2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn chịu mặn vùng trồng lúa khu vực ĐBSCL.
Xác định khả năng chịu mặn tối da, khả năng phân giải lân và IAA của vi khuẩn.
Đánh gia sự ảnh hưởng của vi khuân đên sự nảy mâm va sinh trưởng của giông
lúa trong điều kiện nhiễm mặn nhân tạo.
2.2 Thời gian và địa điểm
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2023 đến 08/2023.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh cây khoa Nông học trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM.
2.3 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
2.3.1 Vật liệu nghiên cứu
Mẫu đất trồng lúa từ vùng từng ngập mặn tại 2 tỉnh (Tiền Giang, Bến Tre)
thuộc ĐBSCL.
Hạt giống được sử dụng trong thí nghiệm là giỗng OM5451.
Quy ước đặt tên mẫu: Mẫu được mã hóa theo địa điểm thu mau, cây thu mẫu, vị trí thu mẫu và số thứ tự mau, cụ thé:
TGLDI(TG: Tiền Giang, L: lúa, D:đất, 1: mẫu số 1)
Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu và địa điểm thu mẫu STT Kíihiệu Địa chỉ thu mẫu
1 TGLDI Xã Long Bình Điền, Huyện Chợ Gạo, Tỉnh Tiền Giang 2 TGLD2 Xã Tân Thành, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền Giang
3 TGLD3 Ấp Rach Bun, Xã Tân Điền, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền
Giang
4 TGLD4 Áp Trung, Xã Tân Điền, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền Giang 5 TGLRI Xã Long Bình Điền, Huyện Chợ Gạo, Tỉnh Tiền Giang
6 TGLR2 Xã Tân Thành, Huyện Gò Công Đông, Tỉnh Tiền Giang 7 BTLDI Ấp Tân An, Xã Thạnh Phước, TT Bình Đại, Tỉnh Bến Tre 8 BTLD2 Ap 3, Xã Thạnh Phước, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre
9 BTLD3 Ápó, Xã Thanh Phước, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre 10 BTLD4 Ap 1, Xã Bình Thới, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre II BTLRI Ap 3, Xã Thanh Phước, TT Binh Dai, Tinh Bến Tre
Dung cu va thiét bi: dia petri (đường kính 80 mm), ống eppendorf, bình tam giác, ống nghiệm có nắp, bộ micropipette (Nichiryo, Nhat), ống Falcon, thước do, dụng cụ cấy.
Các thiết bị gồm: tủ cấy khử trùng (IIAC2 — 4E8, Esco, Singapore), nồi hấp khử trùng (MC40L, ALP, Japan), cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện, kính hién vi (CX23, Olympus, Japan), máy lắc (SSLI, Stuart, Anh), Máy Nanovue Plus (Anh), Máy ly tâm Z130M (Hermle - Đức), Máy lắc Vortex - ZX3 (Velp, Ý).
2.3.2 Hóa chất
Môi trường được sử dụng dé nuôi cấy vi khuẩn là môi trường Luria Broth (LB) Môi trường dùng để giữ nguồn vi khuẩn là Glycerol 40%, Pepton 1%
Môi trường phân giải lân là môi trường Pikovskaya
Môi trường tăng sinh IAA là môi trường LB có bổ sung L-Tryptophan
Môi trường NBRIP đặc
Dung dịch đệm phosphate (1X PBS) 16
Thuốc thử Van Urk Salkowski
Hóa chất nhuộm Gram: Crystal Violet, Lugol, Alcohol, Safranin 2.3.3 Thanh phan môi trường
Môi trường LB (Luria Broth): pepton 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10g, agar 20 g, nước cất 1000 ml.
Môi trường long LB (Luria Bertani) bổ sung L — tryptophan: peptone — casein 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, L — tryptophan 1 g, nước 1000 ml.
Môi trường Pikovskaya Agar: Glucoza 10 g, Ca3(PO4)2 5 g, (NH4)2SO4 0,5 g,
KCI 0,5 g, MgSO..7H20 0,1 g, FeSO¿ (vết), MnSO¿ (vết), cao nam men 0,5 g, agar 20 g, nước cat 1000 ml (TCVN 6167:1996).
Dung dịch đệm phosphate (1X PBS): NaCl 8 g, KCI 0,2 g, Na;HPO¿ 1,42 g,
KHằPO, 0,24 g, nước cat 800ml.
Thuốc thử Van Urk Salkowski: FeCl; 15 ml, HzSO¿ 98% 300 ml, nước cất 500
ml (TCVN 6167:1996).
Môi trường NBRIP đặc: Succrose 10 g, (NH4)2SOx 0,1 g, MgSOx.7HaO 0,25 g,
KCl 0,2 g, MgCh.6H20 5 g, Ca3(POx)25 g, nước cất 1000 ml.
2.4 Phuong pháp thực hiện thi nghiệm nghiên cứu
2.4.1 Thu thập và khử trùng mẫu
Mau được thu thập theo phương pháp của Kearl va ctv (2019). Cây được nhé lên khỏi mặt đất và các mẫu đất bám trên rễ cây được thu thập vào một túi zip. Các mẫu đất khác nhau được đựng vào các túi zip khác nhau, và đánh dấu theo thứ tự A — B—C (A - nơi thu mẫu, B - loại cây thu mẫu, D — đất). Dùng găng tay mỗi lần thu mẫu dé tránh nhiễm chéo giữa các mẫu. Dat từ các khu vực không có cây cũng được thu thập để làm mẫu so sánh, đối chứng. Các mẫu đất thu thập được đều được bảo quản ở 4°C cho đến khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Đối với vi sinh vật ngoại sinh, mẫu đất thu về được dé khô tự nhiên ở điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ. Dùng 0,5 g đất hoà tan trong 1 ml dung dịch đệm
1X PBS.
Đối với vi sinh vật nội sinh, mẫu rễ được khử trùng bề mặt bằng cách rửa hai lần trong nước cất vô trùng, một lần 10 phút trong 70% etanol và hai lần trong dung dịch đệm 1X PBS vô trùng và đem nghiền nát trong 1X PBS.
Phương pháp xác định pH và độ EC
Do pH va EC: Ray đất và hòa nhão 10 gam đất bang 50 ml nước cat dé lắng 1 giờ và đo độ pH bằng máy đo pH (SI Analytictv, Germany), đo EC bằng máy đo EC (SIv Analytictv, Germany). Nhúng kim đo vào mẫu nước đã lắng đất, trên thân máy sẽ hiển thị chỉ số pH và EC.
Trong tính toán lượng muối có trong đất với ý nghĩa là tổng lượng khoáng hòa tan trong đất (bao gồm các cation Ca, Mg, K, Na, NH¿ và các anion Cl, NO3, SOu, COs) vì tính phức tap va tốn kém của việc do các ion nên các nhà khoa hoc xác định độ mặn từ phép đo độ dẫn điện (EC, Hệ số chuyển đổi từ EC sang (%o hoặc %), chính sự chuyền đổi này làm lệch giá trị thật của lượng muối trong đất vì quan hệ giữa EC và chất tan không phải là quan hệ tuyến tính.
Cách chuyền đổi của FAO (Food and Agriculture Organization) như sau:
1dS/m = 0,64 %o = 0,064%
mg/l =640*ECe (dS/m)
2.4.2 Phân lập vi khuẩn và xác định kha năng chịu mặn tối đa của các chủng vi khuẩn phân lập được
Sau khi nghiền mẫu và thu được dịch, cấy trên đĩa môi trường canh thạch LB chứa IM( 6%) NaCl. Cay chuyền nhiều lần dé thu được mẫu khuẩn lạc thuần. Sau đó khuẩn lạc được cấy sang các dạng môi trường có tăng nồng độ NaCl 2M( 10%), 3M (14%) để xác định khả năng chịu mặn tối đa của các chủng vi khuẩn phân lập được.
Bảo quản chủng vi sinh vật bằng 2 phương pháp: giữ trong các ống thạch
nghiêng và giữ lạnh sâu trong glycerol.
Giữ trong ống thạch nghiêng: Chuẩn bị các ống chứa môi trường thạch nghiêng Nutrien Agar 4% NaCl đã hấp khử trùng. Cay mỗi chúng vi khuẩn đã chọn lọc vào 2 ống nghiệm, bao quan ở nhiệt độ 3 — 5°C. Thời gian bảo quản: 03 tháng.
18
Giữ lạnh sâu trong glycerol: Chuan bị 100 ml glycerol 40%, eppendorf 1,5 ml và dau tip 1000 ul (tat cả đã hấp khử trùng). Tăng sinh 24 giờ mỗi chúng trong 10 ml môi trường Nutrien Agar 40 NaCl lỏng trong ông nghiệm. Cho 500 pl glycerol 40% +
500 ul chủng tăng sinh vào eppendorf, mỗi chủng 5 eppendorf, bảo quản ở nhiệt độ — 80°C. Thời gian bảo quản: 5 — 10 năm.
2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc thuần Mô tả đặc điểm khuẩn lạc
Mô tả đặc điểm khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu hình màu sắc, hình dạng, mép khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc và kích thước tế bào, trên cơ sở đó sơ bộ phân chia các nhóm vi khuẩn dé tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình định danh.
Quan sát sự phat triên và hình dạng của khuân sau 1 ngảy nuôi cây trên môi
trường LB nhằm ghi nhận hình dang, kích thước, màu sắc khuẩn lạc.
Mô tả đặc điểm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram
Nguyên tắc: dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu của Crystal violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn Gram đương có lớp tế bao dày tạp bởi peptidoglycan, nhờ đó màu tím của Crystal violet được gắn chắc vào tế bao (nhờ iodine), nên không bị khử bởi cồn. Do đó vẫn giữ được thuốc nhuộm ban dau. Còn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bảo mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn), nhưng lại có nồng độ lipit cao, khi rửa bằng cồn chất béo này bị hoà tan kéo theo màu thuốc nhuộm ban đầu. Tế bào không màu lại bắt màu với màu hồng đỏ, còn vi khuẩn Gram đương
vẫn giữ màu xanh tím.
Phương pháp nhuộm Gram
Lấy một ít khuẩn lạc cho lên lam kính sạch (đã nhỏ nước cất, trải đều vi khuẩn trên lam kính), có định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn đèn cồn. Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thé (Crystal violet) trong 30 giây, rửa lại bằng nước. Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 30 giây, rửa lại bằng nước. Rửa mẫu bằng cồn 900 trong khoảng 5 — 10 giây, sau đó rửa lại bằng nước. Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Fuschin Zeihl trong 30 — 60 giây, rửa lại bằng nước. Dé khô, quan sát sự bắt màu của vi khuân dưới kính hiển vi ở vật kính có độ phóng dai 100 lần bằng giọt dau.
Kết quả dy kiến: Nếu là vi khuan Gram dương sẽ bắt màu tím, nếu là Gram âm sẽ bắt màu hồng. Các thao tác thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng.
2.4.4 Xác định khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn phân lập được
(TCVN 5865:2010).
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Complete randomized design — CRD) một nhân tố với các nghiệm thức khác nhau, mỗi dia petri là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm bước đầu khảo sát khả năng phân giải lân dựa trên 11 chủng vi khuẩn phân lập.
Phương pháp tiến hành
Nguồn vi sinh vật lay từ mẫu đã phân lập lưu giữ trong ống nghiệm. Chuan bị môi trường Pikovskaya lỏng và môi trường thạch Pikovskaya. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường Pikovskaya lỏng trong 72 giờ nhằm tăng sinh vi sinh vật. Sau khi tăng sinh, cấy vi sinh vật thành từng điểm riêng biệt trên môi trường thạch Pikovskaya.
Các thao tác thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Vi sinh vật sau khi cấy được dé ở nhiệt độ 35°C. Sau 48 giờ nuôi cấy, theo đối khả năng hình thành vòng phân giải của các chủng vi khuẩn.
Chỉ tiêu theo dõi:
Ghi nhận kích thước vòng phân giải (mm). Do đường kính vòng phân giải D
(mm) va đo đường kính khuẩn lạc vi khuẩn d (mm) trung bình sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Hoạt tính vòng phân giải được đánh giá bằng hiệu số D —d (mm).
2.4.5 Xác định khả năng tổng hợp 3 — indol — axetic (IAA) của chủng vi khuẩn phân lập bằng phương pháp Salkowski (Glickmann & Dessaux, 1995)
2.4.5.1 Phương pháp định tính kha năng tăng sinh IAA của các chủng vi khuẩn
phân lập được
Phương pháp tiến hành
Dùng que cấy vô trùng lấy một khoanh vi khuẩn cho vào ống nghiệm có chứa 0,9 ml nước cat, trộn đều bằng máy Vortex trong thời gian 1 phút để có dung dịch
mâu.
20
Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dung dịch mẫu cấy vào dia Petri chứa môi trường thạch đĩa Luria Bertani. Mỗi nồng độ được cấy lặp lại từ 2 đĩa petri trở lên.
Sau đó soi đĩa petri chứa vi sinh vat đã ngâm trực tiếp trong thuốc thử Salkowski đưới đèn UV. Trên đĩa petri xuất hiện màu hồng xung quanh khuẩn lạc cho thay sự có mặt của IAA.
2.4.5.2 Dựng đồ thị đường chuẩn Phương pháp tiễn hành
Cân chính xác 0,01 g IAA chuẩn hoa tan với 10 ml nước cất được dung dịch có nồng độ 1000 uum/ml (dung dich ban đầu). Chuan bị 10 bình định mức dung tích 10ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Dùng pipet lần lượt hút dung dich chuẩn gốc IAA (IAA stock) có nồng độ 1000 um/ml vào các bình định mức theo thé tích 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4;
0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều.
Chuẩn bị 10 bình định mức dung tích 10 ml và đánh số thứ tự từ 1 đến 10, Lấy 2 ml dung dịch chuẩn lam việc IAA có các nồng độ 0; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80;
90 pg/ml cho vào các bình định mức. Thêm thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn đến
vạch định mức, trộn đều.
Chú ý: tuỳ theo hàm lượng IAA do vi khuẩn tổng hợp được, có thé pha dung dịch chuẩn làm việc theo thang chuẩn làm việc IAA có nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn.
2.4.5.3 Phương pháp định lượng kha năng tăng sinh IAA của các chủng vi khuẩn
phân lập được
Hàm lượng IAA được tạo ra trong dịch lên men của các chủng vi sinh vật khảo
sát được xác định bằng phương pháp đo màu được tạo thành với thuốc thử Van Urk
Salkowski trong phương pháp của Salkowski. Chung vi sinh vật được nuôi trên môi
trường Luria broth bé sung L — tryptophan ở nhiệt độ 28°C trong 3 — 5 ngày. Sau khi ngày nuôi cấy, ly tâm thu dịch trong 2 ml dich sau ly tâm được trộn đều với 8 ml thuốc thử Salkowski và giữ trong tối. Sự xuất hiện của màu hồng trong mẫu đo cho thấy sự có mặt của hoạt chất IAA trong mẫu thử. Do độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 530 nm sau 30 phút. Đường chuẩn được dựng dựa trên các mẫu có chứa nồng độ LAA chuẩn khác nhau.
Phương trình đường chuẩn IAA có dang: y = ax + b
2.4.6 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên hat lúa từ các chủng vi
khuẩn có khả năng phân giải lân và tăng sinh 3 — indol — axetic (IAA)
Thí nghiệm đơn yếu tố theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi chậu nhựa là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm bước đầu khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng vật từ các chủng vi khuẩn phân giải lân và vi khuẩn tăng sinh IAA lên giống lúa trong điều kiện stress mặn nhân tạo ( Đào Minh Khoa, 2021).
Phương pháp tiến hành
Nguồn vi khuẩn là 6 chủng có khả năng phân giải lân và tăng sinh IAA cao được chọn lọc từ các thí nghiệm trước. Tiến hành nuôi lắc chủng vi khuẩn đã chọn lọc trên môi trường LB-L bé sung Tryptophan 0,1% không agar ở điều kiện nhiệt độ ở 30°C, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong thời gian 48 giờ dé đạt mật số 108 CFU/ml. Chọn hạt giống khỏe, sạch bệnh, tỉ lệ nảy mầm trên 85%. Khử trùng bằng dung dich NaCl 1%
trong 2 phút sau đó ngâm hạt giống trong nước cất vô trùng với tỉ lệ 2 sôi 3 lạnh trong 24 giờ và ngâm hạt giống trong dịch khuẩn 2 giờ và nước cất đối với nghiệm thức đối chứng. Trồng trên giá thé đất sạch mỗi nghiệm thức 5 hạt và bố sung nước muối NaCl
1% mỗi ngày để tạo stress mặn nhân tạo.
Chỉ tiêu theo dõi: sau 10 ngảy gieo
- Tilénay mầm = (Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt gieo) x 100%
- Chiều dai rễ: Dùng thước kẹp điện tử (mm) cô rễ đến phần dài nhất của
x
re.
2.4.7 Khao sat anh hướng của vi khuẩn đến khả năng chịu mặn của cây lúa
Phương pháp tiên hành
Dựa vào kết qua thí nghiệm trước, chọn ra dong vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng cây lúa trong điều kiện stress mặn 1M NaCl dé tiến hành thí nghiệm.
Chọn các hạt lúa khỏe mạnh và đồng đều. Hạt sau khi khử trùng, ngâm trong dung dịch nước cất 24 giờ. Gieo hạt vào giá thể đất sạch mỗi nghiệm thức 5 hạt, 3 lần lặp lại
và được xử lý với các độ mặn từ 2%, 3%, 4% va 5% NaCl. Ghi nhận nghiệm thức cây
không nảy mam và khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn đối với cây lúa ở điều kiện mặn
22
đó. Tương tự, hạt sau khi khử trùng được ngâm trong dung dịch nước cất 24 giờ và trong dịch khuẩn ở mật số 108 CFU/ml 2 giờ. Sau đó tiễn hành gieo hạt.
Chỉ tiêu theo dõi: sau 8 ngày gieo
-__ Tỉ lệ nảy mam sau = (Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt gieo) x 100%
- Chiều đài rễ của cây: Dùng thước kẹp điện tử (mm) cô rễ đến phan dài nhất của rễ.
2.4.8 Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lên khả năng nảy mầm và kích thích tăng trưởng cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên khả năng nảy mầm và kích thích tăng trưởng cây lúa sau khi nảy mầm 3, 5 và 7 ngày được thực hiện theo phương pháp đặt hạt của Rao ef al. (2006), gồm 6 nghiệm thức được được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại:
NT 1: xử lý với nước cất (đối chứng)
NT 2: xử lý với môi trường NB
NT 3: xử lý với dịch nuôi cấy vi khuẩn mật số 10° CFU/mL NT 4: xử lý với dịch nuôi cấy vi khuẩn mật số 10 CFU/mL NT 5: xử lý với dịch nuôi cấy vi khuẩn mật số 107 CFU/mL NT 6: xử lý với dịch nuôi cấy vi khuẩn mật số 108 CFU/mL
Phương pháp tiến hành
Hạt lúa sau khi rửa sạch, loại bỏ hạt lép, lửng, hạt hư và đem xử lý hạt giống với nước nóng 50 — 55°C trong 20 phút, nhằm phá vỡ miên trạng vừa diệt được mam bệnh hại bám trên hạt lúa và được ngâm trong tôi 24 giờ. Sau đó, lúa được rửa sạch và được gieo vào khay có lót giấy thấm 4m dé trong tối 48 giờ cho hạt lúa nảy mầm. Hạt lúa sau khi nảy mam được ngâm với dich nuôi cấy vi khuẩn với các mật số 10°, 105, 107, 108 CFU/mL và môi trường NB, đối chứng ngâm với nước cất. Sau khi ngâm 2
giờ, hat được đặt lên giấy thấm 20 hạt/tờ, đặt lên hạt 1 lớp giấy thấm nữa và cuộn tròn lại (không quá chặt, không quá lỏng), ủ trong điều kiện nhiệt độ phòng 28 + 2°C (Hình
3.1).
Chỉ tiêu theo dõi: Tại thời điểm 3, 5, 7 ngày.
-__ Chiều dai mầm = cổ mầm đến phan dài nhất của mầm.
- _ Chiều dai rễ: Dùng thước kẹp điện tử (mm) cô rễ đến phan dài nhất của rễ.
2.5 Xử lý số liệu
Số liệu được thu thập và xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel. Phân tích số liệu theo ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1.
24