Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết gừng và thuốc dòi đối với nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt ở tỉnh Tiền Giang trong điều kiện phòng thí nghiệm

gây bệnh than thư trên cây ớt tại tỉnh Tiền Giang trong điều kiệnphòng thí nghiệm” được thực hiện từ tháng 08 năm 2023 đến tháng 05 năm 2024 tạiphòng thí nghiệm Bệnh học và Chân đoán, Kh

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM TP HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

3k ‡k 3k 2s 3k 2 2s

KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG UC CHE CUA DỊCH CHIET GUNG VATHUOC DOI DOI VOI NAM Colletotrichum spp GAY BENH THAN THU’TREN CAY OT O TỈNH TIEN GIANG TRONG DIEU KIEN PHÒNG THÍ

NGHIEM

NGANH: BAO VE THUC VAT

KHOA : 2019 — 2023SINH VIEN THUC HIEN: NGUYEN HOAI VU

Thành phó Hồ Chi Minh tháng 05 năm 2024

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG UC CHE CUA DỊCH CHIET GUNG VÀ THUOCDOI DOI VOI NAM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THAN THU TREN

CAY OT O TINH TIEN GIANG TRONG DIEU KIEN PHONG THI

HỘI ĐÔNG HƯỚNG DẪN PGS.TS NGUYEN BAO QUOC

PGS.TS NGUYEN NGOC BAO CHAU

LỜI CẢM ƠNCon xin khắc ghi công ơn to lớn đã sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ Cảm ơncha mẹ và những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con, là

nguồn động lực dé cho con có thé vượt qua mọi khó khăn, vấp ngã và có được như ngày

hôm nay.

Tôi xin gửi những lời kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất đến quý thầy cô

khoa Nông học - Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh đã tận tình truyềnđạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, luôn tạo điều kiện quan tâm, giúp đỡ vàrèn luyện trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện khoá

luận.

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc vàPGS.TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu cùng với đó là KS Nguyễn Thị Phụng Kiều đã tậntình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệmquý báu trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Bên cạnh đó tôi không quên gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Mai Nghiệp, cácanh chi và các ban tại phòng thí nghiệm Bệnh học va Chuẩn đoán thuộc khoa Công nghệSinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn hỗ trợ và giúp

đỡ tôi hoàn hoàn thành khoá luận.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thê lớp DH19BV đã cùng tôi đồng hành,gắn bó trong suốt 4 năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hỗ Chí Minh

Trân trọng cam ơn !

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 02 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hoài Vũ

TÓM TAT

Đề tài ”Đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết gừng và thuốc doi đối với nắmColletotrichum spp gây bệnh than thư trên cây ớt tại tỉnh Tiền Giang trong điều kiệnphòng thí nghiệm” được thực hiện từ tháng 08 năm 2023 đến tháng 05 năm 2024 tạiphòng thí nghiệm Bệnh học và Chân đoán, Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại họcNông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh, với mục tiêu: Tìm ra nồng độ ức chế tối thiểu củadịch chiết gừng, thuốc dòi và hỗn hợp dịch chiết gừng — thuốc doi đến sự phát triển của

tác nhân gây thán thư trên cây ớt tại tỉnh Tiền Giang

Nội dung 1: Kết quả phân lập từ 18 mẫu bệnh từ các mẫu trái bệnh được thu tại

vườn trồng ớt thuộc xã Tân Thảnh và Tăng Hoà, huyện Gò Công Đông, tỉnh Tiền Giang

cho kết quả thu được 10 mẫu Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên cây ớt Dinh

danh được các mẫu nắm qua đặc điểm hình thái bào tử, giác bám cho thấy tác nhân gâybệnh than thư trên ớt là Collefotrichum spp.

Nội dung 2: Đánh giá hiệu lực ức chế của 3 loại dịch chiết đối với tác nhân gâybệnh thán thư trên ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm trên môi trường PDA đã cho

thấy tại các mức nồng độ dịch chiết càng cao thì khả năng phát triển của nắm càng thấp

so với nghiệm thức đối chứng sau 15 ngày theo dõi đối với nam Colletotrichum spp.Dịch chiết gừng cho hiệu lực ức chế nắm Colletotrichum spp đạt 100% từ mức nồng độ10,0% Trong khi đó, dich chiết thuốc doi cho hiệu lực ức chế hoàn toàn đạt 100% tại

mức nồng độ 11,0% Khi phối trộn hỗn hợp dịch chiết gừng — thuốc dòi theo tỉ lệ 1:1 ởmức nồng độ 10,0% đạt hiệu lực ức chế là 100%

Đánh giá hiệu lực ức chế của 3 loại dịch chiết đối với sự nảy mam của nấm

Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm trên môi

trường PDA đã cho thấy tại các mức nồng độ dịch chiết càng cao thì khả năng nảy mầm

của bao tử nam càng thấp so với nghiệm thức đối chứng sau 24 GSC Dịch chiết gừng

cho hiệu lực ức chế sự nảy mầm bao tử nam Colletotrichum spp đạt 94.1% ở mức nồng

độ 8,0% Trong khi đó, dịch chiết thuốc đòi cho hiệu lực ức chế sự nảy mầm bào tử nắmColletotrichum spp đạt 82.5% tại mức nồng độ 9,0% Khi phối trộn hỗn hợp dịch chiết

gừng — thuốc doi theo tỉ lệ 1:1 ở mức nồng độ 8,0% đạt hiệu lực ức chế sự nảy mam bào

tử nam Colletotrichum spp là 84,4%

Từ các kết qua thí nghiệm của ba loại dich chiết đối với nắm Colletotrichum spp.

gây bệnh thán thư trên ớt cho thấy dịch chiết đừng và thuốc dòi có khả năng ức chế nắm

bệnh có hiệu quả.

MỤC LỤC

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHE CUA DỊCH CHIẾT GUNG VÀ THUỐC,

DOI DOI VỚI NAM Colletotrichum spp GAY BỆNH THAN THU TREN CAY

OT O TINH TIEN GIANG TRONG DIEU KIEN PHONG THÍ NGHIỆM 1

TOT CẮM OU sscxcssesscancmcsrcassmesresnansnnesoetcas nest SARASOTA 1

oC, gaÿeaaaaadrtorrronootaarortotoirto090 006600 58G001000219300t18000300ãn0nG 2DANH SÁCH CAC B— NỔ ueeseedreennsrddieoneilibrsetttitorgtitsesssgEertofexenrflstsrerthiEeri 9

DANH SÁCH CÁC HINH 2- <5 5< ©S£©s£S<£S£Ex£S£xeCeererserxersrsersrrscee 11

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT 5< s<s£©s©s£+s£tsetsezsezsersecse 12

OU 000500 nSNgyyớygg ` 8

Đặt vấn AG: oooecccccecccceccccecscsscscssescsessesvsvsscsvsucevsveacsvsssavsveseevsueacsvessevsveesevsusevevseseveseveveseess 8Mục tiêu dé taie cecceccccccccccesccsesecevscecsececsesececsvsecsvssecsvsssevsueevsvessevsseseveseevsvsesevstseveveeeees 9YOU CAU AE 8:5 9

fiJ8 0G 9

COON GD scccssssssensensssessesesssexsonsssenssvasansusesawesesvanconecusconssansonsssnasaseusesessssanseewessseseevousesss 10(VS We e5 10

1.2.2.3 Dac điểm hình thái - 2 2SE2222E22E2E12E22121121221211212121121 112 xe 14Hình 1.2 Hình thái của các chủng nắm Colletotrichum khi được cấy trên đĩa peri vàquan sát đưới kinh hiển Vi - 2: 22©222S%22E22EE22E22E1223223122123122122112212212211 22122 ee 15

1224 Qua trìnhphátsinh Đếnh,sssssserssrnniiiairiiitiittiiibiiiadtlroitgilfiogfpiellpgtkiiaae 15

Hình 1.3 Triệu chứng bệnh than thư trên qua ớt do nam Colletotrichum Spp 16

LD DS “Wig Gil cteencaneereeuninoeercuserers stores rine seal ceramic cramniaeacmine ae 17

Hình 1.4 Vòng đời của Colletotrichum Spp :csccsccsceeceeeeseeseeseeseeeeeeeeeeeeseeeeseeseeseess 17

1.3 Tổng quan về địch chiết thực vật -¿- + s+2z+E2£E2E2E2EEEE2E2EeExerrkrree 181.85 Khiinimrtôflbù:rldthfliYẨtuesssssnnnaenmsenanesatnnnuednrnnuuioesse 181.2.3 Mộtsố nghiên cứu về sử dụng dịch chiết thực vật 2 scs+cz+sccz 181.2.3.1 Dịch chiết gừng (Zingiber officinale) -. 22©722522522csc>zscsscse2 181.2.3.2 Dịch chiết cây thuốc doi (Pouzolzia zeylanica L.) . -2 5- 19

CHHUH Ð5 guợnggggi1800115055080031G01223066Eã6535ĐG1RSSSRRASG§kSiS88892G80338368348003930S.SSGTEISSEREIĐGEEEHS 21

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP THÍ NGHIEM -5-<2 212.1 _ Thời gian và địa điểm thí nghiệm 2 2©22+22E£2E22E22EE2Ez2Ezz2zzzzzze2 21

đu DOL ðIARLfiĐHIGR-GWDlseessssesdessnnddsobodieisbisbsbtliivdtSSdfDiS3436590920808083680980-1230% 21

2.12 Địađiểm nghiên cứu SSeSSece eerrrx.ree 212.1.3 Nội dung nghiên cứu đề tài 2-22 22222S222E22EE22EE22EESEEEeEErrrrrrrrrcrer 21

22 Đối tượng va vật liệu nghiên CỨU - - 2122 1S vn nh ngư 212.2.1 Nguồn mẫu 222222222222222221222122127112212212211221 221211212 cre 21

2.2.2 Vat liệu thí nghiệm và môi trường thí nghiệm - 55+ <+55<=5+ ĐI

23; Phượng pháp thi nghiỆNMsxseeesseoosoesonrsssatrrrnndintidltrisdttspudongeuas 23

2.3.1 Phân lập và định danh Colletotrichum spp Gây bệnh than thư trên ớt bằng đặcOSIM) ee a ssbioiitre:S00iE0- 85 22 2.3.1.1 Phuong pháp thu thập mẫu bệnh -+-2+©22©5+2++2++zxzzxzrxsrxee 22

Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vi tri thu thập mẫu bệnh than thư trên ớt ở tỉnh Tiền Giang

G901 ẽằằ 23

2.3.1.2 Phương pháp phân lập nam từ mau bệnh - 22 ¿2252252 23

2.3.1.3 Định danh nắm Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt bằng đặc điểm

HH1TTHSEHI eee Ree eee en ee ee eee ee ee ae 24

2.3.2 Đánh giá kha năng ức chế của dịch chiết gừng và dịch chiết cây thuốc dòi đến

sự phát triển của nấm CoijefofrieliI1n SP . -. 5:©22-552552252255222+222z22+zcs>sz+ 242.3.2.1 Chuẩn bị dịch chiết: -©522522ES2E22E22E1221221211211211211211 2112212 xe 24

2.3.2.2 Xác định anh hưởng của dịch chiết đến sự phát triển đường kính của tản nam

Bảng 2.2 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng đến sự phát triển

đường kính tan nâm Colletotrichum SỤ - - 5-55 55<+<+<c+ec+ecsersereeres 26

Bảng 2.3 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết cây thuốc dòi đến sự

phát triên đường kính tan nam Colletotrichum spp .- - - 26

Bảng 2.4 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết hỗn hợp gừng và dịch

chiét cây thuôc doi đên sự phát triên đường kính tan nam Colletotrichum spp.

icici cafe creeds ene eel 57

2.3.2.2 Xác định ảnh hưởng của dịch chiết đến sự sự nảy mam của bao tử nắm

Phuong phap tién hanh 8 28Chương 5 KET QUA VA THAO LUIẬN senseseenudaannesntatniogianiontioigtsiisbssgseskk 303.1 Phan lập nam gây bệnh than thư trên ớt -2- 2 ©22222+2++2z+zz+zzszzc+2 30

3.1.1 Qua trình thu thập mẫu bệnh - 2 2 ¿22+22+2E+2EzE2E+zE+zz+zz+zzxzsez 30

Hình 3.1 Tiến hành thu trái có triệu chứng bệnh 2-2 2+2s+EE+EE+EE+£++£E+zxzzxzzxee 30

Hình 3.2 Mẫu trái bệnh thu thập được -+- ¿2 2222 2E+2E+E22E£EE2EZEeEE2Ezxcrxerrzkd 31

3.1.2 Qua ái 00 0017 31

Hình 3.3 Mẫu nam phân lập được từ mẫu trái ớt bệnh 2 2 22+2zz2zz=2+2 32

3.2 Định danh nam gây bệnh than thư trên ớt tại tỉnh Tiền Giang 32

3.2.1 Định danh nam gây bệnh than thư dựa vào hình thái bào tử của các mẫu nam

BNANi.13TTssss-sesieszersrssisrbotzztsogi0itoiBi0ii066258Ei4028805/38.3g850280238/58101đ95.G5%04gã235i88ã.560852/G138/83G.38i2507Gi003 35.183138 32

Hình 3.4 Nam Colletotrichum sp (mẫu TTS) sau khi được phân lập từ mẫu trái bệnh32

Bảng 3.1: Số mẫu nắm Colletotrichum spp phân lập được từ 2 vườn ớt ở tỉnh Tiền Giang

Se ni ềẽẸềềẽẶẽằẽ 33

3.2.2 Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch . : -: -33Hình 3.5 Kết quả lây bệnh nhân tạo trên trái ớt (mẫu TT5) - 2+5 =zzsz5+2 34Hình 3.6 Tiến hành tái phân lập nắm Colletotrichum Spp -: 2-52-5525552- 35

3 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng và dịch chiết thuốc doi đốivới đường kính tan nam Colletotrichum Spp - - 55+ +52 <5+<<+£++£seseesecee 353.3.1 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng đối với Colletotrichum

ST isaac sn sides Sens ete iiss oS avis aS 35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của dich chiết gừng đến sự phát triển đường kính tản nam

Colletotrichum spp ở thời điểm 15 ngày sau cấy 2¿©2¿2222222z22zszxczscee 37

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết gừng đến đường kính Colletotrichum

spp nuôi cây trên môi trường PDA qua các thời diém theo dõi (mm) 37

Bang 3.3 Hiệu lực ức chế (%) Colletotrichum spp của dịch chiết gừng ở các nồng độ khác

THỂ Ú ess sens gã Ha g1 tổn lạ Si333353313/88i Sãghig4Hi3i4S1355S3iBipgtiiSGESkã3gis58ASEGE4381S4EES0LE3S388 88858 38

3.3.2 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết thuốc doi đối với nam Colletotrichum

SPD 39

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết thuốc dòi đến đường kính Collefofrichum

spp nuôi cấy trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi (mm) 40 40

Hình 3.8 Ảnh hưởng của dịch chiết thuốc doi đến sự phát triển đường kính tản nam vớiColletotrichum spp ở thời điềm 15 ngày sau cấy -2-52-5222222222zcczxcrrree 40

Bảng 3.5 Hiệu lực ức chế (%) Colletotrichum spp của dịch chiết thuốc đòi ở các nồng

dO: KhiaG MAU suateiensesise98E0032803En0080k6kug025610a65xp4s0ttzlpntttiagltosfgrli6sxf6gttucbgaifsgicicbEsitssioul 41

3.3.3 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của hỗn hợp dịch chiết gừng và thuốc dòi đốiVOL CONGIOWICHUIN SDD sua ta stnáo AgtGãaGU4khôRöš nha GuŸ giãn đgãtkosEBi4oJagil Raman ER ame een! 41

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp dịch chiết gừng và thuốc dòi đến đường

kính tản nắm Colletotrichum spp nuôi cay trên môi trường PDA qua các thời điểm Iise 080 1 42

Hình 3.9 Ảnh hưởng của hỗn hợp dịch chiết gừng và thuốc dòi theo tỉ lệ 1:1 đến sự

phát triển đường kin tản nắm Colletotrichum spp ở thời điểm 15 ngày sau cấy 42

vii

Bang 3.7 Hiệu lực ức chế (%) Colletotrichum spp của hỗn hợp dịch chiết gừng và

thuôc doi ở các nông độ khác nhau - - 55 2222 *+2*£+2++szezeerrersxrs 43

3.4 Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng và dịch chiết thuốc dòi đối

với sự nảy mầm bào tử nắm Colletotrichum spp . 2-52-52-525225s25zz5sc5sz5se2 43Bảng 3.8 Hiệu lực ức chế (%) sự nảy mầm bào tử Colletotrichum spp của dịch chiết

gừng ở các nông độ khác nhau - 255-2222 *2+E*+zE£+EEreErrrrrrerrrrrrerrxre 44

Bảng 3.9 Hiệu lực ức chế (%) sự nảy mam bào tử Colletotrichum spp của dịch chiết

thuốc đôi ở các nông độ khác nÏaU‹««sec-cxssscsccsbevcoESE000210306000883 00-4030 3810666 45

Bang 3.10 Hiệu lực ức chế (%) sự nảy mam bào tử Colletotrichum spp của dich chiết

gừng và thuôc doi ở các nông độ khác nhau 55-55 5<=++<<+ss>+ 45Hình 3.10 Ảnh hưởng của địch chiết đến sự nảy mam bào tử nam Colletotrichum spp

„TL a ẶằẶẰƒ{ŸÏ{Ÿ<—=— —-Ằằ-Ặ 46Hình 3.11 Ảnh hưởng của dịch chiết đến sự nảy mầm bao tử nam Colletotrichum spp.tại thời điểm 24 GSC ¿2222 21221221211211211211211211 2112112112122 21c crrrye 47

KẾT LUẬN XÃ BÉ NGI LeeenenneoeiniGuiiietiusttg0010136G10161348040686036E6051080g16136838Ẻ 49ATT sere ncemamemenenuanenest 51

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu thập mẫu bệnh thán thư trên ớt ở tỉnh Tiền Giang

Bảng 2.2 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng đến sự phát triển

đường kính tản nam Colletotrichum spp . 5 22©22-552©22222222222+22E222222E2E2zxczzcce 26

Bảng 2.3 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết cây thuốc dòi đến sựphát triển đường kính tản nắm Colletotrichum Sp -2-52-52-52525225sz5sz5s55+2 26

Bảng 2.4 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết hỗn hợp gừng và dịch

chiết cây thuốc doi đến sự phát triển đường kính tan nắm Colletotrichum spp 27Bang 3.1: S6 mau nắm Colletotrichum spp phân lập được từ 2 vườn ớt ở tỉnh Tiền Giang

SA 6 Ốc Sse apriciion 33

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết gừng đến đường kính Colletotrichum spp.nuôi cấy trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi (mm) - 37Bảng 3.3 Hiệu lực ức chế (%) Colletotrichum spp của dịch chiết gừng ở các nồng độ khác

TE ce tipittUGHECLUAGEIGEVGIUENOEGGERHRMDDEERGEDINHGHREENEHEEEEISUVEGRNBIVERSENUANOINENEEHNHNSUPNRSESEOsnR 38

Bảng 3.4 Anh hưởng của nồng độ dich chiết thuốc doi đến đường kính Colletotrichumspp nuôi cấy trên môi trường PDA qua các thời điểm theo đối (mm) - 40Bang 3.5 Hiệu lực ức chế (%) Colletotrichum spp của dịch chiết thuốc doi ở các nồng

AO 4ị7:108i):/10 0 80:1 41Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp dịch chiết gừng và thuốc dòi đến đường kính

tan nam Colletotrichum spp nuôi cay trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi (mm)

Bang 3.7 Hiệu lực ức chế (%) Colletotrichum spp của hỗn hợp dịch chiết gừng và thuốcdoi ở các nồng độ khác nhau -2- 2-2 22 SS+SE+SE+SE£EE£EE£EE2EE£EEEEEEEE2EE22E22E22222zxee 43

Bảng 3.8 Hiệu lực ức chế (%) sự nay mam bào tử Colletotrichum spp của dịch chiếtgửng cáo đồng đồ khác HN, õ e2 HH HH đM2H,H030 LH 30 H000210002100Lc6 46 6 44

Bảng 3.9 Hiệu lực ức chế (%) sự nảy mầm bào tử Colletotrichum spp của dịch chiết

thuốc doi ở các nồng độ khác nhau 22 22©222E22EE+2EE22EE22EE222E222E222122222222-e 45

Bảng 3.10 Hiệu lực ức chế (%) sự nảy mầm bào tử Colletotrichum spp của dịch chiếtgừng và thuốc đòi ở các nồng độ khác nhau 22 22 2+22+2E+EE+EE+£E+£E+zEzzxzxez 45

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Colletotrichum spp gây hại trên một số cây trồng 2 2- 5525525522 14

Hình 1.2 Hình thái của các chủng nấm Colletotrichum khi được cấy trên đĩa peri vàtữan sắt đưới Ícinh hiểu wi c-s~ce re che E227 470,40 2320 .ccicrcyxcrzce li»Hình 1.3 Triệu chứng bệnh than thư trên quả ớt do nắm Colletotrichum Spp 16Hình 1.4 Vong đời của Colletotrichum spp :ccccsccccecceceeseeseeeceseeeceeeeeseeeseeeeeeeeeeeees 17Hình 3.1 Tiến hành thu trái có triệu CHỮ; BỂTHÌT nuaggnttstttdiditdtibittipttiigiiSN4L038 001003338 30

Hình 3.2 Mẫu trái bệnh thu thập được - ¿2 222 +2+22E2E£EE2EE2E£EEzEzErzxzrxzxrree 31

Hình 3.3 Mẫu nam phân lập được từ mẫu trái ớt bệnh -2- 2 22 s+zz+zz+z+zzz+2 32Hình 3.4 Nam Colletotrichum spp sau khi được phân lập từ mẫu trái bệnh 32Hình 3.5 Kết qua lây bệnh nhân tạo trên trái ớt -2 22©22+22+22222++2zz+zz+zxzzse2 34Hình 3.6 Tiến hành tái phân lập nắm Colletotrichum spp -2 52©5252z5522 35Hình 3.7 Ảnh hưởng của dịch chiết gừng đến sự phát triển đường kính tan nam

Colletotrichum spp ở thời điểm 15 ngày sau cấy -222222222222222cEcrxsree 37Hình 3.8 Ảnh hưởng của dịch chiết thuốc doi đến sự phát triển đường kính tản nam vớiColletotrichum spp ở thời điềm 15 ngày sau cấy -2-52-22222222222czxccrvee 40Hình 3.9 Ảnh hưởng của hỗn hợp dịch chiết gừng và thuốc dòi theo tỉ lệ 1:1 đến sựphát triển đường kín tan nam Colletotrichum spp ở thời điểm 15 ngày sau cấy 42Hình 3.10 Ảnh hưởng của dịch chiết đến sự nảy mam bào tử nam Colletotrichum spp

tí EU di FT Gneesdennreoaotgpoosgiogi00000050868010010400000909088.035t0x0 sngl 46Hình 3.11 Ảnh hưởng của dịch chiết đến sự nảy mầm bao tử nấm Colletotrichum spp.tại thời điểm 24 GSC - + 222 2121121221211212112112111211211121121112112111211 21210 re 47

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

: Potato Dextro Agar

: Phó giáo sư, Tiến sĩ

: Water Agar

: Lần lặp lại: Giờ sau cay

: Ngày sau cay

xii

GIỚI THIỆUĐặt vấn đề:

Cây ớt cay (Capsium annum L.) thuộc họ Cà (Solanaceae), là cây gia vi thân

thảo, thân dưới hóa gỗ, là cây rau quan trọng và được sử dụng phổ biến trên thế giới.Trong ớt có các loại vitamin A, C, D, các chất khoáng Ca, Fe, Na, P,S và một số loại

axit amin (Thiamin, axit Oxalic, Riboflamin ); ngoai ra, quả ớt còn chứa protein và

chất béo (Cannon và cs., 2000) Trong quả ớt còn chứa một lượng Capsaicin là một loại

alcaloid có vi cay, gây cảm giác ngon miệng khi ăn, kích thích quá trình tiêu hoá, hoạt

chat này giúp cơ thé có thé ngăn cản sự hình các cục máu đông, ngoài ra người ta còn

chứng minh vai trò của ớt ngăn cản các chất gây ung thư (Mai Thị Phương Anh, 1999)

Cây ớt là môt cây có giá trị kinh tế cao ở cả thị trường trong nước và xuất khẩu,được trồng rộng rãi trên cả nước, trong đó miền Trung và Nam Bộ là hai khu vực sảnxuất ớt chính Năm 2021 ở Việt Nam, tổng diện tích ớt trồng khoảng 67.654 ha, sảnlượng ớt khô khoảng 1,5 tan/ha (FAOSTAT, 2021) Tuy giá trị cao nhưng van dé gây can

trở không nhỏ đến năng suất và chất lượng ớt là một số dịch bệnh do nam, virus va vi

khuẩn Trong các loại bệnh hại cây ớt thì bệnh do nắm là những loại bệnh gây hại nặng

nề nhất và làm ton thất 10-80% sản lượng ớt trên thế giới Bệnh than thư do namColletotrichum spp Gây ra là loại bệnh gây hại nghiêm trong và phô biến nhất trên cây

ớt Bệnh thán thư có thê lây nhiễm gây hại từ giai đoạn cây con đến giai đoạn trái gây

mat giá trị thương phẩm sau thu hoạch Than thư hại ớt làm giảm chất lượng ớt, giảm

trọng lượng khô, hàm lượng capsaicin và oleoresin trong qua ớt (Mistry và cs, 2010).

Các biện pháp phòng trừ bệnh do nam trên ớt hiện nay thường là dùng các chế phâmbảo vệ thực vật có nguồn gốc hoá học có tính độc hai, không an toàn cho sức khoẻ người

dùng Ngoài ra biện pháp sử dụng giống kháng bệnh cũng được dùng nhưng còn hạnchế do năng suất và tính ôn định của giống không cao Việc sử dụng thuốc hóa học liêntục dé phòng bệnh sẽ làm mầm bệnh dễ hình thành tính kháng, dé phát sinh noi mới vàgây ô nhiễm môi trường đo dư lượng thuốc hóa học để lại trong quá trình sử dụng (Trần

Văn Hai, 2009).

Chế phẩm sinh học là một trong những biện pháp ngăn ngừa sự phát triển củamột số loại bệnh, giảm thiểu tác động xấu của thuốc bảo vệ thực vật hoá học có nguồn

gốc hoá học đến môi trường và cộng đồng Ngoài ra, việc sản xuất nộng nghiệp sạch,chất lượng, an toàn, thân thiện với môi trường cũng là một vấn đề luôn được đặt sự quan

tâm hàng đầu Các nghiên cứu về dịch chiết gừng và thuốc đòi về việc ức chế nắm khuẩn

gây hại cho cây trồng cũng đã cho thấy hiệu quả khá tốt và có tiềm năng lớn để phát

triển Trên cơ sở đó, đề tài:”Đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết gừng và thuốcdoi đối với nắm Colletotrichum spp Gây bệnh than thư trên cây ớt tại tỉnh Tiền

Giang trong điều kiện phòng thí nghiệm” được thực hiện

Mục tiêu đề tài

Phan lập nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt và đánh giá hiệu lực

ức chế của dịch chiết sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm

Yêu cầu đề tài

Phân lập được nắm gây bệnh bệnh thán thư trên ớt ở tỉnh Tiền Giang

Định danh được nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt bang đặcđiểm hình thái

Đánh giá được khả năng ức chế của dịch chiết sinh học đến sự phát triển của tản

Đánh giá sự ảnh hưởng của dịch chiết đến sự nảy mầm bào tử nắm ở các nồng độ

khảo sát.

Giới hạn đề tài

Thí nghiệm chỉ được tiễn hành với 2 loại dịch chiết thực vật là dịch chiết gừng

và thuốc doi Nguồn mẫu bệnh được thu tại 2 xã Tân Thanh va xã Tăng Hoà tại huyện

Gò Công Đông, tỉnh Tiền Giang

Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2023 đến tháng 02/2024 trong phạm vi phòng

thí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnh học va Chân đoán), Khoa Công nghệ học Sinh học,trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Cây ớt có nguồn gốc từ Mexico, miền Trung và Nam của châu Mỹ (Mai Thị

Phương Anh, 1999) Thế ky XVI, ớt được Christopher Columbus du nhập vào Tây BanNha năm 1493 Từ Mexico, Tây Ban Nha các thương lái đã nhanh chóng chuyên ớt qua

Ấn Độ, Philippines và sau đó là Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản với sự trợ giúp của

các thủy thủ châu Âu Gia vị mới này đã nhanh chóng được sử dụng trong chế biến thức

ăn của các quốc gia nảy (Urig, 2015) Nhờ các nhà buôn và thủy thủ người Tây Ban Nha

và Bồ Đào Nha mà cây ớt đã dần được phân bố khắp thế giới Khả năng phân bố rộngcủa cây ớt một phần cũng nhờ khả năng thích ứng khí hậu khá tốt của loài này (Tripodi

& Kumar, 2019).

Vị trí phân loại:

Cây ớt thuộc bộ Solanaes, họ ca Solanaceae, chi Capsicum L Và có khoảng 27 loài với tên khoa học Capsicum spp Theo Tong và Bosland (1999), chi Capsicum có

khoảng 20 — 27 loài hoang dai được biết đến và 5 loài được thuần hóa bao gồm:

Capsicum annuum L., Capsicum frutescens L., Capsicum chinense Jacq., Capsicum

pubescens Keep, Capsicum baccatum L Trong số 5 loài Capsicum được trồng,Capsicum annuum L Là một trong những loài được trồng nhiều nhất với hơn 1,5 triệu

ha diện tích đất trồng trên toàn thé giới (Akbar va cs, 2010), kế tiếp là Capsicumfrutescens L Ot Capsicum frutescens Keep có quả nhỏ và rat cay, nó được trồng phốbiến rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Các loài còn lại chỉ hạn chế ở Nam

và Trung Mỹ.

1.1.2 Tình hình sản xuất ớt tại Việt Nam:

Ở Việt Nam, cây ớt được trồng từ lâu đời và được xem là một cây trồng có giá trị

trong nhóm cây rau Từ năm 2010 trở lại đây, cây ớt đã phát triển rộng rãi ở hầu khắpcác vùng trong cả nước Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2018), trong gần 10 năm

trở lại đây diện tích, năng suất, sản lượng ớt của cả nước có xu hướng tăng dần Năm

2009, điện tích trồng ớt của cả nước là 9.280 ha, sản lượng đạt 90,39 nghìn tan, đến năm

2017 diện tích trồng ớt của cả nước đã tăng hơn gần 5 lần về diện tích và 6 lần về sảnlượng so với năm 2009 với diện tích đạt 43.807 ha, sản lượng 579,92 nghìn tan Bêncạnh việc gia tăng nhanh chóng về diện tích, năng suất cây ớt của cả nước cũng tăng lênđáng kể va gần tiệm cận với năng suất bình quân của thé giới Năm 2009, năng suất ớt

của nước ta chỉ đạt trung bình 9,7 tan/ha, đến năm 2017 năng suất trung bình đã đạt 13,2

tan/ha

Năm 2007, Trung Quốc, Singapores, An Độ là những thị trường nhập khâu ớtchủ yếu của nước ta Giá nhập khẩu ớt khô của nước ta tăng rất mạnh, nhập khâu sangthị trường Trung Quốc từ 1800 — 3280 USD/tan, nhập sang thị trường Singapores và An

Độ khoảng 350 USD/tan (Nguyễn Phúc, 2008) Theo FAOSTAT (2021), sản lượng ớtkhô của Việt Nam trong năm 2021 là 99.000 tấn, điện tích sản xuất là 67.654 ha, sản

lượng ớt khô khoảng 1,5 tắn/ha

1.2 Bệnh thán thư trên ớt

Theo Vũ Triệu Man (2007) bệnh than thư trên ớt do hai loại nam Colletotrichumnigrum và Colletotrichum capsici gây ra Theo Lê Đình Đôn va cs (2007), có ít nhất baloài nam được tim thấy trên trái ớt Colletotrichum acutatum

1.2.1 Triệu chứng bệnh

Ray (2004) đã miêu tả bệnh than thư trên ớt, bệnh xuất hiện ở tat cả các giai đoạnsinh trưởng bao gồm cả giai đoạn sau thu hoạch Đặc biệt xuất hiện nhiều trên quả chín,các trái chạm dat hoặc các trái bị tổn thương Vét bệnh mới xuất hiện nhỏ, lõm và có thểphát triển lên đến 3cm Vét thương là nơi tập trung nhiều 6 bao tử nam, trên vết bệnhcũng có các quả thé mau đen, xếp thành hình tròn đồng tâm

Theo Vũ Triệu Man (2007), bệnh than thư có thé gây hại t rên thân, lá, trái và hạt.Nhưng gây hại chủ yếu trên trái vào giai đoạn chín Vết bệnh ban đầu là một đốm nhỏhơi lõm, ướt trên bề mặt vỏ trái, sau 2-3 ngày thì kích thước bệnh có thé lên đến lemđường kính Vết bệnh thường có hình thoi, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là mộtđường màu đen chạy dọc theo vết bệnh Trên bề mặt vét bệnh có những chấm nhỏ là đĩa

11

cành của nam gây bệnh Các vết bệnh có thé liên kết với nhau làm trái bị thối.

Than P P (2008) miêu tả triệu chứng điển hình trên trái là các tốn thương hìnhtròn, lõm với vòng tròn đồng tâm trên bề mặt trái ướt và xuất hiện tản nắm hồng với

nhiều bào tử vô tính Dưới áp lực bệnh nặng, vết bệnh liên kết lại gây thối trái

1.2.2 Tống quan về nam Colletotrichum spp Gây bệnh than thư trên ót

Chi (Genus): Colletotrichum

Có năm loài Colletotrichum đã được phát hiện có gây bệnh than thu trên cây ớt,

đó là Colletotrichum acutatum, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporioides,

Colletotrichum coccodes va Colletotrichum graminicola (Lakshmi Sahitya U va cs, 2014).

1.2.2.2 Phan bố và ky chủ:

Da phần các loài Colletotrichum spp 6 dang bào tử va tồn tại trong đất hoặc trêncác mảnh vụn đã bị nhiễm bệnh Nắm Colletotrichum spp Là loại nam kí sinh đa kí chủ(Agrios, 2005), phân bố rộng trên khắp thế giới Nắm Colletotrichum spp Tập trung chủ

yếu tại Nam Á đặc biệt là Trung Quốc, Ấn Độ, vùng bờ biển Tây của Nam Mỹ, một sỐquốc gia Tây Phi đặc biệt là Ghana

Một số loài Colletotrichum hoặc các biotypes có thé cùng gây hại trên một ký

chủ Gây ra bệnh than thư trên xoài có thé là Colletotrichum acutatum và Colletotrichumgloeosporioides Dâu tây có thé bị nhiễm Colletotrichum fragariae, Colletotrichum

acutatum và Colletotrichum g/oeosporioides gây hại trên cả thân lá và qua Hạnh nhân

và các loại trái cây rụng lá khác có thé nhiễm Colletotrichum acutatum hoặcColletotrichum gloeosporioides Cam quýt, cà phê, bau bí, ca, ớt đều có thé bị gây hại

(Freeman, 1998).

13

Hình 1.1 Colletotrichum spp Gây hại trên một số cây trồng

Nguôn: Cannon và cs, 2012

1.2.2.3 Đặc điểm hình thái

Nam Colletotrichum có sợi nam nội sinh, mảnh, phân nhánh, không mau, có váchngăn, sợi nam có nội bao và gian bảo Nhiều hạt dầu được hình thành trong mỗi sợi nắm,

khi sợi nắm gia trở nên sậm mau và bện xoắn lại thành dang chất nền nhỏ dưới lớp ngoài

cùng Nam Collefotrichum sinh sản vô tính bằng bao tử, bao tử đính phát triển trên cuống

bào tử dạng quả thể là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mỗi

cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống

bào tử không có vách ngăn kéo dai đơn bao, dạng liềm, cong, bao tử trong suốt Cùng

với bao tử và cuống bao tử 1a các lông cứng trên mỗi cụm cuống bảo tử Lông cứng dai,thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bao, cau trúc như to cứng Một vài loại nắm của

Colletotrichum có hoặc không có lông cứng có thé được kiểm soát bởi sự thay đôi của

độ âm Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bao tử nảy mam từ một đến nhiều ống mam dé

hình thành sợi nắm, gây tôn thương trên bề mặt vật chủ Soi nam gia đôi khi hình thànhvách dày, màu nâu sm, hình cầu gọi là hậu bào tử (Chlamydospores), có thé tận cùnghoặc chen giữa sợi nam dé tồn tai trong thời gian dai và khi tach chúng ra cũng nảy mam

để hình thành sợi nam mới Cũng như những loại nấm gây bệnh thực vật khác,

Colletotrichum tồn tại chủ yếu giai đoạn vô tính, còn giai đoạn hữu tính chủ yếu ton tai

trên mô đã chết (Sutton, 1995)

Hình 1.2 Hình thái của các chủng nam Colletotrichum khi được cấy trên đĩa

peri và quan sát dưới kinh hiển vi

(Nguồn: Liu và cs, 2016)

1.2.2.4 Qua trình phát sinh bệnh

Colletotrichum spp Sử dụng các cách khác nhau dé gây bệnh cho cây ký chủ Sự

xâm nhiễm ban đầu bởi các nắm Colletotrichum có liên quan đến một loạt các quá trình

bao gồm sự tiếp xúc bào tử lên bề mặt cây trồng, sự nảy mam của bào tử, sự hình thành

giác bám, sự xâm nhập vào biêu bì của cây, sự phát triên, định vị vào mô cây, sự sản

15

sinh ra đĩa cành và bào tử phân sinh (Than và cs, 2006).

Trên cây, nắm duy trì trạng thái tiềm sinh không gây bệnh cho tới khi các thayđổi sinh lý của mô (do tôn thương, già hóa) xuất hiện Các thay đồi này kích thích nam

chuyên sang trạng thái có tính độc cao và gây bệnh Trạng thái tiềm sinh của nắm có thê

diễn ra dưới 2 dạng: nắm sống nội sinh trong mô nhưng không gây bệnh và trên bề mặtcây, quả, đĩa cành của nam có thé duy trì trạng thái ngủ nghĩ lâu dài (Hà Viết Cường,

Chúng tồn tại ở dạng sợi nấm hay hạch nấm Bệnh thin the xuất hiện

trong xác thực vật và đất trên nhiều loại cây

Hình 1.4 Vong đời của Colletotrichum spp.

(Nguồn: De, 2017)

Sau khi bào tử nam tiếp xúc với vật chu, chúng sẽ nảy nam, hình thành đĩa bám

và bắt đầu xâm nhiễm vào các tế bào của vật chủ, giai đoạn tiếp theo là hoại tử do các

tế bào vật chết đi vì mất chất đinh dưỡng Lúc này trên vật chủ như trái cây, thân hoặc

lá xuất hiện các vết bệnh, thối nhữn, màu đen, hơi lõm và có thé có chất nhay Giai đoạntiếp theo là nam Colletotrichum spp Sẽ hình thành các cành sinh bào tử và phát tán bào

tử, hoặc chúng sẽ tồn tại dưới dạng sợi nắm hay hạch nắm trong đất, tàn dư thực vật hay

còn gọi là giai đoạn tiềm ân, bào tử hình tals và tồn tại trong các thể quả dạng chai,

khi điều kiện thuận lợi chúng sẽ phát triển thành các túi bào tử và phát tan bào tử tiếp

tục vòng đời.

1.3 Tổng quan về dịch chiết thực vật

1.2.2 Khái niệm về dịch chiết thực vật

Dịch chiết thực vật là loại tinh dau sản xuất từ nguồn nguyên liệu là các loại cây,

vỏ cây, rễ cây, lá, hoa quả theo phương pháp hữu cơ, không phân bón hoá học, thuốc

tăng trưởng, thuốc sâu trong quá trình gieo trồng, thu hoạch và chế biến Thông thường

được tạo ra trong quá trình chưng cất tách các hợp chất dầu và nước của nhà máy bằngcách hấp các loại tinh dau là các loại dau tập trung cao có mùi thơm mạnh Những tinh

19 dầu này rất dễ bị phân huỷ dưới tác động oxy hoá và ánh sáng nên chúng ít gây độc

hại cho môi trường sinh thái (Nguyễn Trần Oánh và cs, 2007)

Công dụng:

Dịch chiết thực vật hiện nay được nhiều người sử dụng thay thế các loại thuốchoá học dé phòng trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng và gia súc bằng cáchphun lên cây hay dùng để tắm cho gia súc Dịch chiết thực vật diệt côn trùng bằng conđường tiếp xúc, vị độc hoặc xông hơi Phổ tác động thường không rộng Sau khi xâmnhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng

Do dịch chiết thực vật nào cũng nhanh phân huỷ nên chúng không tích luỹ trong cơ thể

sinh vật, trong môi trường và không gây hiện tượng sâu hại kháng thuốc Dịch chiết thựcvật rất an toàn đối với chính thực vật, thậm chí trong một số trường hợp chúng còn kíchthích cây trồng phát triển (Nguyễn Trần Oánh và cs, 2007)

1.2.3 Một số nghiên cứu về sử dụng dịch chiết thực vật

1.2.3.1 Dich chiết gừng (Zingiber officinale)

Trong gừng chứa nhiều tinh dầu và một số chat có tính kháng khuẩn như gingerol,

shogaol, zingiberene có khả năng ức chế loại loại nắm mốc và vi khuẩn (Rodrigues và

cs., 2007).

Các nhà khoa học Đức đã phát hiện ra rằng, nước gừng có khả năng ức chế sựsinh sản của tế bào ung thư và làm giảm bớt các tác dụng phụ của các thứ thuốc chống

ung thư Các chuyên gia Philipinnes phát hiện thấy trong gừng có các chấtzingiberol, zingiberen, aldehyde có tác dụng tiêu viêm, giảm dau và diệt khuân Cácchuyên gia Hà Lan phát hiện thấy trong gừng có những chất có tác dụng giống như thuốckháng sinh và tác dụng của chúng rõ rệt trong việc diệt trừ một số loại nắm và vi khuẩn.Ging có tác dụng điều hoà miễn dich Trong gừng chứa monoterpenoids,

sesquiterpenoids, hợp chất phenolic và các dẫn xuất của nó, aldehyd, ketone, rượu, este,

cung cấp phô kháng khuẩn rộng chống lại các vi sinh vật khác nhau va làm cho nó trởthành một chat thay thé thú vị cho các chất kháng khuan tổng hợp (Lim va cs, 2018; Gao

và cs, 2022) Ví dụ, 6-gingerol ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư cô tử cung ở

người (Moorkoth và es, 2021)

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cả chiết xuất gừng và tinh dầu gừng đều

có hoạt tính kháng nắm chống lại mầm bệnh thực vật, chăng hạn như Fusarium

oxysporum và Colletotrichum falcatum (Abdullahi va cs, 2020) Noshirvani va cs (2017)

báo cáo rang tinh dầu gừng có thé được sử dung dé làm dẻo màng carboxymethyl cellulose đồng thời cải thiện tính thấm ẩm và duy trì hoạt tính kháng

chitosan-nắm Tương tự, Agarwal và cs (2001) đề xuất rằng 6-dehydroshogaol được phân lập từ

thân rễ gừng thể hiện hoạt động điều tiết sự phát triển của côn trùng tối đa trong khi

dehydrozingerone thé hiện hoạt động khang nam tối đa Những phát hiện này chỉ ra rằngchiết xuất gừng có thể hữu ích như một chất thay thế cho thuốc diệt nắm và diệt khuẩn

Theo Nguyễn Thy Đan Huyền, Lê Thanh Phong (2019), nghiên cứu hoạt tínhkháng nam Colletotrichum musae và nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thanthư hại chuối va ớt từ dich chiết gừng (Zingiber officinale) Dịch chiết gừng ở nồng độ

20% đã ức chế 89,21% sự phát triển đường kính tan nam C Musae và ức chế 65,58%

sự phát triển đường kính tản nam C Gloeosprioides sau 192 giờ nuôi cây Quan sát đưới

kính hién vi sau 12 giờ cho thấy, dịch chiết gừng nồng độ 10% ức chế 97,33% và 94,00%

sự nảy mam bào tử nam C Musae và nam C Gloeosporioides

1.2.3.2 Dich chiết cây thuốc doi (Pouzolzia zeylanica L.)

Thuốc doi hay con gọi là Bo mắm có tên khoa học là Pouzolzia zeylanica (L.)Benn thuộc họ Gai (Urticaceae) Cây có tính ngọt, dang nhạt, tính mat, có tac dụng tiêu

khát, trừ đờm, lợi tiêu, tiêu viêm (Tô Đăng Hai, 2003) Trong cây thuốc doi có sự hiện

19

diện cua alkaloid, glycosides, tannin và flavonoid đã được khang dinh trong qua trinhsang lọc sơ bộ phytochemical (Swati và cs., 2012), đây là những hợp chat chống oxy hóacao.

Mặc dù, cây thuốc đòi được biết và sử dụng khá rộng rãi trong dân gian nhưng

vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như ứng dụng trong chế biếnthực phẩm được báo cáo

Tại trường Đại học Chitagong, Băng la đét nhiều nghiên cứu về hoạt tính khángkhuẩn của dịch chiết cồn Powzolzia zeylanica (L.) bằng phương pháp đĩa (cup-plate) chothay dịch chiết nồng độ 1 mg/ml cho hoạt tính kháng khuẩn trên cả vi khuẩn gram dương

lẫn gram âm như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella va Salmonella typhi dysentariae.

Đặc biệt là hoạt tinh kháng khuẩn tốt đối với Staphylococcus aureus va Escherichia coli

Tinh kháng khuẩn trên hai chủng nay cũng đã được dé cập đến trong nghiên cứu của LêThanh Thuỷ (2007), tính chất này được thử trên các hoạt chất đã được phân lập từ

Pouzolzia zeylanica là vixetin và isovixetin.

Saha và cs (2012) đã tiến hành thử hoạt tính kháng nam của dich chiết cồn thuốcdoi (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn.) bằng phương pháp khuếch tán Kết qua cho thấykhả năng ức chế tố các dòng nam với vùng ức chế từ 7-26mm Aspergillus niger là dong

nam nhạy cảm nhat với dịch chiết nay.

Chương 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

2.1 _ Thời gian và địa điểm thí nghiệm

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện trong khoảng thời gian từ thang 8 năm 2023 đến tháng

5 năm 2024

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Được thực hiện tại phòng thí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnh học và Chuẩn đoán)

va nhà mang thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Dai học Nông Lâm TP Hồ Chí

Minh.

2.1.3 Nội dung nghiên cứu đề tài

Nội dung 1: Phân lập và định danh nắm Colletotrichum spp gây bệnh than thưtrên ớt bằng đặc điểm hình thái

Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết gừng, dịch chiết cây thuốc

doi và dịch chiết hỗn hop của gừng và cây thuốc dòi đến sự phát triển nam

Colletotrichum spp.

2.2 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn mẫu

Nguồn mẫu bệnh là giống ớt chỉ thiên, gồm các mẫu trái có triệu chứng bệnh theo

mô tả của Than và cs Năm 2008 được thu thập tại các vườn trồng ớt tại xã Tân Thành

và xã Tăng Hoà thuộc huyện Gò Công Đông, tỉnh Tiền Giang

2.2.2 Vật liệu thí nghiệm và môi trường thí nghiệm

Vật liệu thí nghiệm

Dụng cụ thí nghiệm trong phòng: đĩa petri 9mm, lam, nước cất, ống đong, đũa cay,

đèn cồn, cồn 70°, cồn 96°, môi trường PDA, môi trường WA Tất cả dụng cụ va môi

trường đều được vô trùng

Thiết bị thí nghiệm trong phòng: Tủ cấy khử trùng, tủ say khử trùng (180°C), nồi

21

hap khử trùng bằng hơi nước nóng (121°C), cân điện tử, bếp điện, lò viba, kính hién vi

quang hoc Olympus CX31.

Phương pháp chuẩn bị một số môi trường cho quá trình phan lập

Môi trường WA (môi trường Water Agar): Dun sôi 500 mL nước cất, sau đóthêm vào 20 gram agar nấu cho đến khi tan hết agar và thêm nước cất vào cho đến khi

dung dịch vừa đủ 1000 mL Hap khử trùng bằng nồi hap ở nhiệt độ 121°C trong 20 phútsau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 mL dung dịch)

Môi trường PDA (môi trường Potato Dextrose Agar): 200 gram khoai tay đã lột

vỏ rửa sạch, thái nhỏ, nấu trong 500 mL nước cất cho đến khi khoai tây mềm, lọc bỏ bã,thêm 20 gram đường dextro và 20 gram agar vào nấu cho đến khi hoà tan hoàn toàn,thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đủ 1000 ml Hap khử trùng bằng nồi hap

ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút sau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 mL dung dịch)

2.3 Phuong pháp thí nghiệm

2.3.1 Phân lập và định danh Colletotrichum spp Gây bệnh than thư trên ớt bang

đặc điểm hình thái

2.3.1.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh

Tiến hành thu mẫu trái trên ớt chỉ thiên có triệu chứng nhiễm bệnh 22ung thư

theo mô tả của Than và cs (2008) được thu thập tại vùng trồng ớt thuộc xã Tân Thành,

xã Tăng Hoà thuộc huyện Gò Công Đông, tỉnh Tiền Giang Tiến hành chọn 2 vườn, thumẫu theo 3 vị trí, mỗi vị trí thu 2 đến 3 trái ớt bệnh Thu thập và bảo quản mẫu theo

phương pháp quản lí mẫu bệnh thực vật của Roger và cs (2005) sau đó chuyên về phòng

thí nghiệm dé tiến hành phân lập

Các triệu chứng điển hình do nam Colletotrichum spp gây ra trên cây ớt vào thờiđiểm vết bệnh trên quả là những đốm nhỏ, có các mô hoại tử lõm xuống, có nhiều màu

từ nâu sam đến đen với các vòng tròn đồng tâm có nhiều đĩa cành đen trên bề mặt, trên

lá vết bệnh hình tròn hoặc không có hình dạng nhất định, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màunâu nhạt, sau chuyền màu nâu sậm, có viền đỏ, lan rộng và lõm sâu Vườn được thu mẫuphải có thời gian cách ly thuốc ít nhất là 14 ngày

Thông tin mẫu bệnh: thông tin mẫu bệnh được ghi dựa vào địa điểm lấy mẫu,

giống ớt, bộ phận bị bệnh (quả) và đánh thứ tự mẫu.

Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu thập mẫu bệnh thán thư trên ớt ở tỉnh Tiền Giang

STT |Mãsốvườn| Tọa d6/vitri | Mẫu/vườn | Vị trí mẫu Kí hiệu

bệnh

1 TT Xã Tân Thành 9 Trái TT1 - TT9

2 TH Xã Tăng Hoà 9 Trái THỊ — TH9

2.3.1.2 Phương pháp phân lập nắm từ mẫu bệnh

Phương pháp phân lập và làm thuần mẫu:

Tác nhân gây bệnh thán thư được phân lập trực tiếp từ mẫu bệnh theo phương

pháp của Than và cộng sự (2008), Akhter và cộng sự (2009).

Mau trái ớt bị nhiễm bệnh được khử trùng bề mặt bằng cách dùng giấy mềm (giấyăn) đã nhúng cồn 70%, rửa lại trong nước vô trùng và để khô trên giấy thâm vô trùng

Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt mô vết bệnh thành mẫu nhỏ (khoảng 2 x 2 mm) tại điểmtiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe sau đó đặt lên môi trường PDA Sau khi cấy xong,

đặt ngược dia Petri dé tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cay ở nhiệt độ khoảng25°C Kiểm tra và đánh giá sự phát triển của đĩa cấy hàng ngày

Khi các sợi nam bắt đầu xuất hiện từ các mẫu cấy tiến hành cay chuyền đỉnh sợinam lên môi trường PDA Làm thuần mẫu nam bằng cách tiếp tục cấy đỉnh sinh trưởng

của sợi nắm

Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch

Áp dụng phương pháp theo Burgress và cs (2009) tiến hành lây bệnh nhân tạotrên trái ớt bang cách tạo vết thương hở và cắt hạch nam hạch nam gắn lên vết thương

đã tạo.

Tiến hành trên 3 trái ớt không bị nhiễm bệnh, | trái đối chứng không lây bệnh va

2 trái được tạo vết thương hở và tiến hành đắp thạch nắm Collefotrichum spp., sau đôđặt trong khay đã được tạo độ 4m và giữ trong nhiệt độ phòng

Các bước chủng Koch:

23

1 Trước khi lây nhiễm nhân tạo, các trái được rửa sạch dưới vòi nước chảy mạnh,

sau đó được nhúng vào trong dung dịch cồn trong 1 phút vớt ra để khô tự nhiên, cuốicùng trái được vô trùng bằng đèn cực tím trong 15 phút để loại bỏ mầm bệnh tiềm ân

bên ngoài vỏ trái.

2.Các trái được tạo vết thương bằng cách dùng kim tiêm chọc vào vỏ trái ớt(đường kính lỗ kim 0,5 mm), mỗi vi trí tạo 1 vết thương sâu 2 mm và gắn một miếngthạch nhỏ từ mẫu bệnh đã làm thuần vào vị trí vết thương (hoặc tiêm một lượng nhỏdịch bảo tử vào thân, dùng kim hoặc ống tiêm)

3 Dùng que cấy hoặc kim tiêm chọc vào trái đối chứng nhưng không lây bệnh

4 Dùng parafilm hoặc màng nilon bọc vết thương hoặc vị trí lây bệnh

5 Tạo âm cho trái mỗi ngày

6 Kiểm tra và so sánh trái được lây bệnh với trái đối chứng Quan sát và ghi nhận

các triệu chứng va so sánh những triệu chứng nay với các triệu chứng đã quan sát trên

đồng ruộng

2.3.1.3 Định danh nắm Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt bang

đặc điểm hình thái

Quan sát những đặc điểm hình thái bao tử của nam Collefotrichum spp.: màu sắc,

hình thái bào tử, kích thước bào tử: đo chiều dài, chiều rộng bảo tử

Đặc điểm của giác bám: Một mảnh môi trường PDA được đặt trên đĩa Petri vô

trùng Bào tử nắm được cấy vào cạnh của miếng môi trường và một lamen vô trùng được

đặt lên trên mảnh môi trường Đĩa được ủ 7 ngày ở 25°C cho tới khi đĩa áp hình thành ở

mặt dưới của lamen (Cai và cs, 2009).

Ghi nhận hình dạng và kích thước của giác bám Quan sát dưới kính hiển viOxympus BX40 vật kính 100X để đo kích thước bào tử, giác bám và đặc tính sinh họccủa từng chủng nam dé phân loại và định danh theo khóa phân loại của Sutton (1995).2.3.2 Đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết gừng và dịch chiết cây thuốc dòi

đến sự phát triển của nam Colletotrichum spp

2.3.2.1 Chuan bị dịch chiết:

Gung tươi là loại gừng ta, củ gừng được thu tại các chợ ở thành phố Hồ Chí Minh.Ging già tươi được thu hoạch từ tháng thứ 7 đến tháng thứ 8 tinh từ thời điểm trồng,

được sử dụng dé làm thí nghiệm Ging thu được phải còn nguyên vẹn, không bị dap hay

thối hỏng

Cây thuốc doi (Pouzolzia zeylanica) được thu tại các khu vực tại Thành phố HồChí Minh Khi thu phải giữ cho lá cây nguyên vẹn, không dập nát.

Thu nhận dịch chiết:

Nguyên liệu gừng và lá thuốc dòi được cắt nhỏ, phơi khô dưới ánh nắng mặt trời

và nghiền thành bột riêng rẽ Bột (1kg) được ngâm với 5 lít ethanol 90 độ tại nhiệt độ

phòng trong 24h Sau đó hỗn hợp bột được lọc lấy dịch chiết, sau đó dịch chiết được

loại bỏ dung môi bằng máy cô quay đề thu cao chiết Quá trình ngâm được lặp lại 7 lần.Cao chiết sẽ được hoàn tan với cồn theo tỉ lệ 1 g cao trong 10 ml cồn Sau đó pha loãng

dịch chiết gốc này bằng nước ở các nồng độ khác nhau khi bố trí thí nghiệm

2.3.2.2 Xác định ảnh hưởng của dịch chiết đến sự phát triển đường kính của tảnnắm

Tìm ra nồng độ dịch chiết gừng và dịch chiết cây thuốc dòi có khả năng ức chếđến sự phát triển của nắm Colletotrichum spp cao nhất

Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm đơn yếu tô được bố trí theo kiêu hoàn toản ngẫu nhiên của dịch chiếtgừng và dịch chiết cây thuốc với các nghiệm thức nghiệm thức (NTI đến NTS: thínghiệm hiệu lực ức chế ở 5 mức nồng độ của mỗi loại dịch chiết, NT6 là nghiệm thức đối

chứng (nước cat)), 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 dia petri Hỗn hợp dịch chiết gừng vàdịch chiết cây thuốc doi với 6 nghiệm thức (NT1 đến NTS: thí nghiệm hiệu lực ức chế

ở 5 mức nồng độ của hỗn hợp hai dịch chiết, NT6 là nghiệm thức đối chứng (nước cất))

25

Bảng 2.2 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết gừng đến sự pháttriển đường kính tản nắm Colletotrichum spp.

Nghiệm thức Hoạt chất Nồng độ (%)

NT1 Dich chiét gimg 2

NT2 Dich chiét gimg 4

NT3 Dich chiét gimg 6

NT4 Dich chiét gimg 8

NTI Dịch chiết cây thuốc dòi 3

NT2 Dịch chiết cây thuốc đòi 3

NT3 Dịch chiết cây thuốc đòi 7

NT4 Dịch chiết cây thuốc doi 9

NT5 Dịch chiết cây thuốc doi 11

NT6 Nước cất 0

Bảng 2.4 Thí nghiệm : Đánh giá hiệu lực ức chế của dịch chiết hỗn hợp gừng vàdịch chiết cây thuốc đòi đến sự phát trién đường kính tan nấm Colletotrichum spp.

Nghiệm thức Hoạt chất Nồng độ (%)NTI Hỗn hợp dịch chiết 2

Ảnh hưởng của dịch chiết gừng đến sự phát triển đường kính tản nắm được xác

định theo Yao và Tian (2005).

Chuẩn bị môi trường PDA được hấp khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121°Ctrong 20 phút Dịch chiết gừng và dịch chiết cây thuốc dòi được hoà trộn với môi trườngPDA (40 — 55°C) từ nong độ gốc là 100% dé đạt được dung dịch có nồng độ lần lượt là2,4,6, 8, 10% và 3, 5, 7, 9, 11%, dịch chiết hỗn hợp gừng và cây thuốc đòi là 2, 4, 6, 8,10% với đối chứng là mẫu 0% dịch chiết cho vào dia petri 9mm vô trùng tổng thể tích

15 mL/đĩa (ghi kí hiệu loại dịch chiết, nồng độ, nghiệm thức, lần lặp lại và ngày tâm đĩa,

mặt nam úp xuống mặt môi trường PDA, dán kín xung quanh đĩa bang parafilm

Chỉ tiêu theo dõi

Đường kính trung bình tản nam: Do đường kính tan nam Colletotrichum spp

Được theo dõi định kì 24 giờ/lần, lay chỉ tiêu ở 3, 6, 9, 12, 15 ngày sau cấy (NSC) cho

đến khi tản nắm (tản sợi) phát triển chạm vào thành đĩa ở nghiệm thức đối chứng thìngưng quá trình do Do đạc bằng thước kẻ có đơn vị mm, đường kính tan nam được tinh

27

bằng cách đo hai đường chéo vuông góc và lấy giá trị trung bình.

Đường kính trung bình của tan nam (tản sợi) được tinh bằng công thức:

đd= (d1 + d2)/2

Trong đó:

d: là đường kính trung bình tan nắm (tan sợi)

d1, d2: là đường kính vuông góc của tan nam (tan sợi

Sự ức chế của dịch chiết đối với nắm Colletotrichum spp Được tinh theo công

thức sau:

I(%) = ((C-T)/C)x100

Trong đó: I là sự ức chế (%); C là đường kính tản nắm mẫu đối chứng (mm); T

là đường kính tản nắm của nghiệm thức (mm)

Nếu I > 60% thì nắm mẫm cảm với dịch chiết

Nếu 10% < I< 60% thì nắm phản ứng trung bình với dịch chiết Nếu I < 10% dich

chiết không có khả năng ức chế nắm

2.3.2.2 Xác định ảnh hưởng của dịch chiết đến sự sự nảy mầm của bào tử nắmPhương pháp tiến hành

Ảnh hưởng của dịch chiết gừng va thuốc đòi đến sự nảy mam bào tử được tiễn

hành trên lam kính lõm (Croninvà cs., 1996) Ở mỗi nồng độ khảo sát của dịch chiếtgừng, cho 40 yl vào phần lõm của lam Cho 10 pl dich bào tử (nồng độ 10 bao tử/m])

lên lam, đậy lam kính và nuôi ở 28°C trong bóng tôi Sau 8 giờ và 24 giờ tiến hành đếm

số lượng bảo tử nảy mam trong tổng số bào tử dưới kính hién vi với độ phóng đại 40X

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Tỷ lệ ức chế nảy mầm của dịch chiết sinh học lên bào tử nam được tính theo côngthức: Ty lệ ức chế (%) =[(Téng số bào tử nay mam ở công thức đối chứng — Tổng sốbào tử nảy mầm ở công thức thí nghiệm )/Tổng số bào tử nảy mầm ở công thức đối

chứng)x100.

Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 Phân

tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1

29

Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập nấm gây bệnh than thư trên ót

3.1.1 Quá trình thu thập mẫu bệnh

Các mẫu trái bệnh được thu thập tại vườn gồm những trái ớt có triệu chứng đặc

trưng của bệnh thán thư trên ớt tại xã Tân Thành và xã Tăng Hoà, huyện Gò Công Đông,

tỉnh Tiền Giang Tiến hành lấy mẫu bệnh tại 3 vị trí chéo của vườn, mỗi vị trí lấy 3 tráibệnh, quan sát chọn những trái xuất hiện những vết bệnh bị lõm xuống có màu nâu xám

đến nâu đen, dùng kéo đã vệ sinh bằng cồn 70° cắt tại vị trí cuống trái và cho vào tui zip,

bảo quản lạnh trong suốt quá trình thu mẫu

Hình 3.1 Tiến hành thu trái có triệu chứng bệnh

3.1.2 Quá trình phân lập

Quá trình thu mẫu được tiến hành tại 2 vườn ớt, tong số mẫu bệnh thu được gồm

18 mẫu Trong đó mỗi vườn thu trên 3 vị trí, mỗi vị trí tiến hành thu 3 mẫu bệnh tir trái

Thu thập và bảo quản mẫu theo phương pháp quản lí mẫu bệnh thực vật của Roger và

cs (2005) sau đó chuyên về phòng thí nghiệm dé tiến hành phân lập

31

Hình 3.3 Mẫu nắm phân lập được từ mẫu trái ớt bệnh3.2 Định danh nắm gây bệnh than thư trên ớt tại tỉnh Tiền Giang

3.2.1 Định danh nắm gây bệnh thán thư dựa vào hình thái bào tử của các mẫu

nắm phân lập

A: Mặt dưới tan nắm, B: Mặt trên tan nam; C: Bào tử nắm; D: Hình dạng giác

bam

Sau khi phân lập 18 mẫu bệnh và làm thuần, thu được 10 mẫu Colletotrichumspp (bang 3.1), mẫu sau khi phân lập được đặt trong tủ định ôn với mức nhiệt độ 25+1°C.

Tất cả mẫu nắm được kích thích việc hình thành bảo tử bằng cách cấy một miếng agarkhoảng 1 cm? từ môi trường PSM hoặc PCA vào một đĩa petri đã đỗ nước vô trùng và

dé dưới ánh sáng trong 2 ngày (Burgess và cs, 2009) nhằm quan sát đặc điểm hình thai

Kết quả phân lập và cấy truyền cho thấy: tản nắm chạm thành đĩa sau 15 ngày sau khinuôi cấy, có hình dạng tròn hoặc hơi tròn, mau trắng hoặc cam hong Mat trén cua dia

nam xuất hiện những cham nhỏ mau den, không có những đường tròn đồng tam Mặt

dưới tản nam có màu hồng cam hoặc hơi vàng, các cham nhỏ màu den và đậm dan gần

tâm sợi nằm mau trắng, có vách ngăn và phân nhánh, mọc sát mặt thạch, Bào tử đơnbao, trong suốt, hình trụ hai đầu tròn hoặc một đầu tròn một đầu nhọn Giác bám có màunâu đến nâu đen, có dạng hình elip hoặc trứng ngược (hình 3.4)

Bảng 3.1: Số mau nam Colletotrichum spp phân lập được từ 2 vườn ớt ở tỉnh Tiền

Giang

R Số mẫu nắm

, Vị trí, địa Mau

Mã so ñ „ Vị trí thu Colletotrichum

diém thu Giông bệnh/ =

vườn : mầu sp phân lập

Quan sát đặc điểm hình thái của 10 đĩa Colletotrichum sp trên môi trường PDA

15 ngày sau cấy và dựa vào khóa phân loại Colletotrichum sp của Sutton năm 1995 tathấy mẫu nam này thuộc phức hợp loài Colletotrichum acutatum

3.2.2 Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch

Dé khang định chủng nắm Colletotrichum spp phân lập được chính là tác nhân

33

gây bệnh thán thư Quy trình tái nhiễm và phân lập theo quy trình Koch, kết quả đượctrình bày như sau:

Sử dụng các mẫu phân lập từ nắm Colletotrichum spp đã phân lập và tiễn hànhlây bệnh lên quả ớt chỉ thiên nhận thấy các mẫu sau lây bệnh có các triệu chứng điển

hình của bệnh thán thư trên cây ớt (Hình 3.5) Kết quả chủng bệnh cho thấy mẫu ớt

chủng bệnh xuất hiện triệu chứng bệnh thán thư gây vết loét màu vàng nâu, vết bệnhban đầu nhỏ, có màu nâu nhạt, sau đó chuyên sang màu nâu đậm hoặc đen Trên vếtbệnh màu vàng nâu thường thấy xuất hiện những khối bao tử màu vàng xin, khối bao tửnày âm ướt, xung quanh vết bệnh lõm xuống và thường có đường viền màu đen lan rộng

và không đều nhau Vết bệnh có hình dạng bat định, màu nâu đậm đến màu đen Vết

bệnh lúc đầu là các đốm đen nhỏ, sau lan rộng thành các vết bệnh lớn, mô bệnh không

có ranh giới rõ rệt với mô khỏe Ở vùng gây vết thương biéu bì bắt đầu chuyên sang màu

nâu đen.

Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh của nắm Colletotrichum spp trên

quả ớt chỉ thiên hoàn toàn tương đồng với mô tả của Than và cs (2008) về các triệuchứng điển hình của bệnh than thư trên qua ớt Hình dạng vết bệnh thường có hình trònhoặc hơi tròn, lõm xuống Bên trong vết bệnh có màu vàng cam hoặc nâu đen, với những

cham nhỏ mau đen xếp thành vòng tron đồng tâm, khi bệnh nặng, các vết bệnh liên kết