Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết sinh học đối với tác nhân gây bệnh nứt thân xì mủ (Phytophthora sp.) trên cây sầu riêng (Durio zibethinus) trong điều kiện phòng thí nghiệm

trên cây sầu riêng Durio zibethinustrong điều kiện phòng thí nghiệm” được thực hiện từ tháng 05 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023 tại phòng thí nghiệm Bệnh học va Chân đoán, Khoa Khoa học S

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG UC CHE CUA DỊCH CHIẾT SINH HOC DOI VỚI TÁC NHÂN GÂY BỆNH NUT THAN Xi

MU (Phytophthora sp.) TREN CÂY SAU RIÊNG

(Durio zibethinus) TRONG DIEU KIEN

PHONG THÍ NGHIEM

NGANH: BAO VE THUC VAT

KHOA : 2019 — 2023SINH VIÊN THUC HIEN: TRAN HAI ĐĂNG

Tp Hồ Chi Minh, tháng 11 năm 2023

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHE CUA DỊCH CHIET SINH

HỌC DOI VỚI TÁC NHÂN GÂY BỆNH NỨT THÂN xi

MU (Phytophthora sp.) TREN CAY SAU RIENG

(Durio zibethinus) TRONG DIEU KIEN

PHONG THI NGHIEM

Tac gia TRAN HAI DANG

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầucấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

HỘI ĐÔNG HƯỚNG DẪN

TS NGUYEN NGỌC BAO CHAU WaPGS TS NGUYEN BAO QUOC “_ đếmve

Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Con xin khắc ghi công ơn to lớn đã sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ Cảm ơncha mẹ và những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con, lànguồn động lực dé cho con có thé vượt qua mọi khó khăn, vấp ngã và có được như ngày

hôm nay.

Tôi xin gửi những lời kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất đến quý thầy cô

khoa Nông học - Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền

đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, luôn tạo điều kiện quan tâm, giúp đỡ vàrèn luyện trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện khoá

luận.

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Bảo Quốc và

TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu cùng với đó là KS Nguyễn Thị Phụng Kiều đã tận tìnhhướng dẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệm quýbáu trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Bên cạnh đó tôi không quên gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Mai Nghiệp, cácanh chị và các bạn tại phòng thí nghiệm Bệnh học và Chuẩn đoán thuộc bộ môn Côngnghệ Sinh học, Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn hỗ trợ và

giúp đỡ tôi hoàn hoan thành khoá luận.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thé lớp DH19BV đã cùng tôi đồng hành,

gắn bó trong suốt 4 năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh

Tran trọng cảm ơn !

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 11 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Trần Hải Đăng

TÓM TAT

Đề tài “Đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết sinh học đối với tác nhângây bệnh nứt thân xì mủ (Phytophthora sp.) trên cây sầu riêng (Durio zibethinus)trong điều kiện phòng thí nghiệm” được thực hiện từ tháng 05 năm 2023 đến tháng

11 năm 2023 tại phòng thí nghiệm Bệnh học va Chân đoán, Khoa Khoa học Sinh học,trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, với mục tiêu: Tìm ra nồng độ ứcchế tối thiểu của dịch chiết gừng, lá trầu không va hỗn hợp dịch chiết gừng — lá trầu

không đên sự phát triên của tác nhân gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sâu riêng.

Nội dung 1: Kết quả phân lập từ 30 mẫu bệnh bao gồm mẫu thân, mẫu đất vàmẫu nước thu tại vườn sầu riêng thuộc xã Hội Xuân và xã Tam Bình, huyện Cai Lậy,tinh Tiền Giang cho kết qua thu được 19 mau Phytophthora sp gây bệnh nứt thân xì mủtrên cây sầu riêng với tần suất xuất hiện của mẫu thân là 66,67%, mẫu đất là 75% vàcuối cùng mẫu nước không xuất hiện Phytophthora sp với tần suất là 0% Định danhđược các mẫu nắm qua đặc điểm hình thái bảo tử và bằng kĩ thuật sinh học phân tử chothấy tác nhân gây bệnh nứt thân xì mủ là Phytophthora palmivora

Nội dung 2: Đánh giá hiệu lực ức chế của 3 loại dịch chiết đối với tác nhân gâybệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng trong điều kiện phòng thí nghiệm trên môi trườngPDA đã cho thấy tại các mức nồng độ dịch chiết càng cao thì khả năng phát triển củanam càng thấp so với nghiệm thức đối chứng sau 7 ngày theo dõi đối với Phytophthora

palmivora Dịch chiết gừng cho hiệu lực ức chế Phytophthora palmivora đạt 100% từ

mức nồng độ 2,5% Trong khi đó, địch chiết lá trầu không cho hiệu lực ức chế hoàn toànđạt 100% tại mức nồng độ 1,0% Ngược lại, khi phối trộn hỗn hợp dịch chiết gừng — látrầu không theo tỉ lệ 2:1 ở mức nồng độ 1,5% đạt hiệu lực ức chế là 100%

Từ các kết qua thí nghiệm của ba loại dịch chiết đối với Phytophthora palmivora

gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sâu riêng có khả năng ức chê nam bệnh có hiệu qua.

Mie lta sscwsscwesssaneecsastesusesusemsseesnmieae pense veneeecebaree ERNE E EERO 1V

Danh sách chữ viết tắt -22- 2-52 22222122112212211211221121121121121121121111211211 2 yee Vil

Danh sach cac Wink 0 Vili

DB SAC INCAS BHITPlssssansnatittiirioookotiiGGNGHISSSIRISG18.G0108018Gi080404338368318HE0GIG6856801310000001013g10033HB80i8G00i088g8Ẻ x

Đặt vấn đỀ s52 221 221211211211212112121212121121122121211121111221112221 121 re |Mục tiêu đề tài 5-52 22s 2221212212112121121121112112111112111112101212111112112211 211cc 5

| nga na n6 se tecchitegzgn060000006gi8856gS00055-4088053ã08B31nuggsmỶ 5Giới hạn đề tài 52-5252 2E22E2312512112112112112112112112112112112112112112122eeeees2Chương 1 TONG UUHAN TÀI LIỆU se seeeedieiisooeniseieilllg9304000060300000300000 4

1.1 Tổng quan về cây sầu riêng: 2-2522 S22E22E22E22E2212122112121 212121212121 xe 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây sầu riêng - 2: 22©22+2E+2EZ2EE2EE22E12212222221222222ee 4

Oe PRAT WB scat ccd sical nr sonnet nb IP oe Vantin stamens 4

1.1.3 Tình hình trồng sầu riêng ở Việt Name ccccccccccecseccesseeseecsesseessessesseesseeseessees 511.4 Age điểm thew vũi bt ccocmmuecosmenemimeaeen 71.1.4.1 Đặc điểm thực vật cây sầu riGn ge ceccccccccsessecsessessessessessessessessesstssesseesesseess 71.1.4.2 Diéu kién sinh trurOng n3 91.1.5 Bệnh hại thường gặp ở sầu ring cece cece eseeessesseessesseesessesenessesseesteeseesteeeees 91.1.5.1 Bénh ái 7 ÔỎ 9

LD Bệnh thần: tHMssezsszszeeeeseebedsosoEsgrboniSEexootitgebÐiiptb:gfpÃSIGfiGGSSSREGGLEBDR¿S2AgSgg> 10

1.1.5.3 Bệnh nắm hồng 22 2 SS9SE2E2E9EE2E125221211212111112111112121112112111211 2112 xe 111.1.6 Bệnh nứt thân xì mủ trên sầu ri6ng oo eee ccc ecc ees ecsecsessessessessessessessessesseseeeseeees 11

1.1.6.1 Tổng quan về bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng -2- 2-2: 1]

1.1.6.1 Bién phap phong trey 13 1.1.6.1 1 Biển pháp cạnh 1402 sense ecseescunuceaerussame mena au em eem ES 13

II 06250109 )50)0 2 14 1.1.6.1.3 Bién phap hoa hoe? oe 14

1.2 Tổng quan về Phytophthora palmivora ccccccccsscsscssessessesvesvessessessessecsessessessessessees 151.2.1 Sơ lược về PJy/ojplfƯOFd 2-©22+©7222+2SE+22E+2223222322212231222122112211 221121212 Xe 151.2.2 Các đặc trưng về hình thái của Phytophthora paÏiwiVOFd -2-©52©52552 161.2.3 Quy luật phát triển của bệnh - 2-22 ©2222S222E2EE22E22212212221221211221 21.222 19eRe is || -eeeenn c.En 0 E 2 0 cdygogic Yemrie 191.2.3.2 Quá trình lây lan của nắm ¿- 2 2222222E22E22EE22E22EE221221221212221 21.22 cze 191.3 Một số nghiên cứu VỀ sử dụng dịch gi im | 201.3.1 Dịch chiết Suns (Zimeiber OfMCinale) sscwcssasessevswsmansesssaavessseawesusssmensssanievceameuenesxee 201.3.2 La trầu khơng (Piper Dethe L.) ceccecceccescessessessessessessessessessessessessessessessessessesseeseaes 21

Chương 2 PHƯƠNG PHAP VA VAT LIEU NGHIÊN CỨU - 22

Dl NộI dung HEH 16H) CU ass cascensansansisnesonsncaseevereasunen vesasenasnouessacnaentsenereneusmemeansvonsvaenrenasn 22

2.2, Thos giam vã địu điểm nghÏÊn SỨ sccsenncccsnanercransesasssanorsinwrneveioueternmveerssnetiereeneriie 22

2.2.1 Thời gián nghiÊn CỨ:sssscecsczseseeoisiox650165666661061465815666615613434000450669366300301730001408.056088 22

2.2.2 Địa điểm nghiên Cr eeccceccecscscsessessesessesesessessseessesssessesussessesessessesneaeeseeeees 32

2.3 ‘Vat leu thí.TTghẲÄ1©H, << e2 snnenrnasionssnciacnsaneenersexchonasneassanatsennsnensinnsnensne 22

ee HN sasegsathgnhunGtxiogtHigtottioitotipiBGGSnSU4EtloSGSiAinSiiSNGS4301001004000008i6340010003E0 NHA 227.8.7.Tựng eu võ Cine bĩ:miẫy TH sesesesskbnuioinhigbicocsG)0idciliSu1gigE2lLG34300900G08X01L058340g0-0/81060669848 272.3.3 Mơi trường và hĩa chất sử dụng -22©22¿22222E22E+2EE2EE2EE22E2EE2EEEErrrees 232.4 Phuong phap thi nghiém 24

2.4.1 Nội dung 1: Phân lập và định danh Phytophthora sp gay bệnh nút than xi mủ trên

cây sau riêng bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử -¿-525525522 242.4.2 Định danh nam gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm hình

2.4.3 Dinh danh nam gây bệnh nứt than xi mủ trên cây sầu riêng bằng ki thuật sinh hoc

PAT TẾ con sne ngĩ con gu 0 Gt100G010130156188EãSẸSGE464g630.21083E:3038045: 118636830236 15A383RLS10830S01801533818.31838.1ã38578 29

2:43 PHAN Ue POR sao s11 g011 110 ho 1á 5ò 18k 5014 603550364385945463655X53656158855L8814044100455430805/808 29 2.4.3.3 Phân tích phat sinh ÏOảI - - c6 2222213211231 1511 2315511211191 21 11111 11 11 E1 re 312.5 Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế Phytopthora palmivora của dịch chiết gừng

với lá dịch chiết lá trầu không trong điều kiện phòng thí nghiệm -. 3 Í5.5.1 Phương pháp bố trĩ thí nghiệm cu S20 xen 4.0.8 7 0x 312:3:0.HƯỚN pla p TE NIC CU sseccssnssvansancoseeansuesansseanueesmeaacemmmenmaceenarcmmemmenmnmnas 33

0/5550 Chi TSU Teo) COE sxx cisaasie sire cố cố ố cổ CC2.6 Phuong phap xtr ly 911 35

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -222222222222222222221222221 2212 363.1 Phân lập nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng 2-2-2 363.1.1 Quá trình thu thập mẫu bệnh - 2 2-2 2S£S+E+E£EE2E£EEE2E£EE2E2EEZE2E2zzEzzzzxe 36

3; L2 Qua trình pHẩn/TấPissssssessoorbsaovarobttsttittpsbftogiGBOISIEEGTSSGSSGMGEBSSESBESI4SSipUiU9gBg0 36

3.2 Định danh nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng tại tỉnh Tiền Giang 37

3.2.1 Định danh nắm bệnh nứt thân xì mủ dựa vào đặc điểm hình thái 37

3.2.3 Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch 2 22©2252225z22z+2zz22zz+2 4I3.2.3 Định danh nắm bệnh nứt thân xì mủ dựa vào kĩ thuật sinh học PHAN TẾ taeasansaa 423.3 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết sinh học đối với Phytophthorapalmivora gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng 2-©2222252222zz>+2 473.3.1 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của dich chiết gừng đối với Phytophthora

JDIIIHIHUGIHDT: 6s cssesgisEniigisuBubssipsBfgolia3uSgiqniduliscSgaldougsBtuetiulssgBsiiulSzsizbsinuEngSucigsstdgsiagEsukjS0oeugBiiosi/sscSEuausi 47

3.3.2 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết lá trầu không đối với Phytophthora

CLINE ONO essere tr cso aN mn eae et US EU Ot 50

3.3.3 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của hỗn hợp dịch chiết gừng và lá trau không đối

MJfZ2//2727/7///27/202-//7ả.0A.Be 54

KET LUẬN VÀ DE NGHỊ - 2-©2222222222212212312212211221271 2112212122 1 cEcre 57

PHU LUC Ẻ2Ngả 62

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

BVTV : Bảo vệ thực vật

Cs : Cộng sự

ĐBSCL : Đồng bằng Sông Cửu Long

TL : Lần lặp lại

NSC : Ngày sau cấy

PDA : Potato Dextro Agar

PCA : Potato Carrot Agar

PCI : Phenol Chloroform Isoamyl

PCR : Polymerase Chain Reaction

WA : Water Agar

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1: Hid aig TÚI Bão ĐỀ sce seesicasnnsneinenss namnssiennnaoantonnninennmsaies snsnesadeansuansnamssciseaentte 17

Hình 1.2: Đặc điểm túi bào tt eeecceeecseeeeecesseeecsseeeeeesneeeeesseeeeesneeeessneseesseseesseeeeeseed 17

Hinh 1.3: Hinh thai ti bao ture 18

Hình 2.1 Phân lập mẫu dat bằng phương phap bay hoa hing . - 26

Hình 2.2 Tiến hành lây bệnh nhân tạo 2-2 2 2S+2E+2E+EE+EE+EE+ZE+EE2ZEZE22E22222ze2 28 Hình 3.1 Triệu chứng bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng - 2 - 36 Hình 3.2 Mẫu bệnh thu thập được -2- 252522222E+£+zE+zxzztztezxerzsrzxersee-xe 3f7 Hình 3.3 Kết qua phân lập được từ mẫu bệnh 2- 22 +5e+2s+zxezzserseeseercc- 37 Hình 3.4 Nam Phytophthora sp phát triển chạm thành đĩa 7 NSC 38

Hình 3.5 Hình thái sợi nam và các dang bao tử của Phytophthora sp quan sát dưới kính hiển Olympus (CX23) vi độ phóng đại 40X -2 22-©2222222222222222Ezzzzcsrrrr 40 Hình 3.6 Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây sau riêng thời điểm ngày thứ 10 41

Hinh 3.7 Tan Phytophthora palmivora sau 5 ngày phan lập -.- - 42

Hình 3.8 Các hình thái túi bao tử Phytophthora palmivora ở độ phóng dai 100X 42

Hình 3.9 Kết quả điện di DNA bằng cặp môi ITS đối với mau Phytophthora sp 43

Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa trên mỗi ITS của các mẫu nấm HXTO1 phân lập với một số mẫu trên ngân hàng Gien - 2 2 2¿+22+2E+SE£2EE2EE22EE2EE22E222122122222222222222e2 44 Hình 3.11 Kết quả giải trình tự gene mẫu HXT01 được so sánh với các chủng trên cơ sở dit Genbank bằng công cụ BLAST -2-©22222222222222222E22E22E22E2EESEEcrrrrrres 44 Hình 3.12 Cây phát sinh loài dựa trên môi ITS của các mẫu nam TBT03 phân lập với một số mẫu trên ngân hàng Gen -22- 2 22222EE2E£2EE2EE22EE22322212212222221212222 2e 45 Hình 3.13 Kết quả giải trình tự gene mẫu HXTO1 được so sánh với các chủng trên cơ sở dit Genbank bằng công cụ BLAST 2-©22222222222122E2221221222122122122212212 222 45 Hình 3.14 Kết quả điện di DNA bang cặp mỗi GUP đối với mau Phytophthora sp 46 Hình 3.15 Ảnh hưởng của dịch chiết gừng đến sự phát triển đường kính tản Phytophthora palmivora ở thời điểm 7 ngày sau cấy .- -: 2 5-5525555- 48

Hình 3.16 Ảnh hưởng của dịch chiết gừng đến sợi Phytophthora palmivora khi xử lý ở

mức nông độ 2,0% tại thời điểm 7 ngày sau cấy, - 22 ©2++2c++2z++zxzzrxrsrrrer 49Hình 3.17 Ảnh hưởng của dịch chiết lá trầu không đến sự phát triển đường kính tảnPhytophthora palmivora ở thời điểm 7 ngày sau cấy . -2-22-55-555 52Hình 3.18 Ảnh hưởng của dịch chiết lá trau không đến sợi Phytophthora palmivora khi

xử lý ở nồng độ 0,8% tại thời điểm 7 ngày sau cấy -¿ 2¿+22++csczzxecrsc 53

Hình 3.19 Ảnh hưởng của hỗn hợp dịch chiết gừng và lá trầu không theo tỉ lệ 2:1 đến

sự phát triển đường kính tản Phytophthora palmivora ở thời điểm 7 ngày sau cay 55Hình 3.20 Ảnh hưởng của hỗn hợp dịch chiết gừng và lá trầu không đến sợi

Phytophthora palmivora khi xử lý ở nồng độ 1,2% tại thời điểm 7 ngày sau cấy 56

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của sau riêng trong 100 gam phan ăn được 6Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu mẫu bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng ở tỉnhca 25

Bảng 2.2 Danh sách thơng tin các primer sử dụng trong phan ứng PCR 30 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phan ứng PCR với primer TS1/ ITS4 30 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer GUP 5-5 - 31

Bang 2.5 Thí nghiệm: Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng đến sự phát triển đường

kính tan nam Phytophthora palnmivor - 5 + + * + E+eE++EEkeEexeeeeeereerrerrkererrke 32

Bảng 2.6 Thí nghiệm: Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết lá trầu khơng đến sự phát

triên đường kính tan nam Phytophthora pDẠIH1ÏVOFđ 5-55 +52 <+<£+s£+sE+se+eeeereeres 32

Bảng 2.7 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của hỗn hợp dịch chiết gừng và dịch chiết

lá trâu khơng đến sự phát triên đường kính tan nam Phytophthora paÌlmivora 33Bảng 3.1: Số mẫu nam Phytophthora sp phân lập được từ 2 vườn sau riêng 39Bảng 3.2 Kết quả tra cúu độ tương đồng trên Genbank bằng trình tự Nucleotit của cácmẫu nắm Phytophthora với mơi TTS 2- 2+ ©22522SE2EE£EE2EE2EE2EE2E2121212122 2e 46Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết gừng đến đường kính Phytophthora

GOIN OG secre secession Ro UA Sl stein rare 48

Bang 3.4 Hiệu lực ức chế (%) Phytophthora palmivora của dịch chiết sừng ở các nồng

GG NAG ANA sa csenascisttESS LiESDCM5S35X801iIGSESIS.A8i95ĐTiGGĐĐSEĐREBHIXEEGHESGEESX-ESEEKHCSEEHEEENHES.IERUDIS3/36/8000g8E 49

Bang 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết lá trầu khơng đến đường kính Phytophthora

DATO ccccercsswrees sera sa eat is tooo Ses SW SLSR TG UH SS SP ON RIE 51

Bang 3.6 Hiệu lực ức chế (%) Phytophthora palmivora của dịch chiết lá trầu khơng ởcác nồng độ khác nhau 2-2 ©22222++SE++2E++EEE2EEE2EEE22E122212721222127112732222 2 xe 32Bang 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp dịch chiết gimg/la trầu khơng đến đường

KINH OP HHHDRG PAINVOTATIOOL sxessuscerssmanessnenessveneenesmnssnsansousmnnnsusemvavsersensneueresmsenasees 55

Bang 3.8 Hiệu lực ức chế (%) Phytophthora palmivora của hỗn hợp dịch chiết gùng/látrầu khơng ở các nồng độ khác nhau - 2-2-2 ©++22++2E++EE+2EE+2EE+2EE++EEzzrxrzrrrer 56

GIỚI THIỆUĐặt vấn đề

Sau riêng (Durio zibethinus) là cây ăn trái đặc sản của vùng Đông Nam A, có giá

trị kinh tế rất cao, có vị thơm ngon đặc trưng và giá trị dinh dưỡng cao Sầu riêng khôngnhững được ưa chuộng ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế gidi VÌ thế sầu riêngđược mệnh danh là “trái cây vua” Nhiều năm trở lại đây sầu riêng ở nước ta có quanhnăm do nhiều người dân áp dụng được kĩ thuật đề xử lý cho sầu riêng ra trái nghịch mùa

Đa số các loại sầu riêng đều cần một phương pháp canh tác chuẩn Tuy nhiên dé cạnhtranh với các nước láng giéng, ngoài giá thành ra cần phải quan tâm đến những yếu tốkhác vô cùng quan trọng như năng suất, chất lượng, mẫu mã, phẩm chất các yêu tố này

có như mong đợi hay không phụ thuộc rất nhiều vào quá trình quản lý sâu bệnh hại trên

cây sâu riêng.

Trong khi đó, dịch bệnh do nam Phytophthora sp đang là mỗi nguy hại nặng choloại cây ăn trái này, nắm gây hại trên tat cả các bộ phận của cây Phytophthora sp lưu

tồn trong đất, rất đa dạng về hình thái, đặc điểm sinh học và có khả năng sống trong môi

trường bất lợi nên việc phòng trị khó khăn Nắm gây hại ở hầu hết các bộ phận của câytrồng như rễ, thân, lá trái và cây con trong vườn ươm, gây ton that lớn về năng suất vàkinh tế của các nước trồng sầu riêng (Erwin; Ribeiro, 1996) Ở Malaysia bệnh này làm

chết cây con trong vườn ươm trên 50% (Lee và Lim, 1990) Năm 1994 ở Thái Lan bệnh

thối gốc chảy nhựa làm chết khoảng 20% điện tích cây trưởng thành, nắm được tìm thấy

ở tất cả các vùng trồng sầu riêng thuộc phía nam và miền trung Tại Việt Nam, bệnh đã

ảnh hưởng đến sầu riêng ở vùng đồng bằng và đặc biệt nghiêm trọng là tỉnh Quảng Nam

Phytophthora sp đã gây hại 2.138 cây trong tổng số 3.075 cây sầu riêng ở xã Quế Trung

và gây thiệt hại kinh tế tới 15 tỷ đồng Ở Đồng bằng Sông Cửu Long bệnh được tìm thấyphô biến nhất là ở Cái Bè - Tiền Giang với tỷ lệ cây nhiễm là 24,6% và miền Đông Nam

Bộ bệnh thối trái đã xảy ra trong vùng Long Khánh, Long Thanh, Cam Mỹ — Đồng Nai,

Bà Rịa — Vũng Tàu, làm giảm năng suất 10 - 25% và cũng là nguồn lây lan nguy hiểm

trong các vùng trông sâu riêng.

Biện pháp phố biến đề kiểm soát Phytophthora sp hiện nay là sử dung thuốc hoáhọc (BVTV) Tuy nhiên, biện pháp này gây hại cho môi trường và ảnh hưởng đến sức

khoẻ con người Các chất có nguồn gốc từ thực vật thân thiện với môi trường đã cho

thay tiềm năng lớn dé thay thế thuốc diệt nắm tổng hợp (Janisiewicz và Korsten, 2002).Trong những năm gần đây, hoạt động kháng nắm, kháng khuẩn một số thực vật có hoạttính sinh học, có kha năng phân huỷ sinh học và an toàn cho sức khoẻ con người đã thuhút sự chú ý của các nhà nghiên cứu khoa học trong việc kiểm soát nắm bệnh thực vật(Kumar và cs., 2008) Dịch chiết gừng và tỏi ở nồng độ 2% cho hiệu qua ức chế in vitro

sự phát triển khuẩn ty nam Curvularia sp gây bệnh vết nâu trên lúa (Lê Thanh Toàn va

es, 2021) Nghiên cứu về khả năng phòng trừ bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata)

hại lạc bằng dịch chiết lá trầu không (Piper betle L.) cho hiệu quả ức chế sự phát triển

của bệnh trên đồng ruộng, góp phan nâng cao năng suất, phẩm chat lạc (Ngô Thị Mai

Vi va cs, 2015).

Chính vi vậy, đề tài “Phân lập Phytophthora sp và nghiên cứu kha năng ức chếcủa dịch chiết sinh học đối với nam gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng trongđiều kiện phòng thí nghiệm” được thực hiện

Mục tiêu đề tài

Tìm được nồng độ tối thiểu có khả năng ức chế sự phát triển đối với tác nhân gâybệnh nứt thân xì mủ trên cây sau riêng trong điều kiện phòng thí nghiệm của chiết gừng,

lá trầu không và hỗn hợp dịch chiết gừng — lá trầu không

Yêu cầu đề tài

Phân lập gây tác nhân nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng

Định danh nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm hình thái

và bằng kĩ thuật sinh học phân tử

Đánh giá được khả năng ức chế của dich chiết sinh học đến sự phát triển của tản nam

trong điều kiện phòng thí nghiệm

Giới hạn đề tài

Thí nghiệm chi được tiến hành với 2 loại dịch chiết thực vật là dich chiết gừng

và lá trầu không Nguồn mẫu bệnh được thu tại 2 xã Hội Xuân và xã Tam Bình là 2 xã

có diện tích trồng sầu riêng đứng đầu tại tỉnh Tiền Giang

Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2023 đến tháng 11/2023 trong phạm vi phòngthí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnh học và Chân đoán), Khoa Khoa học Sinh học, trườngĐại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Chương 1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tong quan về cây sau riêng:

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây sầu riêng

Sau riêng có tên khoa học là Durio zibethins, là một loại cây có nguồn gốc từvùng nhiệt đới âm ướt của bán đảo Malaysia, Sumatra và Borneo Chi Durio có nhiềuloài nhưng có một loài quan trọng nhất, kinh tế nhất được trồng rộng rãi ở khu vực ĐôngNam A và các nước khác là Durio zibethinus Một số loài khác cũng cho quả ăn đượcnhưng cùi mỏng, phẩm chất kém được trồng ít hơn như Durio oxleyanus, D Lowianus,

D graveolus, D carinatus, D dulcis và Durio testudinarius (Trần Thế Tục và cs 2004)

Là loại cây có xuất xứ từ vùng nhiệt đới Đông Nam, sầu riêng còn được trồngnhiều ở Indonesia, Philippin, Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia Ngoài

ra còn trồng ở các nước nhiệt đới Trung Nam Mỹ, một số nước Châu Phi và Châu Đại Dương

Cây sâu riêng đã được trông ở nước ta từ khoảng hơn 100 năm trước, giông sâu

riêng có nguồn gốc từ Indonesia được cha có Germet đưa về trồng Cây sầu riêng đượctrông đâu tiên ở Tân Quy — Biên Hoà sau đó được nhân giông rộng rãi ra vùng Đông

Nam Bộ, Đồng bằng Sông Cửu Long và Tây Nguyên (Lê Thanh Phong và cs 2004)

1.1.2 Phân loại

Tên khoa học là Durio zibethinus, thuộc họ Bombacaceae Họ này bao gồm câybao tap ở vùng châu Phi (Adansonia digitata), cây hat dé (Pachira aquataca), câybombax (Bombax ellipticum), cây vải sồi to (Chorisia speciosa) và cây gỗ nhẹ

(Ochroma pyramidale).

Giong sau riéng

Sâu riêng có nhiêu giông, căn cứ trên mau vỏ, gai, cuông, trái Người ta có thé chia lam 2 loại sâu riêng là vỏ vàng và vỏ xanh, loại trai ngon có màu xanh hay vàng sam, gai nhọn ngăn, thưa, múi to và déu, cơm dày, không cứng va không nhão thom,

bình 1,6 — 1,8 kg Cơm màu vàng nhạt, mềm, ngọt béo, thơm Tỷ lệ hạt lép 60%, tỷ lệ

cơm 29,6% Trong khi đó sầu riêng Monthong nhập nội từ Thái Lan vỏ trái có màu sắckhác nhau từ xanh đậm đến xanh pha vàng, cơm vàng, min, ráo, tỷ lệ hạt lép rất cao

(74,1%), Tỷ lệ com đạt 35,4% Trọng lượng trái trung bình 4 — 5 kg (Viện nghiên cứu

CAQ Mién Nam, 2005)

1.1.3 Tinh hình trồng sau riêng ở Việt Nam

Ở Việt Nam ngay sau khi sản xuất lương thực én định, tiêu thu quả tăng lên vàsầu riêng là trong trong những loại quả dé tiêu thụ nhất, do đó phong trào mở rộng diệntích cây ăn quả hiện nay là sầu riêng là một trong những cây được chú ý đến nhiều nhất.Mặc dù giá sầu riêng cao gap 5 — 10 lần những loại quả thông thường như chuối, 6inhưng sau riêng van là một trong những mặc hàng tiêu thụ rat dé dàng Trong quả sầuriêng chỉ có 12% — 22% ăn được trong khi những loại quả thông thường có đến 60 —

80% phần ăn được cho thấy sầu riêng được đánh giá rat cao

Theo báo cáo của Cục Trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), diệntích sầu riêng tăng rất nhanh trong 5 năm trở lại đây Cụ thê, tính đến cuối năm 2022,diện tích trồng sầu riêng của cả nước phát triển được hơn 110 000 ha tăng gần gấp 3 lần

so với năm 2017 (37 000 ha) Trung bình mỗi năm diện tích sầu riêng tăng 24,5% tronggiai đoạn này Trong số đó, có hơn 54 000 ha sầu riêng đang cho thu hoạch với năngsuất bình quân khoảng 16,5 tan/ha, san lượng gần 850.000 tan Cây sầu riêng chủ yếu

tập trung ở Tây Nguyên chiếm hơn 47%, Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếmgần 30% và khu vực Đông Nam Bộ chiếm gần 19%

Giá trị dinh dưỡng cây sầu riêng

Trọng lượng qua từ 1,5 — 4 kg, đặc biệt có quả lên đến 8 kg Trong mỗi quathường có 5 ô, mỗi ô có 1 — 6 múi, múi chiếm 20 — 30 % khối lượng quả Hạt quả chiếm

5 — 10 %, vỏ quả 55 — 56 % (Trần Thế Tục — Nguyễn Ngọc Kính, 2003)

Hạt sau riêng chứa nhiều tinh bột, dầu, protein có thể ăn được khi luộc hoặc rang

chín nhưng có tính độc, ăn nhiều có thể gây nghẹt thở Vỏ trái có thể sắc với nước để trịmột số bệnh ngoài da hoặc trị chí, rệp Lá dùng để tắm trị vàng da, phồng da Rễ lá sắctrị sốt Tro và vỏ trai dung như chất nhuộm trang tơ lụa, gỗ dùng dé xây cất đóng thùng

vì chắc và đẹp (Lê Thanh Phong và cs, 1994)

Theo Tôn Thất Trình (1995), những người sành sỏi về sầu riêng thì không có loạitrái cây nào có vị ngon hơn sầu riêng Là loại trái cây rất giàu dinh dưỡng Phân tíchtrong 100 gram sầu riêng chứa rất nhiều năng lượng, chất béo, protein, vitamin và cáckhoáng chất

Theo Trần Thế Tục và cs (2004), phân tích hàm lượng dinh dưỡng trong 100 gammúi sầu riêng cho kết quả trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của sầu riêng trong 100 gam phần ăn được

Chất Hàm lượng Chất Hàm lượng

Lượng nước (g) 76.9 Chất sắc (mg) b

Năng lượng (kcal) 129 Vitamin B1 (mg) 0.08

Chat béo (g) 4.3 Vitamin B2 (mg) 0.11

Carbohdrates (g) 19.3 Vitamin C (mg) 62

Xo (g) 1.2 Vitamin A (IU) 69

Canxi (mg) 49 Vitamin PP (mg) 1

Lân (mg) 27 Protein (g) 3.4

1.1.4 Đặc điểm thực vật học

1.1.4.1 Đặc điểm thực vật cây sầu riêng

Sau riêng có bộ nhiễm sắc thể 2n = 56 Cùng họ với sâu riêng có cây gạo hoa đỏ

(Gossampinus malabarica DC Merr.) mọc nhiều nơi trên cả nước ta và cây bông gòn(Ceiba pentandra L Gaertn) có hoa mau trắng vàng trồng nhiều ở khu vực Nam bộ vaĐồng bằng sông Cửu Long (Vũ Công Hậu, 1999)

Thân cây sầu riêng

Sau riêng trồng bằng hạt có thé cao từ 20 — 40 m, cây ghép chỉ cao từ 8 — 12 m.Thân thẳng, cành thường nằm ngang, phân cành thấp Khi cây còn nhỏ sầu riêng có tán

hình chóp trông gần giống như cây thông Đường kính tán cây tăng dần theo độ tuôi: độ

tuổi 10 từ 6.63 — 8.44 m, tuổi 15 từ 7.67 — 11.14 m, tuổi trên 30 từ 8.75 — 12.67 m Tan

lá dày với những cành, nhánh to nhưng lại giòn, đễ gãy nhất khi trĩu trái và gặp gió to

Đường kính thân 20 — 120 cm, vỏ có màu nâu đỏ nhạt (Vũ Công Hau, 1999).

Rễ sầu riêng

Bộ rễ sầu riêng có bộ rễ phát trién mạnh, tập trung hút dinh dưỡng ở lớp đất mặt(0 — 50 cm) Ré cái ở chính giữa góc có thé đâm sâu 5 — 6 m, sự phân bố của bộ rễ có

thé phụ thuộc vào tinh chất đất, mực nước ngầm nơi trồng, hình thức nhân giống (gieo

hạt, chiếc cảnh, ghép cành) và kỹ thuật chăm sóc cây Rễ cái làm nhiệm vụ giữ thân,xung quanh có vô số rễ nhánh và rễ phụ làm nhiệm vụ hút dinh dưỡng và giúp giữ thân

đứng vững (Vũ Công Hậu, 1999).

Lá sầu riêng

Lá sầu riêng thuộc loại lá đơn, mọc cách, hình trứng, góc tròn hay tu, chiều dai

từ 12 — 20 cm, rộng 4 — 6 em, màu xanh sáng ở mặt trên, mặt dưới có lông mịn màu nâu.

Cuống lá dài từ 1,5 — 3,0 cm, đường kính từ 0,15 — 0,25 cm (Vũ Công Hậu,1999)

Hoa sầu riêng

Cây sau riêng được trồng bằng hạt, 7 — 8 năm sau cho ra hoa, cây ghép tầm 3 — 4năm sau trồng cho ra hoa Sâu riêng thuộc loại hoa lưỡng tính (có bộ phận đực và cáitrên cùng một hoa) Hoa mọc thành từng chùm, số lượng nhiều (3 — 30 hoa) trên những

cành lớn ít khi ở đầu cành, thòng xuống, cánh hoa to, dạng ống hơi to từ dưới lên, có đốtdai 2 — 4 cm Trên một cây có đến 20 000 đến 40 000 hoa Thời gian tré hoa trên cùng

mọt cây kéo dai từ 1 — 2 tháng mới chấm dứt

Đài hoa có 5 cánh và đài phụ phía ngoài có 3 cánh Cánh hoa màu kem hơi xanh

dài hơn đài (2 — 3 lần) Nhị đực dai hơn cánh, gồm 5 bó đính nhau một ít ở gốc, phần

trên tự do hình thành 5 chùm nhị, mỗi chùm có 10 — 12 bao phấn Bao hình trái xoan,

vòi đài, dau nhị tròn có 5 mảnh, có nhựa ở đỉnh.

Từ khi hoa bắt đầu nở đến khi thành hoa hoàn toàn mat 2 — 3 ngày Hoa nở vàokhoảng 5 giờ chiều đến 6 giờ sáng hôm sau Bao phan bắt đầu tung phan vào lúc 7 giờ

đến 11 giờ đêm là khoảng thời gian thu phấn cho nhuy nhưng lúc này nhuy đã tàn và

không cong khả năng nhận hạt phan do vậy sầu riêng không thé tự thụ phan được hoặc

có thì cũng rất thấp, muốn có kết quả tốt thì cần phải thụ phan chéo cho cây

Các nghiên cứu cho thay có khoảng 42 — 43% hoa thụ phan chéo có khả năng trởthành trai chín Số còn lại thường rụng dan đi Trái rụng nhiều vào tuần lễ đầu sau khi

thụ phan, sau đó tiếp tục rụng đến tuần thứ 9 nhưng với tỉ lệ thấp.

Trái

Do hoa mọc chìa xuông dat nên trái sâu riêng cũng chìa xuông dat Hoa tuy nhiêu

nhưng mỗi chùm hoa chỉ đậu vài trái Trước đó trái non đã rơi rụng từ lúc mới được vải

tuân tuôi, một phan là do chủ vườn tỉa bỏ trái chậm lớn, èo uột, trái bi sâu bệnh đê don

sức nuôi những trái lớn hơn đề chúng phát triển nhanh

Tuy theo từng giống mà trái có kích thước, hình dang: tròn, bau dục, dai, mausắc vỏ trái từ màu xanh đến mau nâu vàng, hình dạng và kích thước gai cũng thay đốituỳ theo từng loại giống: to, cứng, nhọn, ngắn hay dai

Mỗi trái thường có 5 ngăn tách doc theo trái, mỗi ngăn chứa 1 — 5 múi bên trong

Bên trong mỗi múi có một hạt duy nhất, hạt to hay lép tuỳ theo từng loại giống, hạt sầuriêng có màu vàng cam, vỏ mềm, bên trong chứa nhiều tinh bột, dau, protein Bộc bênngoài hạt là cơm có màu vàng hay trắng sữa, vàng cam, có vị ngọt béo và có mùi thơm

(Vũ Công Hau, 1999).

1.1.4.2 Điều kiện sinh trưởng:

Nhiệt độ, 4m độ

Sau riêng là cây vùng ăn trái nhiệt đới yêu cầu nhiệt độ và ẩm độ cao Dé chúngsinh trưởng và phát triển tốt cần nhiệt độ 24°C — 30°C, sầu riêng ra hoa ở nhiệt độ từ20°C — 22°C , 4m độ không khí 75 — 80% Tuy ưa khí hậu nóng âm nhưng sau riêngkhông ưa nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp dưới 22°C hoặc vượt quá 40°C, yêu cầu độ âmcao và 6n định, lượng bức xạ trong vùng không quá lớn do đó miền Bắc không trồng

được sầu riêng (Vũ Công Hậu, 1999)

Lượng mưa

Lượng mưa thích hợp cho sầu riêng là từ 2000 mm đến 3000 mm và phân bố

quanh năm (Vũ Công Hậu, 1999).

Không để khô hạn quá 3 tháng vì sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng, đặc biệt trong

thời gian ra hoa cần phải tưới nước, nhưng ngược lại trong thời gian cây đang mang trái

và chín không nên có mưa (Vũ Công Hậu, 1999).

Dat dai

Dat trồng sầu riêng phải là đất tốt, sâu và thoát nước tốt Đất có hàm lượng muối

không cao hơn 0,02%, pH đất từ 4,5 — 6,5 Dat tốt thì cây mới mọc nhanh và mang nhiềuqua Dat thịt, đất thịt pha sét, đất phù sa, đất đỏ bazan, đất xám của các tỉnh miền ĐôngNam Bộ là những loại đất phù hợp đề trồng sầu riêng (Vũ Công Hậu, 1999)

1.1.5 Bệnh hại thường gặp ở sầu riêng

1.1.5.1 Bệnh cháy lá sầu riêng

Tác nhân gây hai: Do các nam Botrydiplodia sp., Collectotrichum sp va

Fusarium sp.

Triệu chứng: Đối với những cây trưởng thành, trên lá thường có dấu hiệu phátbệnh sớm nhất Ban đầu là những đồm nâu sũng nước, sau lan rộng dọc theo hai mép lá,làm lá không phát triển, khô va rụng, cành non cũng khô dan và chết Bệnh thường phát

sinh ở những cành nhiều lá, ban đầu chỉ là những vết bệnh nhỏ sau lan rộng ra rất nhanhlàm chết cả lá và rụng đi.

Những cây con khi bị bệnh nặng thường rụng hết lá làm cây trơ trụi, cây không

thé quang hợp làm cho dot cây con va dot cây trưởng thành bị thối đen, cành và nhánh

bị nhỏ lại Các lá bệnh thường kết dính chùm lại với nhau, khi bệnh nặng lá thường rụng,nếu nặng hơn làm chết cả cây trưởng thành

Biện pháp phòng trừ

Ở giai đoạn cây con: Bệnh có thé được tránh bằng cách tưới nước thường xuyênnhưng không tưới quá âm, cây con nên dé khoảng cách thưa, bệnh có thể khống chếbằng cách phun thuốc lên lá hoặc có thê tưới lên đất

Trên các vườn cây trưởng thành nên phun các loại thuốc trên thường xuyên hoặc

tiêm thuốc vào cây Thường xuyên cắt tỉa cành loại bỏ những lá, cành bệnh trong vườn

dé tránh lây lan (Lê Văn Don và cs, 2021)

1.1.5.2 Bệnh thán thư

Tác nhân: Do nam Collectotrichum zibethinum gây ra và Collectotrichum

gloeosporiodes gây ra.

Triệu chứng bệnh: Bệnh phát triển nhiều trên lá, tạo những đóm bệnh riêng biét,tròn và hoại tử hoặc có hình bất dạng, thường ở rìa và chóp lá

Đốm lá có màu nâu xám nhạt với các vòng đồng tâm hoặc các vòng xung quanhvết bệnh với một số bao tử mau den trên đó, xung quanh vết bệnh thường có ranh giới

mau nâu vàng Bệnh thường phát sinh trên lá già, lá bánh tẻ Lá bệnh trên cây con hay

cây bị suy yếu dé bị rụng sớm

Vào giai đoạn cây đang sinh trưởng mạnh, ra lá và đọt non, nếu gặp điều kiện âm

độ cao, hoặc sương mù nhiều thì cần phun phòng ngừa (Nguyễn Thị Nguyệt, 2017)

1.1.5.3 Bệnh nắm hồng

Tác nhân gây bệnh: do nam Corticium salmonicolor gây ra

Triệu chứng bệnh: Bệnh tắn công trên các cành cây rậm rạp cháng 2, cháng 3 củacây Nắm thường tạo một lớp tơ lúc đầu có màu trắng đục, sau đó chuyền sang mauhồng nhạt phát triển xung quanh vỏ cành cây

Tác hại: Nam hút dinh dưỡng làm vỏ cành chổ bị hại khô và rụng lá, làm cànhchết khô

Biện pháp phòng trừ:

Tỉa cành tạo tán cho vườn thông thoáng, tiêu hủy các cành nhiễm bệnh.

Sử dụng các thuốc hóa học theo liều lượng khuyến cáo đề phun ngừa bệnh (TrầnThế Tục va cs, 2004)

1.1.6 Bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng

1.1.6.1 Téng quan về bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng

Sau riêng là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, là nguồn thu nhập lớn đối vớicác nhà vườn sản xuất Tuy nhiên dé đạt năng suất tốt cần có những biện pháp canh tácphù hợp, như nhiều loại cây ăn quả khác sầu riêng dé bị tác nhân gây bệnh tấn công làmảnh hưởng đến năng suất và chất lượng, gây thiệt hại lớn cho nhà vườn, đặc biệt là các

loại bệnh do Phytophthora sp gây ra.

Triệu chứng bệnh: Cây nhiễm bệnh, bộ lá không còn bóng mượt và chuyên sangmàu vảng, sau đó rụng theo từng cành hay một phía của cây Trên thân có dấu hiệu chảynhựa trên bề mặt vỏ cây, vết bệnh ướt và nhựa có màu nâu, nắm thường tan công xungquanh gốc và các cành của cây sầu riêng Vết bệnh phát triển theo thời gian có thể từnăm này sang năm khác, tuỳ theo thời gian nhiễm bệnh mà kích thước vết bệnh khácnhau, chạy dọc theo thân gây thối vỏ và xì mủ thân

Theo Mai Văn Trị (2005), do quy mô điện tích trồng ngày càng phát triển va mức

độ tập trung cao vì thé dich hại tan công ngày càng nghiêm trọng Nam Phytophthora là

một trong những kí sinh gây hại cây trồng, nó được xác định là trở ngại lớn nhất trong

việc phát triển sản xuất sầu riêng bền vững ở Australia Các loài Phytophthora nicotiana,Phytophthora botyrosa và Phytophthora spp đã được xác định gây hại trên cây sauriêng (Erwin va Ribeiro, 1996) Bên cạnh các loài khác, Phytophthora palmivora đượcxem là một dich hai quan trọng trên cây sầu riêng, tan công trên nhiều bộ phận của cây

(Navaratnam 1966; Pongpisutta và Changchote, 1994; Lim, 1990) Tại Việt Nam,

Phytophthora palmivora được xem là kí sinh gây hai quan trọng nhất trên cây sầu riêng(Mai Văn Trị và cs, 1997).

Từ bốn tỉnh trồng sau riêng tại Tiền Giang, Vĩnh Long, Bến Tre và Cần Thơ,nhóm nghiên cứu đã xác định được 29 chủng nam gây bệnh nứt thân xi mủ, cháy lá vàthối trái là các chủng thuộc nam Phytophthora palmivora (Drenth và Sendall, 2001;

Drenth và Guest, 2004).

Nam bệnh trên thân có thé làm chết cây, gây ảnh hưởng đến sản xuất trong nhiều

năm Trung bình người ta ước tinh rằng thiệt hại do dịch bệnh và chi phí kiểm soátPhytophthora palmivora ở sầu riêng là khoảng 20 — 25% sản lượng (Andre Drenth va

cs, 2004).

Phytophthora palmivora gây tôn thất rat lớn về năng suất, ảnh hưởng lớn cho

ngành canh tác sầu riêng của các vùng Đông Nam A (Erwin và Ribeiro,1996) Tại

Malaysia bệnh do Phytophthora palmivora gây chết cây con trong vườn ươm >50%.Các báo cáo của Thái Lan cho biết bệnh làm chết khoảng 20% cây sầu riêng thời kì cho

quả năm 1994 (Lim, 1990).

Ở Đông Nam Bộ theo báo cáo của Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Đồng Nai (2001)diện tích nhiễm bệnh trong tỉnh đến 1758 ha trong tổng diện tích 2014 ha, phố biến nhất

là bệnh nứt thân xì mủ và thối quả (Mai Văn Trị và Nguyễn Thị Thúy Bình, 2003) Bệnhgia tăng nghiêm trọng ở Đồng bằng Sông Cửu Long những năm 1999 — 2000, khoảng

15 — 20% số cây bị bệnh, cá biệt có vườn thiệt hại trên 70% do cây chết và khoảng 15%

quả bị thối (Huỳnh Văn Thành và cs, 2001) Năm 2001, tại các tỉnh miền Trung bệnh

gây thiệt hại nghiêm trọng Khoảng 2138 cây bị chết do bệnh trong tông số 3075 cây

sầu riêng tại xã Quế Trung (Quảng Nam), ước lượng mức thiệt hại khoảng 15 tỷ đồng(Huynh Van Thanh và cs, 2004) Bệnh do Phytophthora gây hại trên cây sầu riêng tại

Việt Nam ước tính khoảng 20 - 25% với giá trị khoảng 74,25 triệu USD (Drenth va Sandal, 2004).

Theo Andre Drenth và cs (2004), nam bệnh Phytophthora palmivora đã được tìmthấy trong tat cả vùng trồng sau riêng ở Nam Bộ và Tây Nguyên Vào năm 2001, bệnhcũng ảnh hưởng đến việc trồng sầu riêng ở vùng đất thấp Ở những nơi khác trong nước,nam Phytophthora palmivora được phát hiện phổ biến ở huyện Cái Bè, tinh Tiền Giang,

với 24,6% cây bị nhiễm bệnh Tỉ lệ mắc bệnh liên quan đến độ tuổi của cây, có cây trên

10 năm tuôi là man cảm nhật.

Các biện pháp kiểm soát nam thông qua các thuốc diệt nam không theo hệ thốngchỉ mang lại các kết quả không đáng ké hoặc không 6n định

Theo Mai Văn Trị và cs (2005), kết quả đánh giá tính chống chịu bệnhPhytophthora ở trong điều kiện phòng thí nghiệm sử dụng phương pháp bioassay chothay tat ca các giống sau riêng đang trồng phố biến đều bị nhiễm bệnh Phytophthora.Theo nghiên cứu của Thành và Bình (2001) cho thấy các giống sầu riêng đang trồng ởđồng bằng sông Cửu Long cũng đều bị nhiễm bệnh với mức độ khác nhau, trong đógiống D101, D2, Tứ Qúy và Lá quéo chống chịu khá tương đương với giống Chanee,trong khi đó các giống như Ri6, Khổ qua xanh, Sữa hạt lép Bến Tre thì chống chịu kém,nhiễm bệnh cao nhất là giống Ri6

Tính chống chịu của các giống đối với bệnh do Phytophthora không tương đồng

nhau khi so sánh các nghiên cứu ở Thái Lan (Sangchote, 2000), ở Australia (Vawdrey

và CS, 2001; O’Gara và cs, 2004) và Việt Nam (Thanh và Bình; Bình và cs, 2003) Theo

Vawdrey và cs (2001), phản ứng nhiễm là khác nhau giữa các giống sầu riêng, giữa các

vùng trồng và còn tùy thuộc vào dòng Phytophthora palmivora

1.1.6.1 Biện pháp phòng trừ

Theo Cục Bảo vệ thực vật (2017), khuyến cáo các biện pháp sau:

1.1.6.1.1 Biện pháp canh tác:

Chọn đất trồng có khả năng thoát nước tốt trong mùa mưa, tạo rãnh thoát nướckhông dé nước đọng lâu ngày ở gôc sâu riêng.

Trồng với mật độ vừa phải giúp vườn vừa thông thoáng, có đủ ánh sáng dé giảm

độ âm trong vườn, giảm áp lực nguôn bệnh.

Bon NPK cân đối, sử dụng phân chuồng hoai mục và chế phầm sinh học có chứa

vi sinh vật có ích như nam đối khang Trichoderma dé bón cho cây Không bón phân hoáhọc trực tiếp lên rễ cây dé gây ngộ độc phân

Thường xuyên thăm vườn, vệ sinh vườn thu gom tàn dư cây bị bệnh đem tiêuhuỷ; Cắt tỉa cành nhánh gần mặt dat, vệ sinh làm cỏ vùng gốc thông thoáng Trước khivào mùa mưa rắc vôi bột dé khử trùng bề mặt vườn, tủ gốc trông mùa khô dé giữ độ âm

cho cây.

1.1.6.1.2 Biện pháp sinh học:

Phòng bệnh và tăng sức đề kháng cho cây sầu riêng bằng chế phẩm sinh học chứanam đối khang Trichoderma, xạ khuân Streptomyces,

Các chế phẩm sinh học bón kết hợp với các đợt bón phân cho cây

Theo Dương Minh và cs (2006), đối với nam đối khang Trichoderma có một sốnghiên cứu cho thay khả năng trong việc phòng trừ nam bệnh Phytophthora (Harman

và Kubicek, 1998; Hoitink va Boehm, 1999), trong đó các chủng nam Trichodermatrong nội dia của đồng bang sông Cửu Long (ĐBSCL) cũng đã chứng tỏ tiềm năngphòng ngừa bệnh Phytophthora palmivora trên cây sầu riêng (Nguyễn Văn Tứ, 2005;

Dương Minh và cs, 2005).

1.1.6.1.3 Biện pháp hóa học:

Việc sử dụng thuốc hóa học là biện pháp cuối cùng

Được áp dụng dé phòng hoặc phòng trị bệnh Có thé áp dụng qua phun tán, tưới

đất, bôi thuốc, tiêm thân và kết hợp hai hay vài biện pháp trong năm Sử dụng các thuốc

gốc Cu, Phophate , dé tưới vào gốc hoặc phun trên lá dé phòng và trị bệnh (Nguyễn Thị

Thanh Nhãn, 2016)

Phun tán hay tưới gốc: Có thé áp dụng 4 - 7 lần hàng năm với Bordeaux 1%

hoặc các loại thuốc gốc đồng sử dụng luân phiên với một số hoạt chất được khuyến

cáo sử dụng như: Dimethomorph, Metalaxyl, Fosetyl - aluminum hoặc Potassium phosphite (còn gọi là phosphonate).

Bôi thuốc: Đối với những cây vết bệnh còn nhỏ thâm đen và chảy gôm trênthân, cành dùng đao bén cạo sơ phần mô chết, bôi lên mặt cắt và xung quanh vết bệnhbằng dung dịch thuốc có hoạt chất Metalaxyl, Mancozeb, 1% của Fosetyl - aluminiumhoặc Potassium phosphite Nồng độ thuốc theo khuyến cáo của nhà sản xuất và tiếnhành cạo và bôi thuốc trong thời gian khô ráo

Tiêm thân: Có thé tiêm thân với dung dich Potassium phosphite 20% hoạt chất

sử dụng ống tiêm Chemjet 20 ml Mỗi cây trưởng thành (từ 4 - 5 tuổi trở lên) tiêm 3 - 8ống tiêm Lượng thuốc tiêm (mũi tiêm) phụ thuộc vào đường kính thân Mỗi năm tiêm

1—2 lần khi đa số lá non gần đạt kích thước đầy đủ, trước khi cây ra hoa, đậu quả Tiêm

vào buổi sáng từ 6 — 11 giờ là thích hợp

1.2 Tổng quan về Phytophthora palmivora

1.2.1 Sơ lược về Phytophthora

Phytophthora là chỉ thuộc lớp Oomycetes trong giới nam Chromista,

Phytophthora không phải là nam thực mà là vi sinh vật giống nam

Phân loại nam Phytophthora

và chu kỳ sống gần giống như nam thực, tuy nhiên chúng được phân biệt rõ ràng với

nam thực bởi di truyền học và cơ chế sinh sản của chúng

Phạm vi kí chủ của nam Phytophthora rất rộng, có những loài chỉ tan công mộtloại kí chủ như P fragariae var Rubi và cũng có những loài tan công nhiều loài kí chủnhư P cinnamoni có thé tan công trên 1000 loài cây trồng khác nhau (Erwin và Riberio,1996) Chỉ có khoảng 60 loài chi Phytophthora là gây hại cho cây trồng, trong số chúng

có những loài có khả năng gây hại cho cây trồng trong điều kiện ôn đới và nhiệt đới

Phytophthora sp gây hại trên nhiều loại cây trồng chính là nguyên nhân chínhgay nên một số bệnh dịch nghiêm trọng trên thé giới như bệnh vụ mat mùa khoai tây do

bệnh mốc sương mà tác nhân là Phytophthora infestants gây ra nạn đói ở Châu Au thé

ki 19 Phytophthora gây ra nhiều bệnh cây trồng như: thối rễ, thối cổ rễ, cháy lá, nứtthân xì mủ, thối quả Các bệnh do Phytophthora sp gây ra thích hợp với điều kiện ẩm

ướt, độ âm cao.

Hình thức sinh sản

Tất cả các dòng phân lập được của Phytophthora đều có tính lưỡng tính, điều này

có nghĩa là chúng có thể sinh sản cả bộ phận sinh dục cái và đực hoặc túi giao tử Tuynhiên chỉ có khoảng một nửa loài Phytophthora là đồng tan và có thể sinh bào tử noãnnhanh và nhiều trong môi trường nuôi cấy, các loài còn lại là di tản và chỉ sinh túi giao

tử khi có sự kích thích hoá học từ các mẫu của hình thức sinh sản đối ngược nhau

(Brasier, 1992; Ko, 1978).

1.2.2 Các đặc trưng về hình thái của Phytophthora palmivora

Đối với Phytophthora một số loài có thê nhận biết khá dé dàng Tuy nhiên, giữachúng có sự khác biệt không nhiều và biến đổi và do đó làm khó khăn trong việc địnhdanh chính xác loài Đặc trưng chủ yếu dé phân loại Phytophthora bao gồm: sự hìnhthành túi bào tử, hình thành các cấu trúc của bộ phận hữu tính như túi đực, túi noãn, bào

tử noãn, chlamydospore và hình thành sợi nắm (Andre Drenth và Barbara Senndall, 2001)

Các đặc điểm quan trọng để xác định loài là:

* Hình thái bào tử (hình dang, kích thước, tỷ lệ chiều dai: chiều rộng) (Hình 1.1)+ Sự nhú của túi bào tử được thé hiện ở hình (Hình 1.2)

* Kha nang sinh sản (rụng bào tử khi trưởng thành)

* Chiều dai của cuống lá trên túi bào tử Sự phat triển của túi bào tử (sản xuất túi

bao tử mới trong túi bao tử đã nay mam trực tiếp)

¢ Sự phân nhánh của các tế bào bảo tử mà các túi bào tử được sinh ra (Hình 1.3)

— ~ =e ⁄

Obdturbinate Ellipsoid Pyriform Intercalary \@ “@

Basal plug conspicuous

Hình 1.1: Hình dang tui bao tử

(Nguon: André Drenth va Barbara Sendall, 2001)

Hình 1.2: Đặc điểm túi bao tử

(Nguồn: André Drenth và Barbara Sendall, 2001)Ghi chú: Non-papillate (không có mim), Semi-papilltae (mim thấp), Papillate

(núm nhô cao)

«©—— pedicel

4—— sporangiophore

Hình 1.3: Hình thai tui bao tử

(Nguôn: André Drenth và Barbara Sendall, 2001)

Ghi chú: Cành đơn (trai) Cành phức (giữa) Cành dạng dù (phải)

Một số loài Phytophthora sp san sinh túi bào tử dé dàng trên bề mặt môi trườngthạch Tuy nhiên, nhiều loài cần được nuôi cấy trong nước, dung dịch muối khoáng hoặcchất chiết xuất từ đất loãng trước khi chúng tạo túi bảo tử Điều quan trọng cần nhớ là

san sinh túi bào tử ở Phytophthora sp phụ thuộc vào ánh sáng (Schmitthenner va Bhat 1994).

Các túi bào tử được hình thành trên môi trường rắn hoặc lỏng

Túi bào tử sinh ra trên môi trường thạch: Phytophthora capsici, Phytophthora

hevae, Phytophthora mergakarya, Phytophthora nicotianea, Phytophthora palmivora.

Túi bao tử được sinh ra trên môi trường long: Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri.

Theo Eriwin va Ribeiro (1996), P palmivora có túi bao tử dạng núm, cuống rụngngắn khoảng 5 um, có dạng hình ellip, hình thoi, hình trứng, kích thước chiều dai 40 —

60 um, rộng 25 — 350 um, tỉ lệ dà/rộng khoảng 1,4 — 2,0 (Holliday, 1980) Nhiệt độ

phát triển thấp nhất là < 11°C, tối thích trong khoảng 27,5 — 30°C và tôi đa là >35°C

Theo Minh Châu và Coffey (1994) bào tử có kích thước dài x rộng trong khoảng 31,0 —

56,4 x 20,7 — 36,7 pm, nhiệt độ phát triển 5°C — 35°C, thích hợp nhất trong khoảng 24°C

— 30°C.

Theo Ho và Chang, 1995 Phytophthora palmivora phát triển tốt trong môi trườngV-8, nhiệt độ thích hợp nam phát triển tối thiểu 10°C, trung bình 30°C, tối đa 35°C, hình

thành túi bào tử trong môi trường nước với cuống rụng ngắn < 5 um, túi bao tử thường

có chóp đầu dạng hình cầu hoặc nông bán cầu, hình dạng trứng, trứng ngược, elip, quả

chanh, quả lê ngược Kích thước bào tử (14-) 32 — 55 (-65) x (11-) 23 — 39 (-48) pm,

trung bình 48 x 32 um, tỉ lệ D/R (1,08-) 1,3 — 1,8 (-2,8), trung bình 1,5.

Chlamydospores có đường kính khoảng từ 36,2 + 9,6 im (Minh Châu và Coffey,

1994), trung bình 33 um (Water-House, 1963) và trung bình 32 - 42 um (Holliday,

1980), vách day 1 — 2 um Sự hình thành hệ sợi nam có ở giai đoạn cuối và giai đoạngiữa Đường kính trung bình khoảng (21-) 34 (-41) um (Ho và Chang, 1995).

1.2.3 Quy luật phát triển của bệnh

1.2.3.1 Chu kỳ phát triển bệnh

Nam Phytophthora sp là loại nam có nguồn bệnh tôn tại trong đất Trong điềukiện nhiệt đới âm ướt, Phytophthora sp phát triển liên tục trong năm, chu kỳ bệnhkhông bị gián đoạn Từ đầu mầm bệnh nguyên thuỷ của Phytophthora sp là những sợinam và hậu bao tử tổn tại ở rễ, vỏ cây và quả bị nhiễm bệnh trước đây Khi điều kiện

môi trường thay đổi thuận lợi cho nắm phát triển thì mầm bệnh nguyên thuỷ sẽ nảy

mầm và bắt đầu xâm nhiễm, mầm bệnh thứ cấp được hình thành, đó là nguồn lantruyền của dịch bệnh Tỷ lệ phát sinh và lan truyền của mầm bệnh là cở sở quyết định

sự nhiễm bệnh mới Sự gia tăng nhanh chóng của mầm bệnh thứ cấp sẽ gây bùng phát

dịch bệnh (Drenth va cs, 2004).

Bào tử nang cũng được hình thành trên tàn dư cây bệnh ở bề mặt đất và đượcphóng thích vào những vũng nước hoặc kênh rạch, sông và những đập nước, nguồn bệnh

được lan truyền nhanh chóng theo nguồn nước Sau đó tiếp xúc và xâm nhập vào cây,

chỉ trong vòng ba ngày nảy mầm có thể nhân đủ số lượng để gây bệnh và hình thànhtriệu chứn điền hình (Nguyễn Văn Uyên và Nguyễn Tài Sum, 1996)

1.2.3.2 Quá trình lây lan của nắm

Phytophthora có thé xâm nhiễm trên nhiều bộ phận khác nhau của sâu riêng.

nhánh non chết dan, sau đó chết cả cây, có nhiều khi chết tro cành Đối với những vườn

có thành phần sét nhiều nhưng ít bón hữu cơ nên đất bị nén chặt, vườn bị oi nước trong

mùa mưa, trong khi mùa nắng đất lại bị khô nứt làm ảnh hưởng xấu đến sự phát triểncủa hệ thống rễ và tạo điều kiện cho các loài nam gây hại trong đất phát triển và tancông rễ Vườn không bón vôi cho đất cũng là điều kiện giúp bệnh phát triển và gây hạinặng Nắm bệnh hại rễ tồn tại trong đất qua một thời gian dài khi không có ký chủ vànguồn bệnh trông đất răng dan qua nhiều năm Chúng có thé lan truyền theo nguồn nướctưới, đất do động vật và người mang hoặc cây giống bị nhiễm bệnh (Nguyễn Văn Uyén,

1996).

Phytophthora còn được gọi là nam thuỷ sinh Nắm xâm nhập vào thân cây, quaqua vết thương cơ giới do sâu hoặc vết xước trên cây mầm bệnh lan truyền từ đất vàocây là kêt quả tác động của con người, mưa, gió Ngoài ra, côn trùng như môi, kiên,nguồn cây giống cũng là phương tiện góp phan lây lan mầm bệnh

1.3 Một số nghiên cứu về sử dụng dịch chiết thực vật

1.3.1 Dịch chiết gừng (Zingiber officinale)

Trong gừng có nhiều tinh dau, trong đó có jamical có tính diệt nắm và mecin

có tính diệt khuẩn

Nước gừng có khả năng ức chế sự sinh sản của tế bào ung thư và làm giảm bớtcác tác dụng phụ của các thứ thuốc chống ung thư Trong gừng còn có các chất

zingiberol, zingiberen, aldehyde có tác dụng tiêu viêm, giảm dau và diệt khuẩn Bên

cạnh đó trong gừng còn có những chất có tác dụng giống như thuốc kháng sinh và tác

dung của chúng rõ rệt trong việc diệt trừ một sô loại nam và vi khuân.

Gừng có tác dụng điều hoà miễn dịch Trong gừng chứa monoterpenoids,sesquiterpenoids, hợp chat phenolic và các dẫn xuất của nó, aldehyd, ketone, rượu, este,cung cấp phô kháng khuẩn rộng chống lại các vi sinh vật khác nhau và làm cho nó trởthành một chất thay thế thú vị cho các chất kháng khuẩn tổng hợp (Lim và cs, 2018; Gao

và cs, 2022) Ví dụ, 6 — gingerol ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư cô tử cung

ở người.

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cả chiết xuất gừng và tinh dầu gừng đều

có hoạt tính kháng nam chéng lại mầm bệnh thực vật, chẳng hạn như Fusariumoxysporum và Colletotrichum falcatum (Abdullahi và cs, 2020) Noshirvani và cs

(2017) báo cáo rằng tinh dầu gừng có thé được sử dung dé làm dẻo mang chitosan —carboxymethyl cellulose đồng thời cải thiện tính thấm âm và duy trì hoạt tính kháng

nam Tuong tu, Agarwal va cs (2001), dé xuat rang 6-dehydroshogaol được phan lập từ

thân rễ gừng thể hiện hoạt động điều tiết sự phát triển của côn trùng tối đa trong khidehydrozingerone thé hiện hoạt động kháng nắm tối đa Những phát hiện nay chỉ ra rằngchiết xuất gừng có thé hữu ích như một chat thay thế cho thuốc diệt nam và diệt khuẩn

Theo Nguyễn Thy Đan Huyền, Lê Thanh Phong (2019), nghiên cứu hoạt tínhkháng nam Colletotrichum musae và nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh than

thư hai chuối va ớt từ dich chiết gừng (Zingiber officinale) Dich chiết gừng ở nồng độ

20% đã ức chế 89,21% sự phát triển đường kính tản nắm C musae và ức chế 65,58%

sự phát triển đường kính tan nam C gloeosprioides sau 192 giờ nuôi cây Quan sát dướikính hiển vi sau 12 giờ cho thấy, dịch chiết gừng nồng độ 10% ức chế 97,33% và 94,00%

sự nảy mam bao tử nam C musae và nam C gloeosporioides

1.3.2 Lá trầu không (Piper betle L.)

Lá trau không (Piper betle L.) là nguồn nguyên liệu tiềm năng trong phòng trừbệnh hại cây trồng Trong lá trầu không chứa các hoạt chất có tác dụng kháng nắm và

vi khuan rất mạnh bao gồm hydroxychavicol, hydroxychavicol acetate, chavibetol

allyryrocatechol, piperbetol, methylpiperbetol, piperol A va piperol B.

Theo Singburaudom (2015), dịch chiết thé từ lá trau không có kha năng ức chếtốt đến sự nảy mam của bảo tử và sự phát triển sợi nắm của một số loại nắm hại câytrồng như Colletotrichum gloeosporiodes, Colletotrichum capsici, Fusariumoxysporum và Pyricularia oryzae Sử dụng dich chiết lá trầu không ở nồng độ phaloãng 1% đã ức chế 100% sự phát triển sợi nam của 4 loại nam trên trong điều kiện in vitro

Theo Ngô Mai Vi, Nguyễn Văn Viên (2015), dịch chiết lá trầu không có khảnăng ức chế tốt nam gây bệnh dém den ở nồng độ 3% — 9% , hạn chế sựu phát triển

của bệnh trên đông ruộng, góp phân nâng cao năng suât, phâm chât của cây đậu.

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VA VAT LIEU NGHIÊN CUU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phan lập và định danh Phytophthora sp gây bệnh nứt thân xì mủ

trên cây sầu riêng bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử

Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế Phytopthora palmivora của dich chiếtgừng với lá dịch chiết lá trầu không trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 05 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Được thực hiện tại phòng thí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnh học va Chân đoán),

Khoa Khoa học Sinh học và nhà màng thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học

Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Các trang thiết bi gồm: cân điện tử (PX OHAUS), bếp điện Sunhouse, dia petri,

tủ cay vi sinh, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), may hap khử trùng (MC40L, ALP,Japan), 16 vi song, May lac Vortex ZX3 Velp, may ly tam HERMLE Z287A, may PCR(TurboCycler), hệ thống chụp gel UV, tủ âm -20°C, máy điện di

2.3.3 Môi trường và hóa chat sử dụng

Hóa chất sử dụng

Hóa chất phân lập: Ethanol 70%, Ethanol 96%, Methanol, kháng sinh

Chloramphenicol.

Ly trích DNA: dung dich đệm CTAB muối 2X (0.2g/1 CTAB, 0.02M Tris HCl

pH 7.5, NaCL 2M, EDTA 0.05M); PCI (Phenol - Chloroform - Isoamyl, 25:24:1);

Isopropanol; EtOH 70%; Lysis buffer; Chloroform; TE.

Thành phan PCR: Mytaq Mix 2X, nước cat, DNA, primer

Ky thuat dién di: Agarose 1,5%, TBE 0,5X (Tris-Borate; EDTA; pH 8.0),

6XGelred DNA Loading buffer tricolor, Ladder 1Kb.

Phương pháp chuẩn bị một số môi trường cho quá trình phân lập

Môi trường WA (môi trường Water Agar): Dun sôi 500 mL nước cất, sau đóthêm vào 20 gram agar nấu cho đến khi tan hết agar và thêm nước cất vào cho đến khidung dịch vừa đủ 1000 mL Hap khử trùng bằng nỗi hap ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong

20 phút sau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 mL dung dịch)

Môi trường PDA (môi trường Potato Dextrose Agar): 200 gram khoai tây đã lột

vỏ rửa sạch, thái nhỏ, nấu trong 500 mL nước cất cho đến khi khoai tây mềm, lọc bỏ bã,thêm 20 gram đường dextro và 20 gram agar vào nấu cho đến khi hoà tan hoàn toàn,thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đủ 1000 ml Hap khử trùng bằng nồi hấp

ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phút sau đó dé ra dia petri (mỗi đĩa 15 mL dung dich)

Môi trường PCA (môi trường Potato Carrot Agar): 20 gram khoai tay, 20 gram

cà rốt lột vỏ, rửa sạch thái nhỏ, nấu với 500 mL nước cất cho đến khi nguyên liệu mềm,

lọc bỏ bã, thêm 20 gram agar vào nấu cho đến khi hoà tan hoàn toàn, thêm nước cất cho

đến khi dung dich vừa đủ 1000 ml Hap khử trùng bằng nồi hap ở nhiệt độ 121°C, 1 atm

trong 20 phút sau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 mL dung dịch)

2.4 Phương pháp thí nghiệm

2.4.1 Nội dung 1: Phan lập và định danh Phytophthora sp gầy bệnh nứt thần xì

mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử

Phương pháp thu thập mẫu bệnh

Áp dụng phương pháp thu mẫu bệnh của Nguyễn Việt Trung (2021) được thực

hiện như sau:

Quá trình thu mẫu bệnh được tiến hành trên 2 vườn Sau Riêng Ri6 và vườn SauRiêng Monthong có tuổi cây khoảng 10 năm thuộc dia phận xã Tam Bình và xã HộiXuân, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang Sầu Riêng được trồng với mật độ 145 cây/ha với

khoảng cách trồng 8m x 8m Tiến hành thu mau tại 2 vườn, mỗi vườn chon 3 cây sầu

riêng có triệu chứng tiêu biéu cho bệnh nứt thân xì mủ, mỗi cây thu 5 mẫu bao gồm mẫuthân, mẫu đất, mẫu nước trong kênh mương và mẫu của tàn dư thực vật tại ví trí cây bịnhiễm bệnh, vườn được thu mẫu phải có thời gian cách ly thuốc ít nhất là 14 ngày

Quan sát và chọn những cây sầu riêng đã có biểu hiện của triệu chứng bệnh nứtthân xì mủ Phần thân cây chảy nhựa trên bề mặt vỏ thân, vết bệnh ướt và nhựa có màunâu Vỏ thân và gỗ bên dưới bị chuyên sang màu hồng nhạt có bớt tím, viền gon sóng,bệnh lan dần vào bó mạch Khi cạo lớp vỏ bị bệnh ra thấy phần gỗ có màu nâu sam dọc

theo thân, cảnh.

Mẫu được thu thập cho vào túi nilon và ghi thông tin người lấy mẫu, ngày lấymẫu, tên cây kí chủ, địa chỉ noi lay mẫu tên mẫu bệnh, triệu chứng và dấu hiệu của bệnhcây Tất cả mẫu bệnh thu thập được bảo quản giữ ẩm trước khi tiễn hành phân lập

Phương pháp bảo quản mẫu bệnh

Áp dụng phương pháp quản lý thực vật của Roger Shivas và Dean Beasley

(2005): Sử dụng túi giấy dé lay và giữ mẫu bệnh, gói mẫu cân thận tránh va đập và hơinước ngưng tụ, dùng bút ghi chú thông tin mẫu thu được

Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu mẫu bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng ở

tỉnh Tiên Giang

# i Mau

Maso Vị tri, địa diém Vi tri thu `

Giông bệnh/ Kí hiệu mầu bệnh

vườn thu mầu mầu

vườn

TGI Xã Hội Xuân Monthong, Ri6 12 Thân HXT1 —HXT12

TG1 Xã Hội Xuân Ri6 2 Đất HXD1-HXD2

TGI Xã Hội Xuân Ri6 1 Nước HXNI

TG2 Xã Tam Binh Monthong, Ri6 12 Thân TBT1 —TBT12

TG2 Xa Tam Binh Monthong 2 Dat TBDI - TBD2

TG2 Xã Tam Binh Ri6 | Nước TBNI

Tên mẫu được đặt theo thứ tự: Tên xã lay mẫu — Vị trí thu mẫu VD: HXT (Hội Xuân - Thân)Phương pháp phân lập nắm từ thân cây và tan dư thực vật

Áp dụng phương pháp của Burgess va cs (2009) cho việc phân lập nắm từ thân

được thực hiện như sau:

Phương pháp phân lập: Rửa sạch mẫu thân dưới vòi nước để loại bỏ đất và các

vi sinh vật hoại sinh bám bên ngoài thân Cắt thân thành những đoạn dài 2 cm tại phầnranh giới giữa mô bệnh va mô khoẻ Khử trùng mẫu bang ethanol 70% trong 1 phút sau

đó rửa lại bằng nước cắt vô trùng 4 lần rồi thắm khô bằng giấy thấm vô trùng Cấy mẫulên môi trường WA, sau khi cay xong nên đặt ngược đĩa petri dé tránh đọng hơi nướctrên bề mặt môi trường cấy, tiếp đến đặt đĩa petri trong điều kiện nhiệt độ phòng (25°C — 28°C)

Khi các sợi nắm bắt đầu xuất hiện từ các mẫu cấy tiến hành cấy chuyền đỉnh sợinắm lên môi trường PDA Làm thuần mẫu nắm bằng cách tiếp tục cấy đỉnh sinh trưởngcủa sợi nam

Phương pháp phân lập tác nhân từ dat

Thu mau dat cách gốc sau riêng khoảng 50 — 100 cm, sâu 5 — 10 cm Mau dat

đó trộn đều thành một mẫu đất (01 mẫu/ cây) Mỗi vườn lấy 2 mẫu theo vị trí cây bị

bệnh nứt thân xì mủ, mỗi mẫu 500g Mẫu thu thập được ghi rõ các thông tin, gồm: ngày,

địa điểm, tên chủ vườn, giống, tuổi cây, bộ phận bị hại, điều kiện đất đai và cuối cùng

bảo quản mẫu

Áp dụng theo phương pháp bay đất theo Burgess và es (2009) cho việc phân lậpnhóm tác nhân có khả năng phóng thích động bào tử như sau:

Cho mẫu đất đã thu thập vao thé thủy tinh có đường kính 15 cm đã được khửtrùng bề mặt bằng cồn ethanol 70% Cho nước cất vào thé thủy tinh cho đến khi nướcngập qua mẫu đất 5 cm Tiến hành thả cánh hoa hồng đỏ kín mặt nước trong thố Đặt

thé ở vị trí tĩnh trong vòng 2 — 3 ngày Tiến hành phân lập khi vết bệnh đã phát triển

trên cánh hoa hồng

Hình 2.1 Phân lập mẫu dat bằng phương phấp bay hoa hồngPhương pháp phân lập: Rửa sạch cánh hoa hồng bằng nước cat vô trùng, cắt phầnranh giới giữa mô bị bệnh và mô khỏe trên cánh hoa Khử trùng mẫu bằng ethanol 70%

trong 1 phút sau đó rửa bằng nước cất vô trùng 4 lần rồi thắm khô bằng giấy thấm

vôtrùng Cay mẫu lên môi trường WA, sau khi cấy xong nên đặt ngược đĩa petri dé tránh

đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy, tiếp đến đặt đĩa petri trong điều kiện nhiệt

độ phòng ( 25°C — 28°C) Khi các sợi nấm bắt đầu xuất hiện từ các mẫu cay tién hanh

cấy chuyền đỉnh sợi nam lên môi trường PDA Làm thuần mẫu nam bang cách tiếp tục

cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nam

Phương pháp phân lập tác nhan từ nước

Mẫu nước được thu thập tại vị trí mà cây bị nhiễm bệnh (nhằm nâng cao khả năng

xuất hiện của nắm) Áp dụng theo phương pháp của Nguyễn Ngọc Bảo Châu (2023) để

tiễn hành

Phương pháp phân lập: Môi trường PDA được hấp vô trùng trong nồi hấp ở121°C, lay ra dé nguội đến 45 — 55°C, thêm kháng sinh penicillin hay streptomycin vàotrong bình lắc đều cho đến khi hoa tan hết Dùng pipette hút 100 — 120 pL (lắc đều mẫu

nước trước đó) Nhỏ vào giữa đĩa petri có đường kính 90 mm, dùng que cấy gạt đều

dung dịch trên bề mặt thạch, úp ngược dia petri và dé ở nhiệt độ phòng từ 5 — 7 ngày

Sau đó nhận dang và cấy truyền sợi nam khả nghi là Phytophthora lên môi trường PDA

và cay chuyền đỉnh sợi nam dé làm thuần

Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch

Áp dụng phương pháp theo Burgress và cs (2009) tiến hành lây bệnh nhân tạo.Được thực hiện trên cây sầu riêng, tiễn hành tạo vết thương hở sau đó cắt hạch nam lây

nhiễm lên vết thương đã tạo ở trước đó

Tiến hình trên 2 cây sầu riêng không bị nhiễm bệnh, trong đó cây sầu riêng đượctạo 2 vết thương hở bao gồm: vị trí 1 với nước cất đã hấp khử trùng, vị trí 2 với nam

Phytophthora sp và vị trí 3 không tạo vết thương hở với nam Phytophthora sp Lap lại

tương tự trên cây thứ 2, sau đó đặt trong nhà màng và theo dõi liên tục trong 15 ngày.

Các bước chủng Koch:

1 Dùng que cấy hoặc kim tiêm chọc vào phan thân dưới của cây được lây bệnh vagắn một miếng thạch nhỏ từ mẫu tác nhân gây bệnh đã làm thuần vào vị trí vết thương(hoặc tiêm một lượng nhỏ địch bào tử vào thân, dùng kim hoặc ống tiêm)

2 Dùng que cấy hoặc kim tiêm chọc vào phần thân dưới của cây đối chứng nhưng

không lây bệnh

3 Dùng parafilm hoặc màng nilon bọc vết thương hoặc vị trí lay bệnh

4 Tưới âm cho đất mỗi ngày

5 Kiêm tra và so sánh cây được lây bệnh với cây đôi chứng Quan sát va ghi nhận

các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát trên

đồng ruộng

A: Dùng dao tạo vết thương trên thân; B: Lay nhiễm nam từ tác nhân đã được làm

thuần vào vét thương; C: Co định vét thương băng parafin

2.4.2 Định danh nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm

hình thái.

Nhận diện sơ bộ các dòng nam đã được phân lập thông qua đặc điểm hình tháisau khi phân lập, các mẫu nam được quan sát bằng mắt thường và kính hiển vi (Klich,2002) về hình dạng tản nam, mau sắc bào tử, đặc điểm cơ quan sinh bào tử, hình dạngbào tử dé tiễn hành nhận diện sơ bộ

Dựa trên các đặc điểm hình thái học của Phytophthora theo Wilson (1914), cách

thức hình thành và hình thái của các bọc bao tir Phytophthora là tiêu chí thực tiễn cho

việc giám định theo tài liệu tham khảo của Erwin và Ribeiro (1996) để tiến hành địnhdanh nam Phytophthora

2.4.3 Định danh nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng kĩ thuật sinh

học phan tử.

2.4.3.1 Ly trích DNA

Quy trình ly trích DNA nam bằng hóa chất được thực hiện theo phương pháp củaIzumitsu va cs (2012) được tiến hành như sau:

1 Cao lấy sinh khối nam 0,1 — 0,5 gam sợi nam

2 Hút 400 pl lysis buffer — nghiền bằng vortex trong 10 giây rồi ủ 65°C trong 60 phút(10 phút khuấy đều eppendorf 1 lần)

3 Bồ sung 300 pl PCL Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút

4 Hút 300 pl dịch nổi và 100 ul Chloroform (3:1) Ly tâm 14 000 vòng/phút trong 5

phút.

5 Hút 200 yl dịch nổi Hút 100 pl Isopropannol, lắc nhẹ Ly tâm 14 000 vòng/phút trong

10 phút Loại bỏ hoàn toàn dịch nồi

6 Cho 480 pl EtOH 70% vào hỗn hợp Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút > loại

bỏ dich nồi (lặp lại 2 lần) Dé khô tự nhiên

7 Pha loãng mẫu với 50 yl TE buffer DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở 20°C.

-2.4.3.2 Phan ứng PCR

Các mẫu ly trích DNA của các dong nắm phân lập được khuếch đại bằng cách sử

dụng các mồi được liệt kê trong Bảng 2.2 Thành phần của một phản ứng PCR (25 pL)bao gồm: 2 pL DNA tổng số (1 ng/uL), 12,5 wL 2x DreamTaq Red PCR MasterMix(Thermo Scientific Inc., Hoa Kỳ), 6,5 uL nước tinh khiết và 2 wL của mỗi mỗi (10 0M)(Apical Scientific, Malaysia) Quá trình khuếch đại được thực hiện trong bộ tuần hoànnhiệt có thê lập trình (Blue-Ray Biotech TuborCycler) sử dụng chương trình nhiệt nhưBảng 2.3 và Bảng 2.4 Tất cả các phản ứng PCR đều được thực hiện trong quá trình nhânđôi Các sản phẩm PCR được nhuộm với 6X Gelred DNA Loading trên gel điện di agarose

1,5% trong dung dịch đệm TBE 0,5X (Tris-Borate; EDTA; pH 8.0) ở 100V trong 25