Khóa luận tốt nghiệp ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và điều kiện ánh sáng trong việc tạo callus của lan thạch hộc (dendrobium officinale) từ thân cây và nhân nhanh giống lan thạch hộc trong điều kiện phòng thí nghiệm

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN ÁNH SÁNG TRONG VIỆC TẠO CALLUS CỦA LAN THẠCH HỘC (DENDROBIUM OFFICINALE) TỪ THÂN CÂY VÀ NHÂN NHANH GIỐNG LAN THẠCH HỘC TRONG ĐIỀU KIỆN PHỊNG THÍ NGHIỆM Sinh viên thực : NGÔ VÂN LONG Mã sinh viên : 621692 Lớp : K62-CTDL Giáo viên hướng dẫn : TS PHẠM PHÚ LONG Bộ môn : THỰC VẬT HÀ NỘI, 2021 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực thân, tơi nhận nhiều giúp đỡ, dẫn tận tình cá nhân, tập thể Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Phú Long tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tơi suốt q trình thực hồn thành đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến Thầy tồn thể cán nhân viên môn Thực vật – Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè ln động viên, ủng hộ giúp đỡ tơi q trình thực đề tài tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Ngô Vân Long i năm 2021 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP vii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) 2.2 Phân loại 2.3 Đặc điểm hình thái 2.4 Phân bố 2.5 Giá trị Lan Thạch Hộc 2.6 Thực trạng khai thác phát triển Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) Việt Nam 11 2.7 Nhân giống nuôi cấy mô in vitro 11 2.8 Các nhân tố ảnh hưởng tới trình nhân giống in vitro 14 2.8.1 Điều kiện khử trùng mẫu 14 2.8.2 Môi trường nuôi cấy 14 ii 2.8.3 Ảnh hưởng yếu tố vật lý 18 2.9 Một số nghiên cứu nhân giống bảo tồn Lan Thạch Hộc nước 18 2.9.1 Nghiên cứu nhân giống bảo tồn nguồn gen Lan Thạch Hộc giới 18 2.9.2 Nghiên cứu giống bảo tồn nguồn gen Lan Thạch Hộc Việt Nam 19 PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Địa điểm, thời gian vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 21 3.1.2 Thời gian nghiên cứu 21 3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 21 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu 21 3.4 Phương pháp đánh giá kết xử lý số liệu 25 3.4.1 Các tiêu theo dõi 25 3.4.2 Phương pháp xử lý số liệu 26 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết thí nghiệm cảm ứng tạo chồi in vitro từ vật liệu khởi đầu (cây bố mẹ) sau 30 ngày 27 4.2 Sự phát triển nốt sần giai đoạn nhân nhanh 34 4.3 Giai đoạn hình thành phát triển chồi mầm từ cụm PLB sau 30 ngày nuôi cấy 37 4.4 Giai đoạn sinh trưởng phát triển chồi Lan Thạch Hộc 42 4.5 Phát triển cân rễ thân cho 44 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Đề nghị 49 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC KẾT QUẢ CHẠY PHẦN MỀM 52 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Môi trường tạo callus 22 Bảng 3.2 Môi trường nhân nhanh callus 23 Bảng 3.3 Môi trường tái sinh chồi 23 Bảng 3.4 Môi trường sinh trưởng phát triển chồi 24 Bảng 3.5 Môi trường rễ 25 Bảng 4.1 Ảnh hưởng điều kiện tối đến khả tạo chồi từ vật liệu khởi đầu Lan Thạch Hộc (sau 30 ngày nuôi cấy) 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng điều kiện sáng đến khả tạo chồi từ vật liệu khởi đầu Lan Thạch Hộc (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.3 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình nhân nhanh tạo PLB 38 Bảng 4.4 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng lên trình tạo rễ 43 Bảng 4.5 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến phát triển cân rễ thân 44 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) Hình 2.2 Thân Lan Thạch Hộc Hình 2.3 Lá Lan Thạch Hộc Hình 2.4 Hình ảnh phong đấu Hình 4.1 Mẫu sau cấy nuôi điều kiện tối 28 Hình 4.2 Chồi bắt đầu có dấu hiệu hình thành từ vật liệu ban đầu nuôi điều kiện tối 28 Hình 4.3 Chồi hình thành từ vật liệu ban đầu nuôi điều kiện tối 30 Hình 4.4 Nốt sần phát triển khơng điều kiện tối 29 Hình 4.5 Nốt sần to khỏe, phát triển điều kiện tối 31 Hình 4.6 Chồi bắt đầu hình thành ni điều kiện sáng 32 Hình 4.7 Nhân nhanh PLV 36 Hình 4.8 Hình ảnh cụm PLB 36 Hình 4.9 Lan Thạch Hộc Sau tuần ni cấy in vitro 39 Hình 4.10 Lan Thạch Hộc Sau tuần nuôi cấy in vitro 41 Hình 4.11 Cây phát triển sau 30 ngày nuôi cấy mô 46 Hình 4.12 Cây Lan Thạch Hộc ni cấy mô đầy đủ rễ thân chuẩn bị đưa mơi trường bên ngồi 47 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CT Công thức MT Môi trường ĐC Đối chứng MS Murashige & Shood medium, 1962 NAA Naphtanyl acetic acid PLB Protocorm like bodies 6-BA 6-Benzylaminopurine vi TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) loài thuộc chi Hoàng thảo Ngoài giá trị thẩm mỹ, cịn có giá trị dược liệu, sử dụng phổ biến y học cổ truyền nhiều nước Châu Á Tuy nhiên Việt Nam, tự nhiên Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) mọc rải rác vài nơi độ cao 1.000 - 3.400m bị khai thác mức Biện pháp nhân giống phù hợp hiệu để bảo tồn, phát triển nguồn gen thuốc quý nuôi cấy mô Trong nghiên cứu, Lan Thạch Hộc nhân giống thành công sử dụng vật liệu ban đầu mẫu đốt thân thông qua cảm ứng tạo PLB (Protocorm like bodies) Vật liệu sau khử trùng 10 phút dung dịch HgCl2 0,1% ni cấy mơi trường ½ MS + 0,1 g/l Inositol + 30 g/l Đường + g/l Agar tương ứng với cơng thức thí nghiệm có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 6-BA (0,5; 1,0; 1,5 2,0 ppm/l) kết hợp NAA (0,5 1,0 ppm/l) điều kiện nuôi cấy in vitro Qua giai đoạn, thấy mơi trường ni cấy thích hợp tổ hợp cho nhân giống in vitro Lan Thạch Hộc sử dụng 6-BA nồng độ 1,0 1,5 ppm/l kết hợp NAA nồng độ 0,5 ppm/l Và tạo sần cần nuôi cấy điều kiện tối để đạt tỉ lệ cao Từ khóa: Dendrobium officinale, nhân giống ni cấy mô, 6-BA, NAA, môi trường MS, cảm ứng PLB (Protocorm like bodies) vii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) loài phân bố chủ yếu số vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trung Quốc Đây thảo dược chuyên dụng để điều trị bệnh tiểu đường số bệnh nan y Thạch Hộc tía (hay cịn gọi Thạch Hộc thiết bì) có hoạt tính tăng cường Insulin, giảm đường huyết giúp cho máu hoạt động bình thường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản,giảm cholesterol tri-glyceride mà cịn có khả tiêu diệt số tế bào ác tính ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thư tương đối mạnh Được dùng chữa bệnh sốt nóng, khơ cổ, khát nước, không muốn ăn, mắt kém, khớp xương sưng đau Thạch Hộc có khả phát triển rộng rãi vùng miền nước ta, đem lợi ích đáng kể cho nơng dân, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng, xuất đem ngoại tệ cho đất nước Theo Đặng Văn Đông (2004) giá Thạch Hộc từ 100.000 - 1.000.000 đồng/cây Điều làm nên giá trị dược liệu lồi hợp chất polysaccharide alkaloid Nhu cầu Trung Quốc nước giới Thạch Hộc lớn, có giá cao, đem lại siêu lợi nhuận cho người trồng chế biến Thạch Hộc Hiện Thạch Hộc nằm danh mục Đỏ “Sách đỏ Việt Nam” năm 2007 Để bảo tồn phát triển loài Thạch Hộc quý nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng cần phải nghiên cứu ni trồng chúng Xuất phát từ lợi ích nhu cầu thực tế nay, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng điều kiện ánh sáng việc tạo callus Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) từ thân nhân nhanh giống Lan Thạch Hộc điều kiện phịng thí nghiệm” 5.2 Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện sáng tối thích hợp, đánh giá khả tạo sần từ vật liệu ban đầu để tạo nguồn vật liệu nghiên cứu tốt cho nghiên cứu giai đoạn sau với số lượng lớn - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm Auxin Cytokinin tổ hợp khác chúng để đánh giá khả cảm ứng tạo PLB, nhân nhanh, tạo rễ, tạo Lan Thạch Hộc hồn chỉnh tốt 49 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Khoa học Công nghệ (2007), Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), NXB Khoa học tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội Vũ Văn Vụ (1994), Sinh lý học thực vật, Nhà xuất Khoa học - Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Quang Thạch (1995), Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nôngnghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng đến khả nhân nhanh biện pháp kỹ thuật đến sinh trưởng giống Lan Thạch Hộc tía (dendrobium officinale kimura et migo) Thái Nguyên Tài liệu Tiếng Anh Zhang G, Nie S, Huang X, et al Study on Dendrobium officinale OAcetyl-Glucomannan (Dendroman) 7.improving effects on colonic health of mice [J] Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 64 (12): 2485-2491 Zhang J, He C, Wu K, et al Transcriptome analysis of Dendrobium officinale and its application to the indentification of genes associated with polysaccharide synthesis [J] Frontiers in Plant Science, 2016b, 7: 5.doi: 10.3389/ fpls 2016 00005 Tài liệu Internet Nhân giống In vitro Dendrobium Officinale Kimura et Migo Thạch Hộc Thiết Bì https://www.nuoicaymothucvat.net/2018/05/nhan-giong-in-vitro-landendrobium.html 50 Thạch Hộc Tía – Dendrobium Officinale – Một vị thuốc quý https://orchivi.com/thach-hoc-tia-dendrobium-officinale-mot-vi-thuocquy/ 10 Thạch Hộc https://www.thuocdantoc.org/duoc-lieu/thach-hoc 51 PHỤ LỤC KẾT QUẢ CHẠY PHẦN MỀM N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Minimum Maximum Interval for Mean Duongkinhthan Chieucaocay Lower Upper Bound Bound 1.00 2000 00000 00000 2000 2000 20 20 2.00 2000 00000 00000 2000 2000 20 20 3.00 2000 00000 00000 2000 2000 20 20 4.00 10 2000 00000 00000 2000 2000 20 20 6.00 2000 00000 00000 2000 2000 20 20 Total 30 2000 00000 00000 2000 2000 20 20 1.00 4.9000 89443 40000 3.7894 6.0106 3.50 6.00 2.00 4.4000 1.02470 45826 3.1277 5.6723 3.50 5.50 3.00 3.4000 82158 36742 2.3799 4.4201 2.50 4.50 4.00 10 5.4000 1.28668 40689 4.4796 6.3204 4.00 8.00 52 Sola Chieudaila Chieurongla 6.00 Total 5.4000 65192 29155 4.5905 6.2095 5.00 6.50 30 4.8167 1.21402 22165 4.3633 5.2700 2.50 8.00 1.00 4.6000 89443 40000 3.4894 5.7106 4.00 6.00 2.00 4.4000 1.14018 50990 2.9843 5.8157 3.00 6.00 3.00 4.2000 1.09545 48990 2.8398 5.5602 3.00 6.00 4.00 10 4.3000 1.41814 44845 3.2855 5.3145 3.00 7.00 6.00 4.6000 1.14018 50990 3.1843 6.0157 3.00 6.00 Total 30 4.4000 1.13259 20678 3.9771 4.8229 3.00 7.00 1.00 2.2400 27928 12490 1.8932 2.5868 1.90 2.50 2.00 2.3000 64807 28983 1.4953 3.1047 1.70 3.00 3.00 2.0000 21213 09487 1.7366 2.2634 1.70 2.30 4.00 10 2.5600 29889 09452 2.3462 2.7738 2.00 3.00 6.00 2.5400 36469 16310 2.0872 2.9928 2.00 3.00 Total 30 2.3667 40712 07433 2.2146 2.5187 1.70 3.00 1.00 5400 11402 05099 3984 6816 40 70 2.00 4800 13038 05831 3181 6419 30 60 3.00 3000 00000 00000 3000 3000 30 30 53 Sore Chieudaire Trongluongtuoi 4.00 10 4400 06992 02211 3900 4900 30 50 6.00 5200 04472 02000 4645 5755 50 60 Total 30 4533 11059 02019 4120 4946 30 70 1.00 4000 54772 24495 -.2801 1.0801 00 1.00 2.00 6000 54772 24495 -.0801 1.2801 00 1.00 3.00 2000 44721 20000 -.3553 7553 00 1.00 4.00 10 4000 51640 16330 0306 7694 00 1.00 6.00 1.14018 50990 -.0157 2.8157 00 3.00 Total 30 5667 72793 13290 2949 8385 00 3.00 1.00 1400 21909 09798 -.1320 4120 00 50 2.00 2000 21213 09487 -.0634 4634 00 50 3.00 0600 13416 06000 -.1066 2266 00 30 4.00 10 0800 11353 03590 -.0012 1612 00 30 6.00 1600 11402 05099 0184 3016 00 30 Total 30 1200 15403 02812 0625 1775 00 50 1.00 3200 00000 00000 3200 3200 32 32 2.00 6200 00000 00000 6200 6200 62 62 1.4000 54 Trongluong1cm 3.00 4700 00000 00000 4700 4700 47 47 4.00 10 3050 00527 00167 3012 3088 30 31 6.00 2600 00000 00000 2600 2600 26 26 Total 30 3800 12798 02337 3322 4278 26 62 1.00 0800 00000 00000 0800 0800 08 08 2.00 1300 00000 00000 1300 1300 13 13 3.00 0900 00000 00000 0900 0900 09 09 4.00 10 0850 00527 00167 0812 0888 08 09 6.00 1300 00000 00000 1300 1300 13 13 Total 30 1000 02197 00401 0918 1082 08 13 55 Duongkinhthan CT N Subset for alpha = 0.05 Duncana,b 4.00 10 2000 1.00 2000 2.00 2000 3.00 2000 6.00 2000 Sig 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed Chieucaocay CT N Subset for alpha = 0.05 3.00 3.4000 2.00 4.4000 4.4000 1.00 4.9000 Duncana,b 4.00 10 5.4000 6.00 5.4000 Sig .119 152 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed 56 Sola CT N Subset for alpha = 0.05 Duncana,b 3.00 4.2000 4.00 10 4.3000 2.00 4.4000 1.00 4.6000 6.00 4.6000 Sig .627 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed Chieudaila CT N Subset for alpha = 0.05 3.00 2.0000 1.00 2.2400 2.2400 2.00 2.3000 2.3000 Duncana,b 6.00 2.5400 4.00 10 2.5600 Sig .219 205 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed 57 Chieurongla CT N Subset for alpha = 0.05 Duncana,b 3.00 3000 4.00 10 4400 2.00 4800 6.00 5200 1.00 5400 Sig 1.000 076 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed Số rễ Duncana,b CT N 3.00 1.00 5 Subset for alpha = 0.05 2000 4000 4.00 10 4000 2.00 6000 6.00 6000 1.4000 Sig .364 053 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed 58 Chieudaire CT N Subset for alpha = 0.05 Duncana,b 3.00 0600 4.00 10 0800 1.00 1400 6.00 1600 2.00 2000 Sig .194 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed Trongluongtuoi CT N Subset for alpha = 0.05 2600 3050 3200 6.00 4.00 10 1.00 Duncana,b 3.00 4700 2.00 6200 Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed 59 Trongluong1cm CT N Subset for alpha = 0.05 Duncana,b 1.00 4.00 10 3.00 2.00 1300 6.00 1300 Sig .0800 0850 0900 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.556 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed 60 Descriptives N Mean Std Std 95% Minimum Maximum Deviation Error Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound Sore Chieudaire Khoiluongtuoi 1.00 8000 83666 37417 -.2389 1.8389 00 2.00 2.00 1.2000 83666 37417 1611 2.2389 00 2.00 3.00 8000 83666 37417 -.2389 1.8389 00 2.00 4.00 1.6000 54772 24495 9199 2.2801 1.00 2.00 5.00 1.0000 70711 31623 1220 1.8780 00 2.00 Total 25 1.0800 75939 15188 7665 1.3935 00 2.00 1.00 1200 13038 05831 -.0419 2819 00 30 2.00 2400 18166 08124 0144 4656 00 50 3.00 1400 13416 06000 -.0266 3066 00 30 4.00 3000 12247 05477 1479 4521 20 50 5.00 2000 12247 05477 0479 3521 00 30 Total 25 2000 14434 02887 1404 2596 00 50 1.00 3940 16334 07305 1912 5968 20 60 2.00 3720 14618 06538 1905 5535 25 60 3.00 3920 06611 02956 3099 4741 29 46 4.00 3960 14153 06329 2203 5717 27 56 5.00 3800 08396 03755 2757 4843 30 51 Total 25 3868 11550 02310 3391 4345 20 60 61 Sore Congthuc N Subset for alpha = 0.05 Duncana 1.00 8000 3.00 8000 5.00 1.0000 2.00 1.2000 4.00 1.6000 Sig .150 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Chieudaire Congthuc N Subset for alpha = 0.05 Duncana 1.00 1200 3.00 1400 5.00 2000 2.00 2400 4.00 3000 Sig .081 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 62 Khoiluongtuoi Congthuc N Subset for alpha = 0.05 Duncana 2.00 3720 5.00 3800 3.00 3920 1.00 3940 4.00 3960 Sig .790 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 63