu gom từ sản phẩm thủy phân của hàu (C talieỉĩwhannensis) chỉ đạt 64,52%, cho thấy sự khác biệt đáng kể.
Sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh cho khả năng loại bỏ gốc DPPH cao nhất đạt 88,43 ± 0,96% ở nồng độ 100 mg/ml, tương tự như nghiên cứu về vẹm New Zealand (P canaliculus) với khả năng thu gom đạt 82 - 87%, nhưng cao hơn đáng kể so với sản phẩm thủy phân từ vẹm (Mytilus edulis) chỉ đạt 28,8% Giá trị IC50 của hoạt tính thu gom gốc tự do DPPH cũng được tính toán, cho thấy sản phẩm thủy phân từ hàu có giá trị IC50 là 42,670 ± 0,83 mg/ml, cao hơn so với vẹm xanh là 38,819 ± 1,07 mg/ml, chứng tỏ dịch thủy phân từ vẹm xanh có khả năng thu gom gốc tự do DPPH tốt hơn.
Hình 3.5 Hoạt tính thu gom gốc tự do DPPH (A)Mau dịchthủy phân từ hàu và vẹm xanh (B) Biểu đồ giá trị IC50
3.2.2 Hoạt tính thu gom gốc tự đo AB TS
Các sản phẩm thủy phân từ hàu và vẹm xanh đều cho thấy hoạt tính thu gom gốc tự do ABTS phụ thuộc vào nồng độ mẫu, với dịch thủy phân từ vẹm xanh đạt hoạt tính cao nhất là 81,106 ±0,22% ở nồng độ 100 mg/ml, vượt trội hơn so với hàu (72,25 ± 1,31%) ở cùng nồng độ Kết quả này cũng cao hơn so với các nghiên cứu trước đó về khả năng thu gom gốc của sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh (P canaliculus).
Sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh cho thấy khả năng thu gom gốc tự do ABTS cao hơn so với sản phẩm thủy phân từ bột hàu, với giá trị IC50 lần lượt là 35,44 ± 2,98 mg/ml và 53,871 ± 3,36 mg/ml Kết quả này tương tự như thử nghiệm DPPH, cho thấy hiệu quả vượt trội của vẹm xanh trong việc thu gom gốc tự do.
Hình 3.6 Hoạt tính thu gom gốc tự do ABTS (A)Mau dịchthủy phân từ hàu và vẹm xanh (B) Biểu đề giá trị IC50
Năng lực khử là một chỉ số quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa Khi có sự hiện diện của chất kháng oxy hóa, nó sẽ khử phức hợp ferricyanua Fe3+ (màu vàng) thành dạng sắt Fe2+ (màu xanh lá cây/xanh lam) Mức độ màu thay đổi tùy thuộc vào năng lực khử của từng hợp chất, và được xác định bằng phương pháp đo màu ở bước sóng 700 nm.
Hỉnh 3.8A thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa năng lực khử và nồng độ mẫu của mẫudịch thủy phân từ hàu vàvẹm xanh Đối với mẫu dịch thủy phân từ hàu,độhắp thụ tốiđa ởbước sóng700 nm là 1,049±0,01 ở 250 mg/ml và độhắp thụ tối thiểu là 0,301 ±0,01 ở 50 mg/ml Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Dong và cộng sự
(2010) đánh giá dịch thủy phân từ hàu (C taliemvhannensis), nhưng lại thắp hơn nhiều so với sản phẩm thủyphântừ hàu s cticidlatevà c rividarisvới giá trị OD ở
Ở bước sóng 700 nm, các mẫu có độ hấp thụ lần lượt là 2,63 và 2,54 Đối với mẫu dịch thủy phân từ vẹm xanh, độ hấp thụ tối đa đạt 1,698 ± 0,02 tại nồng độ 250 mg/ml, trong khi độ hấp thụ tối thiểu là 0,479 ± 0,01 ở nồng độ 50 mg/ml Kết quả này cao hơn so với dịch chiết bằng methanol từ vẹm xanh, nơi độ hấp thụ tối đa nhỏ hơn 1,0.
Kết quả phân tích cho thấy mẫu dịch thủy phân từ vẹm xanh có khả năng khử cao hơn, đạt 0,324 ± 0,004 pAAE/mg, so với mẫu dịch thủy phân từ hàu chỉ đạt 0,188 ± 0,003 pAAE/mg.
Hình 3.7 Năng lực khử (A) Mau dịchthủy phân từ hàu và vẹm xanh (B) Đương lượng pg vitaminc trênmgmẫu (pgAAE/mg)
Hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của dịch thủy phân từ hàu và vẹm xanh được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên môi trường MHA với các chủng vi khuẩn E coli ATCC 25922, S aureus ATCC 25923 và V parahaemolyticus Kết quả thử nghiệm cho thấy không có sự hình thành vòng ức chế ở tất cả các nồng độ sản phẩm thủy phân, cho thấy sản phẩm này không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm Đặc điểm kháng khuẩn yếu của dịch thủy phân từ hàu và vẹm xanh tương tự như kết quả nghiên cứu trước đó về sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh (P canaliculus) ở New Zealand.
Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng 32 hoạt tính kháng khuẩn đã được xác định đối với các chủng vi khuẩn như S coll (ATCC 25922), Bacillus cereus (ATCC 10702), S aureus (ATCC 6538) và Candida albicans Ngoài ra, nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2015) cho thấy sản phẩm thủy phân từ hàu (C glgas) có khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus và V haĩveyl với đường kính kháng khuẩn lần lượt là 13,44 mm và 10,76 mm, nhưng lại thể hiện khả năng kháng yếu hoặc không kháng với các chủng vi khuẩn khác như S coll và S aureus.
Hình 3.8 Hoạt tính khángkhuẩn (A) Sản phẩm thủy phân từ hàu (B) Sản phẩm thủy phân từvẹm xanh
Hoạt tính ức ché ACE
Enzym chuyển đồi angiotensin I (ACE) xúc tác quá trình chuyển đồi angiotensin I thành angiotensin n là một chắt có tác dụng gây co mạch mạnh làm tăng huyết áp
[60] Nhiều hợp chắt có hoạttính chống oxy hóa cũng mang hoạt tính ức chế ACE
[61] Trongnghiên cứunày, cả hai mẫu dịchthủy phân từ hàuvàvẹm xanh đã được đánh giá và đều thểhiện hoạttính ức chế ACE, kếtquảthể hiện qua Hình3.10.
Tỷ lệ ức chế của các mẫu thủy phân phụ thuộc vào liều lượng, với dịch thủy phân từ hàu đạt 65,89 ± 2,40% ở nồng độ 250 mg/ml, cao nhất trong nghiên cứu Kết quả này tương tự như sản phẩm thủy phân từ hàu (C talienwhanensis Crosse) nhưng thấp hơn so với nghiên cứu của Zhang và cộng sự, nơi sản phẩm thủy phân từ hàu đạt 75,92% Đối với mẫu dịch thủy phân từ vẹm xanh, hoạt tính ức chế ACE cao nhất ghi nhận là 64,038 ± 2,69%, tương tự với sản phẩm thủy phân từ vẹm.
M edulis [63] Tuy nhiên, mộtnghiên cứu của Jayaprakash và cộng sựđánh giá sản phẩm thủy phân từ vẹm p canaliculus với enzyme pepsin có thể đạt hiệu quả ức chế ACEđến 91% [56],
So sánh giá trị IC50 cho thấy hoạt tính ức chế ACE của vẹm xanh (194,837 ± 6,64 mg/ml) cao hơn so với hàu (169,376 ± 7,96 mg/ml), mặc dù sự khác biệt không đáng kể Kết quả này có thể được giải thích bởi dịch thủy phân từ vẹm xanh chứa nhiều axit amin tự do và peptit mạch ngắn có hoạt tính ức chế ACE hơn so với dịch thủy phân từ hàu.
Hình 3.9 Hoạt tínhức chế ACE (A) Ivíẫu dịchthủy phân từ hàu và vẹm xanh (B)
Biểu đồ giá trị IC50
Xác định trình tự peptit bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Trình tự axit amin và khối lượng phân tử của các peptit trong dịch thủy phân từ hàu và vẹm xanh đã được xác định bằng phương pháp LC-MS/MS Kết quả cho thấy có 4 trình tự peptit từ hàu (Hl, H2, H3, H4) và 3 peptit từ vẹm xanh (V1, V2, V3) Các trình tự peptit được xác định bao gồm TEAPLNPK (868.4589 Da), AVDNGTFR (878.4272 Da), IIAPPERKY (1085.6262 Da), IIAPPER (794.4695 Da) từ hàu, và TEAPLNPK (868.472 Da), GPSIVHR (764.4263 Da), IIAPPERK (922.5639 Da) từ vẹm xanh (Hình 3.11).
Hoạt tính kháng oxy hóa của peptit phụ thuộc vào thành phần và vị trí axit amin, đặc biệt là các axit amin kỵ nước và một số axit amin như Met, His, Lys, và Gly, có khả năng thu gom gốc tự do đáng kể Nghiên cứu cho thấy phân đoạn H4 từ hàu và V3 từ vẹm chứa nhiều axit amin kỵ nước nhất, lần lượt đạt 71,43% và 62,5% Hơn nữa, mạch nhánh của Tyr là một nucleophile mạnh, có khả năng cung cấp electron cho các hợp chất tích điện dương như ABTS’+, từ đó cải thiện khả năng thu gom gốc tự do của peptit Do đó, peptit H3 thủy phân từ hàu với sự hiện diện của gốc Tyr ở đầu c có thể góp phần tăng khả năng thu gom gốc tự do ABTS’+.
Hoạt tính ức chế ACE phụ thuộc vào hàm lượng các gốc axit amin mạch nhánh và kỵ nước, đặc biệt là gốc thơm ở đầu c của peptit, giúp chúng dễ dàng liên kết với vị trí hoạt động của ACE Peptit H3 (IIAPPERKY) có khả năng ức chế ACE nhờ chứa Tyr, axit amin có vòng thơm ở đầu c Ngoài ra, các peptit thủy phân từ hàu và vẹm xanh cũng cho thấy hàm lượng axit amin kỵ nước cao, trong đó H4 (IIAPPER -71,43%) có hàm lượng cao nhất và H2 (AVDNGTFR) có hàm lượng thấp nhất.
- 37,5%) (Bảng 3.2) Ngoài H3, cácpeptit còn lại đều chứa Lys hoặc Arg ở đầu c, 2 axit amin tích điện dương này sẽgóp phầnthúc đẩy khảnăng ứcchế ACE [69].
Hình 3.10Kết quả phân tích LC - MS/MS của mẫu dịchthủy phân hàu (A) Phồ LC/MS (B) Trình tự axit am in củacác peptit có trong dịchthủy phân
GPS1V1IR tô0 '3> vin ằô I0Ọ 3X1 ĨĨỌ ĩin 2to 35Ọ ằ1 350 3ô w 3W 4W *ờo ô111 ô00 no wằ wo tMO w> MO nằ rỉO 710 MO roo
Hình 3.11 Kết quả phân tíchLC - MS/MS của mẫu dịchthủy phân vẹm xanh (A)Phổ LC/MS (B) Trình tự axit amin của các peptit có trong dịchthủy phân
Bảng 3.1 Trình tự axitamin của cácpeptit thủy phân từ hàu và vẹm xanh
Mẫu Các peptit Khối lượng phân tử (Da)
Hàm lượng axit amỉn kỵ nước (%) Hàu
Docking phân tử
Kết quả docking phân tử các peptit thủy phân từ hàu và vẹm xanh với ACE cho thấy các peptit từ hàu có năng lượng liên kết thấp hơn so với peptit từ vẹm xanh Đặc biệt, phân đoạn H3 (IIAPPERKY) có năng lượng liên kết thấp nhất là -11,5 kcal/mol, cho thấy khả năng ức chế ACE tốt nhất So với captopril, chất ức chế tổng hợp có năng lượng liên kết cao hơn (-5,4 kcal/mol), điều này chỉ ra rằng các peptit có khả năng liên kết với ACE dễ dàng hơn và tạo ra phức hợp ổn định hơn so với captopril.
Liên kết hydro đóng vai trò quan trọng trong việc kết nối các chất ức chế với ACE, với số lượng liên kết hydro cao có thể làm tăng khả năng ức chế ACE Cụ thể, các peptit Hl, H2, H3 và H4 từ hàu lần lượt có 13, 9, 7 và 6 liên kết hydro, trong khi các peptit V5, V6 và V7 từ vẹm xanh chỉ có 8, 7 và 7 liên kết hydro Kết quả cho thấy phân đoạn HI của hàu có số lượng liên kết hydro cao hơn đáng kể so với các phân đoạn khác, phù hợp với hoạt tính ức chế ACE của sản phẩm thủy phân từ hàu, vượt trội hơn so với vẹm xanh.
Các axit amin đóng vai trò tưong tác chínhnằm trong trung tâm hoạt động của ACE được chia thành 3 nhóm chính SI, S2 và Sl’ (Sl: Ala354, Tyr523 và Glu384; S2:
Peptit TEAPLNPK và AVDNGTFR từ hàu có khả năng tạo liên kết hydro với Tyr523, cho thấy chúng có khả năng ức chế hoạt động của ACE thông qua nhóm SI Bên cạnh đó, TEAPLNPK còn có khả năng liên kết với His513, từ đó tăng cường khả năng ức chế thông qua nhóm S2 Tương tự, peptit TEAPLNPK từ vẹm xanh cũng có khả năng tạo liên kết với His353 thuộc nhóm S2.
Bảng3.2 Năng lượng liên kết và các liên kếtxuất hiện giữa các peptit hoặc captopril với ACE
Các peptit Năng lượng liên kết (kcal/mol) Khoảng cách (Ả) Hàu
Aspl21 (2.5); Tyr213 (2.8); Ser219 (2.3, 2.5); H1S513 (2.5); Tyr523 (2.6); Asn70 (2.0, 2.1); Asn66 (2.2); Glu403 (2.4); Arg522 (2.3, 2.8); Ser222(2.1).
Asn70 (2.5); Tyr523 (2.1, 2.5); Arg522 (2.3, 2.4, 2.6); Ser516 (2.2); Argl24 (2.4); Tyr360 (2.1).
Glu403 (2.6); Arg522 (2.2); Asp358 (1.9); Thr92 (2.5), Argl24 (2.7); Asn85 (2.2); Tyr62 (2.2).
Ser355 (2.7); Tyr360 (2.3); His353 (2.3); Asn70 (2.3); Tyr62 (2.8); Asn66 (2.1, 2.5); Argl24 (2.6).
Hình 3.12 Hình ảnh 3D (Bên trái) và 2D (Bên phải) mô phỏngkết quả docking phân tử của các peptit và captopril VỚI ACE (A) TEAPLNPK (B) AVDNGTFR (C) IIAPPERKY (D) IIAPPER (E) TEAPLNPK (F) GPSĨVHR (G) IIAPPERK (H)
Hình 3.13 (Tiếp theo) Hình ảnh 3D (Bên trái) và 2D (Bên phải) môphỏngkếtquả dockingphân tử của các peptit và captopril với ACE (A)TEAPLNPK (B) AVDNGTFR (C) IIAPPERKY (D) IIAPPER (E) TEAPLNPK (F) GPSIVHR
Phương pháp sấy phun được áp dụng để ổn định các hợp chất peptit sinh học trong các chất mang, trong đó maltodextrin là lựa chọn phổ biến nhờ giá thành thấp và độ hòa tan cao Sản phẩm thủy phân từ hàu và vẹm xanh được sấy phun với 15% maltodextrin (w/v) tạo ra bột màu vàng nhạt, với độ ẩm lần lượt là 9,37% và 9,09%.
Kết quả đánh giá bột sấy phun cho thấy hàm lượng tổng protein trong bột sấy phun từ hàu và vẹm xanh lần lượt là 12,19 ±0,25 và 15,67 ± 0,84 mgBSA/mg, thấp hơn so với sản phẩm dịch thủy phân ban đầu (24,49 ± 0,38 và 22,00 ± 0,08 mgBSA/mg) Tương tự, hoạt tính thu gom gốc tự do DPPH và ABTS của sản phẩm bột sấy phun cũng thấp hơn đáng kể so với dịch thủy phân ở mẫu hàu và vẹm xanh Nguyên nhân có thể do điều kiện sấy phun chưa phù hợp và lượng mẫu sau khi sấy chưa được thu hồi tối đa Hơn nữa, việc sử dụng maltodextrin có thể gây ra một số nhược điểm như thiếu hoạt động bề mặt và khả năng tạo màng thấp.
Hình 3.14 Sản phẩm thủy phân saukhi sấyphun (A) Sản phẩm thủy phân từ hàu
(B) Sản phẩm thủy phân từ vẹm xanh
Bảng 3.3 Kết quả bột sấy phun sản phẩm thủy phân từ hàu vàvẹm xanh
Hàm lưọng protein (mgBSA/mg)
Dịch thủy phân - 24,49 ± 0,38 42,67 ± 3,30b 53,87 ± 3,36b Bột sấy phun 9,37 12,19±0,25 65,91±4,44c 73,46 ± 1,5ld
Dịch thủy phân - 22,00 ± 0,08 38,82 ± 0,83b 35,45 ± 2,62c Bột sấy phun 9,69 15,67±0,84 65,12±3,65c 102,7 ± 5,92e
Vitamin c - - 0,007 ± 0,00a 0,018 ±0,00a Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê tại p < 0,05.