14 Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ tập 5, số Đánh giá khả thủy phân protein đậu nành tinh chế dịch chiết gừng số hoạt tính sinh học sản phẩm thủy phân Lê Thái Quang1*, Mai Thùy Linh2, Nguyễn Thị Phương1, Bùi Công Chính1, Nguyễn Kim Trúc1, Nguyễn Thị Khoa1 Viện Kĩ thuật Công nghệ cao, Đại học Nguyễn Tất Thành quanglethai000@gmail.com Tóm tắt Sản phẩm thủy phân protein đậu nành tinh chế quan tâm nâng cao hoạt tính sinh học cải thiện khả khó tiêu hóa sản phẩm chưa thủy phân Trong báo này, khảo sát khả thủy phân protein đậu nành tinh chế dịch chiết tự nhiên, đồng thời đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa làm lành tổn thương nguyên bào sợi sản phẩm thủy phân Gừng chọn làm nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu dịch chiết gừng chứa nhiều enzyme thủy phân protein Kết nghiên cứu cho thấy thủy phân protein đậu nành tinh chế phụ thuộc nồng độ, thời gian nhiệt độ xử lí Các sản phẩm protein đậu nành tinh chế sau thủy phân có khả khử gốc tự cao từ (7-31) % thu hẹp diện tích vết thương nguyên bào sợi lần so với protein đậu nành tinh chế chưa thủy phân Kết tạo sở cho nghiên cứu sâu hoạt tính sinh học khả ứng dụng sản phẩm thủy phân vào sản xuất thực phẩm chức ® 2022 Journal of Science and Technology - NTTU Đặt vấn đề Protein đậu nành tinh chế (soy protein isolate - SPI) chứa đến 90 % hàm lượng protein, sử dụng công nghiệp thực phẩm sản phẩm sữa bột cho trẻ em, đồ uống dinh dưỡng dinh dưỡng [1] Tuy nhiên, protein từ đậu nành có tỷ lệ tiêu hóa thấp so với protein động vật, điều hạn chế ứng dụng chế phẩm chứa protein đậu nành [2] Phương pháp thủy phân SPI enzyme nhằm tạo đoạn peptide kích thước ngắn nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Phương pháp cải thiện khả hấp thu mà cịn tạo peptide có hoạt tính sinh học tốt so với SPI chưa thủy phân Sản phẩm SPI thủy phân flavourzyme có khả ức chế hoạt động glycerol-3-phosphate dehydrogenase, làm giảm tích tụ lipid dẫn đến ngăn chặn biệt hóa tế bào 3T3-L1 cao SPI chưa thủy phân [3] Kết cho thấy tiềm sản Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 04/11/2022 Được duyệt 03/03/2023 Cơng bố 30/03/2023 Từ khóa gừng, kháng oxi hóa, làm lành vết thương, protein đậu nành tinh chế, thủy phân phẩm SPI thủy phân ngăn ngừa bệnh liên quan đến tăng lipid béo phì Tuy nhiên, đa phần protease thủy phân SPI enzyme tinh chế flavourzyme, corolase, papain bromelain [3,4] Việc sử dụng dịch chiết tự nhiên từ thực vật thủy phân SPI chưa nghiên cứu kĩ lưỡng Nghiên cứu trước tiến hành thử nghiệm dịch chiết từ đu đủ dứa để thủy phân SPI Kết cho thấy mức độ thủy phân sử dụng dịch chiết tự nhiên tương đối cao, peptide giải phóng 800 Da sản phẩm thủy phân khơng có vị đắng [4] Tuy chưa đề cập đến hoạt tính sinh học sản phẩm thủy phân SPI nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng phát triển dịch chiết thực vật để thủy phân SPI, nhằm mang lại sản phẩm có giá trị cao Gừng (Zingiber officinale Rosc.) trồng nhiều nơi giới nguồn dịch chiết chứa enzyme Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ tập 5, số thủy phân protein tiềm năng, có zingibain nghiên cứu kĩ lưỡng [5] Tuy nhiên, chưa có báo cáo việc sử dụng dịch chiết gừng (DCG) để thủy phân SPI nhằm tạo sản phẩm có hoạt tính sinh học Do vậy, điều kiện thủy phân SPI DCG tiến hành khảo sát nồng độ dịch chiết, nhiệt độ, thời gian khác Sản phẩm thủy phân SPI protease từ DCG kiểm tra khả kháng oxi hóa in vitro làm lành vết thương nguyên bào sợi người Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu SPI mua từ Công ty Shiv Health Foods LLP (Ấn Độ) Gừng tươi mua chợ truyền thống có nguồn gốc từ Việt Nam Nguyên bào sợi người (fibroblast) thử nghiệm làm lành vết thương cung cấp Phịng thí nghiệm Kĩ nghệ mơ Vật liệu Y sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM 2.2 Khảo sát điều kiện thủy phân SPI DCG Dịch chiết từ củ gừng thu nhận máy ép Phần dịch chiết sau li tâm 6.000 vịng/phút 10 phút 10 0C SPI % thủy phân với DCG nồng độ (2,5; 5; 10 20) % (thể tích/thể tích, v/v) (nồng độ cuối hỗn hợp) thời gian (1, 4) giờ, nhiệt độ phản ứng 25 0C 60 0C Sau thời gian thủy phân, protease gừng bị bất hoạt nhiệt độ 90 0C 15 phút Tiếp đó, mẫu ly tâm 8.000 vịng/phút 10 phút để thu nhận phần dịch chứa protein tan Kết khảo sát phân cắt SPI điều kiện khảo sát kiểm tra thông qua điện di protein SDS-PAGE (sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) Gel nhuộm thuốc nhuộm Coomassi brilliant blue quét hình máy quét (LaserJet Pro MFP M125a, Korea) 2.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa Hoạt tính kháng oxi hóa tiến hành thử nghiệm sử dụng ABTS (2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid) diammonium salt) (Sigma Aldrich, Germany) nhằm xác định hoạt tính khử gốc tự ABTS•+ sản phẩm SPI thủy phân DCG Thử nghiệm sử dụng ABTS thực tương tự trước [6] Trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng oxi hóa sản phẩm SPI thủy phân DCG nồng độ (2,5; 5; 10 20) %, 60 0C tính tốn so với mẫu SPI chứa DCG với nồng độ 15 tương ứng Hoạt tính kháng oxi hóa mẫu thí nghiệm đo độ hấp phụ mẫu bước sóng 734 nm (máy đo quang phổ Genway, USA) Tỉ lệ ức chế gốc tự ABTS•+ mẫu thí nghiệm tính tốn theo cơng thức sau: I (%) = [1 (A2 A3)/A1] × 100 Trong đó, I: Tỉ lệ ức chế ức chế (% gốc tự ABTS•+) A1: Giá trị mật độ quang bước sóng 734 nm đối chứng âm (chỉ chứa ABTS•+) A2: Giá trị mật độ quang bước sóng 734 nm mẫu thử sau phản ứng với ABTS•+ A3: Giá trị mật độ quang bước sóng 734 nm đối chứng trắng (mẫu thử nghiệm khơng chứa ABTS•+) 2.4 Hoạt tính làm lành vết thương in vitro Phương pháp xác định hoạt tính làm lành vết thương mơ hình ngun bào sợi (fibroblast) sản phẩm thủy phân SPI DCG tiến hành tương tự báo cáo trước với số thay đổi nhỏ [7] Cụ thể, sau tạo vết thương tip 10 µL, mơi trường cũ thay môi trường Dulbecco’s Modified Eagle Medium high glucose (DMEM high glucose) (Cytiva, USA) chứa % (v/v) mẫu thí nghiệm bao gồm SPI %, mẫu DCG nồng độ (2,5 5) % mẫu SPI thủy phân DCG nồng độ (2,5 5) % 60 0C Đối chứng nguyên bào sợi nuôi môi trường DMEM high glucose nước với tỉ lệ % (v/v) Hình ảnh vết thương quan sát kính hiển vi (Euromex, Netherlands) sau (0, 12 24) Tỉ lệ làm lành vết thương tiến hành tương tự báo cáo trước [7] Kết thảo luận 3.1 Khả thủy phân SPI DCG điều kiện nồng độ dịch chiết, thời gian nhiệt độ khác Để tìm điều kiện thủy phân thích hợp cho thí nghiệm tiếp theo, nghiên cứu tiến hành khảo sát khả thủy phân SPI DCG nồng độ (2,5; 5; 10 20) % (v/v), khoảng thời gian (1, 4) nhiệt độ 25 0C (nhiệt độ phòng) 60 0C (nhiệt độ tối ưu cho hoạt động số protease) Kết điện di thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng nồng độ dịch chiết, nhiệt độ, thời gian lên thủy phân SPI DCG cho thấy 25 0C, ảnh hưởng nồng độ DCG lên trình thủy phân SPI thể rõ ràng nồng độ 20 % so với nồng độ khác Ở nồng độ 20 %, SPI bị phân cắt gần hoàn toàn thành đoạn Đại học Nguyễn Tất Thành 16 Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ tập 5, số có kích thước nhỏ Khả thủy phân SPI tương tự nồng độ (2,5; 10) % so với nồng độ 20 % Thời gian không ảnh hưởng nhiều tới thủy phân SPI DCG, sai khác khả thủy phân SPI quan sát mức so với (1, 2) với nồng độ dịch chiết 20 % (Hình 1A) Để tìm điều kiện thủy phân thích hợp cho thí nghiệm tiếp theo, nghiên cứu tiến hành khảo sát khả thủy phân SPI DCG nồng độ (2,5; 5; 10 20) % (v/v), khoảng thời gian (1, 4) nhiệt độ 25 0C (nhiệt độ phòng) 60 0C (nhiệt độ tối ưu cho hoạt động số protease) Kết điện di thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng nồng độ dịch chiết, nhiệt độ, thời gian lên thủy phân SPI DCG cho thấy 25 0C, ảnh hưởng nồng độ DCG lên trình thủy phân SPI thể rõ ràng nồng độ 20 % so với nồng độ khác Ở nồng độ 20 %, hai protein phổ biến có kích thước lớn SPI (tại vị trí (72-95) kDa (34-43) kDa) bị phân cắt gần hoàn toàn Khả thủy phân SPI tương tự nồng độ (2,5; 10) % so với nồng độ 20 % Thời gian không ảnh hưởng nhiều tới thủy phân SPI DCG, sai khác khả thủy phân SPI quan sát mức so với (1 2) với nồng độ dịch chiết 20 % (Hình 1A) Khi tăng nhiệt độ lên 60 0C, SPI bị thủy phân mạnh hơn, sai khác quan sát rõ nồng độ 10 % 20 % điều kiện thời gian khảo sát Kết nghiên cứu phù hợp với dự đốn protease có DCG hoạt động tốt nhiệt độ 60 0C phù hợp với kết nghiên cứu trước zingibain tách từ gừng hoạt động tối ưu khoảng (50-60) 0C [8] Khả thủy phân SPI giảm dần nồng độ DCG giảm từ 20 % xuống (10; 2,5) % (Hình 1B) Ngồi ra, mức độ thủy phân SPI thay đổi tăng thời gian xử lí lên với nồng độ DCG sử dụng (10 20) % Như vậy, yếu tố nồng độ DCG, thời gian nhiệt độ xử lí ảnh hưởng tới thủy phân SPI mức độ khác Do SPI bị thủy phân khác với nồng độ dịch chiết khảo sát nhiệt độ 60 0C thời gian xử lí nên điều kiện nhiệt độ thời gian xử lí sử dụng cho thí nghiệm Đại học Nguyễn Tất Thành Hình Khả thủy phân SPI DCG điều kiện nồng độ dịch chiết, nhiệt độ thời gian xử lí khác SPI xử lí với DCG nồng độ (2,5; 5; 10 20) % nhiệt độ 25 0C (A) 60 0C (B) thời gian (1, 4) 3.2 Khả khử gốc tự ABTS•+ sản phẩm SPI thủy phân DCG Nghiên cứu trước cho thấy sản phẩm SPI bị thủy phân thường có hoạt tính kháng oxi hóa cao sản phẩm chưa bị thủy phân [9] Điều số amino acid có tính kháng oxi hóa histidine, methionine, tryptophan, tyrosine cysteine, lysine arginine bị giấu cấu trúc không gian protein lộ protein bị phân cắt thành polypeptide peptide có kích thước nhỏ Vì vậy, nghiên cứu tiến hành đánh giá khả kháng oxi hóa sản phẩm SPI thủy phân dịch chiết gừng Kết cho thấy khả khử gốc tự ABTS•+ SPI thấp so với sản phẩm SPI thủy phân DCG nồng độ (2,5; 5; 10 20) % sau thủy phân nhiệt độ 60 0C (Bảng 1) Sự tăng cường khả khử gốc tự ABTS•+ sản phẩm SPI thủy phân polypeptide/peptide tạo có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh so với SPI ban đầu Kết tạo sở cho nghiên cứu mơ hình in vivo Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ tập 5, số 17 Bảng Khả khử gốc tự ABTS•+ sản phẩm SPI thủy phân dịch chiết gừng DCG (%) SPI SPI sau thủy phân 2,5 51,62 ± 2,83 76,01 ± 2,35** 28,41 ± 1,24 59,49 ± 8,07*** 10 14,18 ± 0,49 31,01 ± 1,73** 20 5,16 ± 0,36 12,36 ± 2,77* Sự sai khác thống kê mẫu SPI gừng so với SPI thủy phân DCG nồng độ kiểm tra phép thử t-test, *: p