2.1 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phan lập và định danh Phytophthora sp. gây bệnh nứt thân xì mủ
trên cây sầu riêng bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử.
Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế Phytopthora palmivora của dich chiết gừng với lá dịch chiết lá trầu không trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 05 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023.
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Được thực hiện tại phòng thí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnh học va Chân đoán),
Khoa Khoa học Sinh học và nhà màng thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học
Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2.3 Vật liệu thí nghiệm
2.3.1 Nguồn mẫu
Nguồn mẫu bệnh được thu trên vườn sầu riêng tại xã Tam Bình và xã Hội Xuân, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang.
2.3.2 Dụng cụ và thiết bị máy móc
Các trang thiết bi gồm: cân điện tử (PX OHAUS), bếp điện Sunhouse, dia petri, tủ cay vi sinh, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), may hap khử trùng (MC40L, ALP, Japan), 16 vi song, May lac Vortex ZX3 Velp, may ly tam HERMLE Z287A, may PCR (TurboCycler), hệ thống chụp gel UV, tủ âm -20°C, máy điện di.
2.3.3 Môi trường và hóa chat sử dụng Hóa chất sử dụng
Hóa chất phân lập: Ethanol 70%, Ethanol 96%, Methanol, kháng sinh
Chloramphenicol.
Ly trích DNA: dung dich đệm CTAB muối 2X (0.2g/1 CTAB, 0.02M Tris HCl
pH 7.5, NaCL 2M, EDTA 0.05M); PCI (Phenol - Chloroform - Isoamyl, 25:24:1);
Isopropanol; EtOH 70%; Lysis buffer; Chloroform; TE.
Thành phan PCR: Mytaq Mix 2X, nước cat, DNA, primer.
Ky thuat dién di: Agarose 1,5%, TBE 0,5X (Tris-Borate; EDTA; pH 8.0), 6XGelred DNA Loading buffer tricolor, Ladder 1Kb.
Phương pháp chuẩn bị một số môi trường cho quá trình phân lập
Môi trường WA (môi trường Water Agar): Dun sôi 500 mL nước cất, sau đó thêm vào 20 gram agar nấu cho đến khi tan hết agar và thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đủ 1000 mL. Hap khử trùng bằng nỗi hap ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phút sau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 mL dung dịch).
Môi trường PDA (môi trường Potato Dextrose Agar): 200 gram khoai tây đã lột
vỏ rửa sạch, thái nhỏ, nấu trong 500 mL nước cất cho đến khi khoai tây mềm, lọc bỏ bã, thêm 20 gram đường dextro và 20 gram agar vào nấu cho đến khi hoà tan hoàn toàn, thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đủ 1000 ml. Hap khử trùng bằng nồi hấp ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phút sau đó dé ra dia petri (mỗi đĩa 15 mL dung dich).
Môi trường PCA (môi trường Potato Carrot Agar): 20 gram khoai tay, 20 gram
cà rốt lột vỏ, rửa sạch thái nhỏ, nấu với 500 mL nước cất cho đến khi nguyên liệu mềm, lọc bỏ bã, thêm 20 gram agar vào nấu cho đến khi hoà tan hoàn toàn, thêm nước cất cho đến khi dung dich vừa đủ 1000 ml. Hap khử trùng bằng nồi hap ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phút sau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 mL dung dịch).
2.4 Phương pháp thí nghiệm
2.4.1 Nội dung 1: Phan lập và định danh Phytophthora sp. gầy bệnh nứt thần xì
mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử.
Phương pháp thu thập mẫu bệnh
Áp dụng phương pháp thu mẫu bệnh của Nguyễn Việt Trung (2021) được thực
hiện như sau:
Quá trình thu mẫu bệnh được tiến hành trên 2 vườn Sau Riêng Ri6 và vườn Sau Riêng Monthong có tuổi cây khoảng 10 năm thuộc dia phận xã Tam Bình và xã Hội Xuân, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang. Sầu Riêng được trồng với mật độ 145 cây/ha với khoảng cách trồng 8m x 8m. Tiến hành thu mau tại 2 vườn, mỗi vườn chon 3 cây sầu riêng có triệu chứng tiêu biéu cho bệnh nứt thân xì mủ, mỗi cây thu 5 mẫu bao gồm mẫu thân, mẫu đất, mẫu nước trong kênh mương và mẫu của tàn dư thực vật tại ví trí cây bị nhiễm bệnh, vườn được thu mẫu phải có thời gian cách ly thuốc ít nhất là 14 ngày.
Quan sát và chọn những cây sầu riêng đã có biểu hiện của triệu chứng bệnh nứt thân xì mủ. Phần thân cây chảy nhựa trên bề mặt vỏ thân, vết bệnh ướt và nhựa có màu nâu. Vỏ thân và gỗ bên dưới bị chuyên sang màu hồng nhạt có bớt tím, viền gon sóng, bệnh lan dần vào bó mạch. Khi cạo lớp vỏ bị bệnh ra thấy phần gỗ có màu nâu sam dọc
theo thân, cảnh.
Mẫu được thu thập cho vào túi nilon và ghi thông tin người lấy mẫu, ngày lấy mẫu, tên cây kí chủ, địa chỉ noi lay mẫu. tên mẫu bệnh, triệu chứng và dấu hiệu của bệnh cây. Tất cả mẫu bệnh thu thập được bảo quản giữ ẩm trước khi tiễn hành phân lập.
Phương pháp bảo quản mẫu bệnh
Áp dụng phương pháp quản lý thực vật của Roger Shivas và Dean Beasley (2005): Sử dụng túi giấy dé lay và giữ mẫu bệnh, gói mẫu cân thận tránh va đập và hơi nước ngưng tụ, dùng bút ghi chú thông tin mẫu thu được.
Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu mẫu bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng ở
tỉnh Tiên Giang
# i Mau
Maso Vị tri, địa diém . Vi tri thu `
. Giông bệnh/ Kí hiệu mầu bệnh vườn thu mầu mầu
vườn
TGI Xã Hội Xuân Monthong, Ri6 12 Thân HXT1 —HXT12
TG1 Xã Hội Xuân Ri6 2 Đất HXD1-HXD2
TGI Xã Hội Xuân Ri6 1 Nước HXNI
TG2 Xã Tam Binh Monthong, Ri6 12 Thân TBT1 —TBT12
TG2 Xa Tam Binh Monthong 2 Dat TBDI - TBD2
TG2 Xã Tam Binh Ri6 | Nước TBNI
Tên mẫu được đặt theo thứ tự: Tên xã lay mẫu — Vị trí thu mẫu. VD: HXT (Hội Xuân - Thân) Phương pháp phân lập nắm từ thân cây và tan dư thực vật
Áp dụng phương pháp của Burgess va cs (2009) cho việc phân lập nắm từ thân
được thực hiện như sau:
Phương pháp phân lập: Rửa sạch mẫu thân dưới vòi nước để loại bỏ đất và các vi sinh vật hoại sinh bám bên ngoài thân. Cắt thân thành những đoạn dài 2 cm tại phần ranh giới giữa mô bệnh va mô khoẻ. Khử trùng mẫu bang ethanol 70% trong 1 phút sau đó rửa lại bằng nước cắt vô trùng 4 lần rồi thắm khô bằng giấy thấm vô trùng. Cấy mẫu lên môi trường WA, sau khi cay xong nên đặt ngược đĩa petri dé tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy, tiếp đến đặt đĩa petri trong điều kiện nhiệt độ phòng (25°C — 28°C).
Khi các sợi nắm bắt đầu xuất hiện từ các mẫu cấy tiến hành cấy chuyền đỉnh sợi nắm lên môi trường PDA. Làm thuần mẫu nắm bằng cách tiếp tục cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nam.
Phương pháp phân lập tác nhân từ dat
Thu mau dat cách gốc sau riêng khoảng 50 — 100 cm, sâu 5 — 10 cm. Mau dat được lay ở 3 điểm của từng cây theo hình tam giác đều lay gốc cây làm trung tâm, sau
đó trộn đều thành một mẫu đất (01 mẫu/ cây). Mỗi vườn lấy 2 mẫu theo vị trí cây bị bệnh nứt thân xì mủ, mỗi mẫu 500g. Mẫu thu thập được ghi rõ các thông tin, gồm: ngày, địa điểm, tên chủ vườn, giống, tuổi cây, bộ phận bị hại, điều kiện đất đai và cuối cùng bảo quản mẫu.
Áp dụng theo phương pháp bay đất theo Burgess và es (2009) cho việc phân lập
nhóm tác nhân có khả năng phóng thích động bào tử như sau:
Cho mẫu đất đã thu thập vao thé thủy tinh có đường kính 15 cm đã được khử trùng bề mặt bằng cồn ethanol 70%. Cho nước cất vào thé thủy tinh cho đến khi nước ngập qua mẫu đất 5 cm. Tiến hành thả cánh hoa hồng đỏ kín mặt nước trong thố. Đặt thé ở vị trí tĩnh trong vòng 2 — 3 ngày. Tiến hành phân lập khi vết bệnh đã phát triển trên cánh hoa hồng.
Hình 2.1 Phân lập mẫu dat bằng phương phấp bay hoa hồng
Phương pháp phân lập: Rửa sạch cánh hoa hồng bằng nước cat vô trùng, cắt phần ranh giới giữa mô bị bệnh và mô khỏe trên cánh hoa. Khử trùng mẫu bằng ethanol 70%
trong 1 phút sau đó rửa bằng nước cất vô trùng 4 lần rồi thắm khô bằng giấy thấm vôtrùng. Cay mẫu lên môi trường WA, sau khi cấy xong nên đặt ngược đĩa petri dé tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy, tiếp đến đặt đĩa petri trong điều kiện nhiệt độ phòng ( 25°C — 28°C). Khi các sợi nấm bắt đầu xuất hiện từ các mẫu cay tién hanh cấy chuyền đỉnh sợi nam lên môi trường PDA. Làm thuần mẫu nam bang cách tiếp tục cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nam.
Phương pháp phân lập tác nhan từ nước
Mẫu nước được thu thập tại vị trí mà cây bị nhiễm bệnh (nhằm nâng cao khả năng xuất hiện của nắm). Áp dụng theo phương pháp của Nguyễn Ngọc Bảo Châu (2023) để tiễn hành.
Phương pháp phân lập: Môi trường PDA được hấp vô trùng trong nồi hấp ở 121°C, lay ra dé nguội đến 45 — 55°C, thêm kháng sinh penicillin hay streptomycin vào trong bình lắc đều cho đến khi hoa tan hết. Dùng pipette hút 100 — 120 pL (lắc đều mẫu nước trước đó). Nhỏ vào giữa đĩa petri có đường kính 90 mm, dùng que cấy gạt đều dung dịch trên bề mặt thạch, úp ngược dia petri và dé ở nhiệt độ phòng từ 5 — 7 ngày.
Sau đó nhận dang và cấy truyền sợi nam khả nghi là Phytophthora lên môi trường PDA và cay chuyền đỉnh sợi nam dé làm thuần.
Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch
Áp dụng phương pháp theo Burgress và cs (2009) tiến hành lây bệnh nhân tạo.
Được thực hiện trên cây sầu riêng, tiễn hành tạo vết thương hở sau đó cắt hạch nam lây nhiễm lên vết thương đã tạo ở trước đó.
Tiến hình trên 2 cây sầu riêng không bị nhiễm bệnh, trong đó cây sầu riêng được tạo 2 vết thương hở bao gồm: vị trí 1 với nước cất đã hấp khử trùng, vị trí 2 với nam Phytophthora sp. và vị trí 3 không tạo vết thương hở với nam Phytophthora sp. Lap lại
tương tự trên cây thứ 2, sau đó đặt trong nhà màng và theo dõi liên tục trong 15 ngày.
Các bước chủng Koch:
1. Dùng que cấy hoặc kim tiêm chọc vào phan thân dưới của cây được lây bệnh va gắn một miếng thạch nhỏ từ mẫu tác nhân gây bệnh đã làm thuần vào vị trí vết thương (hoặc tiêm một lượng nhỏ địch bào tử vào thân, dùng kim hoặc ống tiêm)
2. Dùng que cấy hoặc kim tiêm chọc vào phần thân dưới của cây đối chứng nhưng
không lây bệnh
3. Dùng parafilm hoặc màng nilon bọc vết thương hoặc vị trí lay bệnh.
4. Tưới âm cho đất mỗi ngày
5. Kiêm tra và so sánh cây được lây bệnh với cây đôi chứng. Quan sát va ghi nhận
các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát trên
đồng ruộng.
A: Dùng dao tạo vết thương trên thân; B: Lay nhiễm nam từ tác nhân đã được làm
thuần vào vét thương; C: Co định vét thương băng parafin
2.4.2 Định danh nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm
hình thái.
Nhận diện sơ bộ các dòng nam đã được phân lập thông qua đặc điểm hình thái sau khi phân lập, các mẫu nam được quan sát bằng mắt thường và kính hiển vi (Klich, 2002) về hình dạng tản nam, mau sắc bào tử, đặc điểm cơ quan sinh bào tử, hình dạng bào tử dé tiễn hành nhận diện sơ bộ.
Dựa trên các đặc điểm hình thái học của Phytophthora theo Wilson (1914), cách thức hình thành và hình thái của các bọc bao tir Phytophthora là tiêu chí thực tiễn cho việc giám định theo tài liệu tham khảo của Erwin và Ribeiro (1996) để tiến hành định danh nam Phytophthora.
2.4.3 Định danh nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng kĩ thuật sinh
học phan tử.
2.4.3.1 Ly trích DNA
Quy trình ly trích DNA nam bằng hóa chất được thực hiện theo phương pháp của Izumitsu va cs (2012) được tiến hành như sau:
1. Cao lấy sinh khối nam 0,1 — 0,5 gam sợi nam.
2. Hút 400 pl lysis buffer — nghiền bằng vortex trong 10 giây rồi ủ 65°C trong 60 phút (10 phút khuấy đều eppendorf 1 lần).
3. Bồ sung 300 pl PCL Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút.
4. Hút 300 pl dịch nổi và 100 ul Chloroform (3:1). Ly tâm 14 000 vòng/phút trong 5
phút.
5. Hút 200 yl dịch nổi. Hút 100 pl Isopropannol, lắc nhẹ. Ly tâm 14 000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ hoàn toàn dịch nồi.
6. Cho 480 pl EtOH 70% vào hỗn hợp. Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút > loại bỏ dich nồi (lặp lại 2 lần). Dé khô tự nhiên.
7. Pha loãng mẫu với 50 yl TE buffer. DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở - 20°C.
2.4.3.2 Phan ứng PCR
Các mẫu ly trích DNA của các dong nắm phân lập được khuếch đại bằng cách sử dụng các mồi được liệt kê trong Bảng 2.2. Thành phần của một phản ứng PCR (25 pL) bao gồm: 2 pL DNA tổng số (1 ng/uL), 12,5 wL 2x DreamTaq Red PCR MasterMix (Thermo Scientific Inc., Hoa Kỳ), 6,5 uL nước tinh khiết và 2 wL của mỗi mỗi (10 0M) (Apical Scientific, Malaysia).. Quá trình khuếch đại được thực hiện trong bộ tuần hoàn nhiệt có thê lập trình (Blue-Ray Biotech TuborCycler) sử dụng chương trình nhiệt như Bảng 2.3 và Bảng 2.4. Tất cả các phản ứng PCR đều được thực hiện trong quá trình nhân đôi. Các sản phẩm PCR được nhuộm với 6X Gelred DNA Loading trên gel điện di agarose
1,5% trong dung dịch đệm TBE 0,5X (Tris-Borate; EDTA; pH 8.0) ở 100V trong 25
phút ở nhiệt độ phòng và hiển thị dưới tia UV. Kích thước của các vùng DNA khuếch đại
được ước tính bằng cách so sánh với thang HyperLadderTM 1kb (Bioline, Meridian). San phẩm PCR được khuếch đại, sau đó được gửi đi tinh chế và giải trình tự tại Viện Công nghệ ADN và Phân tích di truyền (GENLAB), Hà Nội.
Bảng 2.2 Danh sách thông tin các primer sử dụng trong phản ứng PCR
` Môi
luc Trình tự môi Tài liệu tham khảo
Ben (Primer)
ITSI 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3' White va cs, 1990 ITS
ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' White và cs, 1990
GUPal16fw 5:.OTTCAGCTGTGGTDGGTATGATT4Z:' Mang ` acs,
GUP
GUPal8rv 5’-CATGCCGAAGCATACACAAG- 3’ Mes „ ae
Bang 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer ITS1/ ITS4
Chu kỳ Giai đoạn Nhiệt độ(°C) Thời gian
1 Tiền biến tính 95 5 phút Biến tính 95 30 giây 35 Bắt cặp 55 30 giây
Kéo đài 72 60 giây
| Hậu kéo đài 72 10 phút
Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer GUP
Chu kỳ Giai đoạn Nhiệt độ(°C) Thời gian
| Tiền biến tính 95 5 phút Biến tính 95 30 giây 35 Bắt cặp 52 30 giây
Kéo đài T3 30 giây
1 Hau kéo dai 72 7 phut
2.4.3.3 Phan tich phat sinh loai
Tất cả các trình tự được phân tích bang phần mềm Bioedit, và kiểm tra mức độ tương đồng của các dòng vi khuẩn này với các chủng đã được công bố trên cơ sở dit liệu GenBank bằng công cụ BLAST (http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) tiếp theo điều chỉnh thủ công sử dụng thông qua chương trình căn chỉnh ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Phan mém MEGA 11 (Kumar va cs, 2016) được sử dung dé xây dựng cây phat sinh loài với hệ số bootstrap 1000.
2.5 Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế Phytopthora palmivora của dịch chiết gừng với lá dịch chiết lá trầu không trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đơn yếu tô được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 dia petri, gồm: (NTI đến NTS:
thí nghiệm hiệu lực ức chế ở 5 mức nồng độ của dịch chiết, NT6 là nghiệm thức đối chứng (nước cất).
Bảng 2.5 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng đến sự phát triển đường kính tan nam Phytophthora palmivora.
Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (%)
NII Dịch chiêt gừng 0,5
NT2 Dịch chiết gừng 1,0 NT3 Dịch chiết gừng 3 NT4 Dịch chiết gừng 2,0 NTS Dich chiét gimg 85 NT6 Nước cất 0
Bảng 2.6 Thí nghiệm: Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết lá trầu không đến sự phát triển đường kính tan nam Phytophthora palmivora.
Nghiệm thức Hoạt chất Nong độ (%)
NII Dịch chiét lá trâu không 0,2
NT2 Dich chiết lá trầu không 0,4 NT3 Dịch chiết lá trau không 0,6 NT4 Dịch chiết lá trau không 0,8 NT5 Dịch chiết lá trau không 1,0 NT6 Nước cất 0
Bảng 2.7 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của hỗn hợp dịch chiết gừng và dịch chiết lá trầu không đến sự phát trién đường kính tản nam Phytophthora palmivora.
Nghiệm thức Hoạt chất Nong độ (%)
NTI Hỗn hợp dịch chiết 0,3 NT2 Hỗn hợp dịch chiết 0,6 NT3 Hỗn hợp dịch chiết 0,9 NT4 Hỗn hợp dịch chiết 1,2 NT5 Hỗn hop dich chiết 1,5 NT6 Nước cat 0
2.5.2 Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị dịch chiết:
Ging tươi là loại gừng củ nhỏ, gừng được thu vườn thuộc xã Tân Thuận Bình,
huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Gừng già tươi được thu hoạch từ tháng thứ 7 đến tháng thứ 8 tính từ thời điểm trồng, được sử dụng dé làm thí nghiệm. Gừng thu được phải còn nguyên vẹn, không bị đập hay thối hỏng.
Lá trầu không được trực tiếp thu tại vườn trầu thuộc xã Ea Tiêu, huyện Cư Kuin, tỉnh Đăk Lăk và được định danh bằng cách tham chiếu với tài liệu tham khảo (Shukla,
R., 2015). Thu lá bánh tẻ, lành lặn không bị sâu. Thu lá sạch vào những ngày khô ráo, khoảng từ 7 — 10 giờ sáng.
Thu nhận dịch chiết:
Các hoạt chất kháng nắm của củ gừng và lá trầu không được chiết xuất bằng dung
môi methanol.
Nguyên liệu gừng va lá trầu không thu về được rửa sạch loại bỏ bụi ban, dé ráo.
Nguyên liệu được cắt nhỏ, phơi khô và nghiền thành bột ở dạng riêng rẽ. Bột (1kg) được ngâm với 5 lít ethanol 90° ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó hỗn hợp bột được lọc lay dịch chiết, cuối cùng dịch chiết được loại dung môi bằng máy cô quay dé thu cao