Nhóm 3 st4 báo cáo thực hành sắc ký

Dung môi được thêm vào sẽ thâm nhập, hòa tan các chất phân tích có trong mẫu kết hợp với sóng siêu âm đánh vỡ các thành tế bào, đẩy nhanh quá trình giải phóng và khuếch tán các chất này

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH KĨ THUẬT SẮC KÍ

TP Thủ Đức, 11/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH KĨ THUẬT SẮC KÍ

Hướng dẫn thực thành

TS TRỊNH THỊ PHI LY

TRANG THỊ DIỆU HIỀN 21126339

LÊ THỊ NGỌC LOAN 21126394

VÕ THỊ MỘNG HUỲNH 21126078

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

THÍ NGHIỆM 1: LY TRÍCH MẪU CHIẾT THÔ TRONG CÂY CỎ LÀO TỪ CÁC HỢP CHẤT KHÁC NHAU 1

1.1.1.Giới thiệu 1

1.1.2.Tổng quan về cây Cỏ Lào 1

1.1.3.Kỹ thuật chiết xuất 1

1.2.Nguyên vật liệu 2

1.3.Thiết bị, dụng cụ - hoá chất 2

1.3.1.Thiết bị 2

1.3.2.Dụng cụ - hoá chất 2

1.4.Tiến hành thí nghiệm 2

1.4.1.Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong mẫu Cỏ Lào bằng các dung môi khác nhau 2

1.4.2.Thí ngiệm 2: Xác định độ ẩm của nguyên liệu mẫu Cỏ Lào 4

1.5.Kết quả 5

1.5.1.Thí nghiệm 1 5

1.5.2.Thí nghiệm 2 6

THÍ NGHIỆM 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT 7

2.1 Giới thiệu 7

2.1.1 Tổng quan về cây Ngũ sắc 7

2.1.2 Tổng quan về sắc ký cột 10

Trang

2.1.3 Khái quát về chất diệp lục (chlorophyll) và carotenoit (xanthophyl và carotene) 12

2.1.4 Tổng quan về dung môi 13

2.2 Vật liệu và phương pháp 14

2.2.1 Vật liệu 14

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3 Kết quả 16

2.4 Thảo luận 17

THÍ NGHIỆM 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT TLC 16

3.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 18

3.2 Quy trình thực hiện 18

3.2.1 Chuẩn bị dịch chiết sắc tố 18

3.2.2 Dung dịch ly giải (pha động) 18

3.2.3 Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật TLC 19

3.3 Kết quả và thảo luận 19

Bài tập 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Đồ thị tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của Protoctechuic acid 23 Hình 4.2 Đồ thị tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của Chlorogenic acid 23

Trang

THÍ NGHIỆM 1: LY TRÍCH MẪU CHIẾT THÔ TRONG CÂY CỎ LÀO

TỪ CÁC HỢP CHẤT KHÁC NHAU

1.1 Giới thiệu

1.1.1 Tổng quan về cây Cỏ Lào

Cây Cỏ Lào (Eupatorium odoratum L.; Chromolaena odorata King & Robinson) thuộc họ Cúc (Asteraceae) Cỏ Lào còn được gọi là cây Cộng sản, Yên bạch, Bớp Bớp,

Bù xích, Chùm hôi, Nhả nhật, Muồng mung phia, hay tên tiếng Anh là fragrant thoroughwort, bitter bush và tên tiếng Pháp là langue de chat là loài cây mọc hoang

và lan rộng chiếm địa bàn phân bố nhanh ở nhiều vùng trên thế giới Ở Việt Nam, Cỏ Lào thường gặp ở nhiều nơi từ các tỉnh đồng bằng đến các miền trung du và vùng đồi núi thấp

Về công dụng trong y học, từ lâu nhân gian đã biết dùng Cỏ Lào để cầm máu, chữa lành các vết thương, vết bỏng và trị một số bệnh do nhiễm khuẩn về đường ruột, ung nhọt, ghẻ lở, viêm đại tràng, đau nhức xương, cảm cúm Thành phần hóa học của

Cỏ Lào đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu Học viện Quân y đã nghiên cứu dịch chiết toàn phần từ cây Cỏ Lào để bào chế dạng thuốc trị vết thương, vết bỏng

Hình 1.1 Cây Cỏ Lào

1.1.2 Kỹ thuật chiết xuất

Kỹ thuật chiết xuất là phương pháp nhằm tách các hợp chất sinh học mong muốn

ra khỏi mẫu ban đầu và thu được sản phẩm gọi là dịch chiết Gồm các phương pháp vật lý, hóa học và hóa lý

Phương pháp được sử dụng là hóa lý có tên gọi là chiết xuất có hỗ trợ của sóng

siêu âm - UAE (Ultrasonic-assisted extraction) để chiết các chất thô Dung môi được thêm vào sẽ thâm nhập, hòa tan các chất phân tích có trong mẫu kết hợp với sóng siêu

âm đánh vỡ các thành tế bào, đẩy nhanh quá trình giải phóng và khuếch tán các chất này ra khỏi nguyên liệu và thu nhận

Bước 1: Cân 2 lần 1 g mẫu bột Cỏ Lào cho vào erlen

Hình 1.2 Cân mẫu bột lá Cỏ Lào

Lần 2 Lần 1

Bước 2: Cho 15 ml dung môi Acetone, Ethyl acetate lần lượt vào 2 erlen, sau đó cho vào máy siêu âm 15 phút với tần số 50/60 Hz, công suất 465 W

Bước 3: Cân giấy lọc, sau đó lọc dịch chiết

Bước 4: Sau đó thêm tiếp 15 ml vào bã và chiết tiếp lần 2, cho vào máy siêu âm

15 phút

Bước 5: Lọc hết bã trong bình qua giấy lọc Sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ sấy

Bước 6: Sau sấy, cân để biết khối lượng bã còn lại

Hình 1.3 Thêm dung môi vào erlen

(a) Acetone ; (b) Ethyl acetate

Hình 1.4 Lọc dịch chiết (a) Acetone ; (b) Ethyl acetate

Hàm lượng chất chiết thô được tính theo công thức:

H (%)=mo - m1

mo x 100 Trong đó:

mo: khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g)

m1: khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc (g)

1.4.2 Thí ngiệm 2: Xác định độ ẩm của nguyên liệu mẫu Cỏ Lào

Mục đích: xác định được độ ẩm nguyên liệu bột Cỏ Lào trong quá trình bảo

Bước 2: Đem sấy chén và mẫu ở 105oC đến khối lượng không đổi

Bước 3: Để nguội trong bình hút ẩm và cân tổng khối lượng chén và mẫu, tính độ

ẩm bằng công thức:

W (%) =w1 - w2

m x 100 Trong đó:

w1: khối lượng mẫu thử và chén trước khi sấy (g)

w2: khối lượng mẫu thử và chén sau khi sấy (g)

m: khối lượng của mẫu thử trước khi sấy (g)

1.5 Kết quả

1.5.1 Thí nghiệm 1

Khối lượng bã sau sấy khô trừ đi khối lượng mẫu giấy lọc tương ứng với từng dung môi là Acetone và Ethyl acetate là 0,8414 và 0,8549 Áp dụng công thức tính hàm lượng chất chiết thô, ta có:

- Đối với dung môi Acetone:

Nhận xét: Hiệu suất chiết nguyên liệu mẫu Cỏ Lào của dung môi acetone là

Hình 1.6 Khối lượng mẫu trước khi sấy

15,99% cao hơn dung môi ethyl acetate là 14,71% với cùng một khối lượng mẫu bột

Cỏ Lào Vì vậy hàm lượng chất chiết thô từ dung môi acetone lớn hơn hàm lượng chất chiết thô từ dung môi ethyl acetate

THÍ NGHIỆM 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ

THUẬT SẮC KÝ CỘT 2.1 Giới thiệu

Tên Khoa học: Lantana camara L

Tên tiếng Việt: Ngũ sắc; Trâm ổi; Thơm ổi, bông ổi, ổi nho, nhá khí mu (Tày)…

Tên khác: Lantana aculeata L.; Đại sơn (Malaysia); ngải hoang, ngải đỏ, ngải trắng (ở vùng Caribe) và tick berry (Nam Phi)

2.1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây Ngũ sắc (Lantana camara L.), hay Trâm Ổi, thuộc họ roi ngựa (Verbenaceae),

Chi Lantana, được Linnaeus mô tả lần đầu tiên vào năm 1753 trong cuốn Species Plantarum, bao gồm bảy loài, trong đó sáu loài có nguồn gốc từ Nam Mỹ và một loài từ

Ethiopia (Munir, 1996) Thuật ngữ "Lantana" có thể bắt nguồn từ tên gọi Latin cổ của

Hình 2.1 Lantana camara L

(https://en.wikipedia.org/)

chi Viburnum, loài có hình dáng lá và cụm hoa hơi giống với Lantana Phần lớn các loài Lantana có xuất xứ từ các khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới châu Mỹ, nhưng một vài loài cũng có nguồn gốc từ châu Á và châu Phi nhiệt đới Vào cuối thế kỷ 17, các nhà thám hiểm Hà Lan đã mang Lantana từ Brazil đến Hà Lan, và sau đó tiếp tục khám phá chúng ở các khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới (Sharma, 1988) Trong suốt thế

kỷ 18 và 19, nhiều giống Lantana với màu sắc rực rỡ đã được các nhà vườn thương mại hóa và trở nên phổ biến trên toàn thế giới như là một loại cây cảnh

Lantana camara L là loài phổ biến ở một số quốc gia, đặc biệt là ở châu Mỹ và

châu Phi Tuy nhiên, là một loài được du nhập, chúng được tìm thấy ở nhiều địa điểm khác nhau trên toàn cầu, đặc biệt là ở khu vực Úc - Thái Bình Dương Hiện nay, nó xuất hiện ở khoảng 50 quốc gia, nơi nó đã trở thành một loài xâm lấn Ở Việt Nam, hoa ngũ sắc là loài cây bụi mọc hoang ở nhiều nơi và được dùng làm cây cảnh Số lượng loài Lantana được ghi nhận có sự khác biệt, từ 50 đến 270 thực thể loài và phân loài, nhưng con số ước tính hợp lý hơn là khoảng 150 loài (Munir, 1996) Việc phân loại chi này gặp nhiều khó khăn do các loài không ổn định, sự lai tạo diễn ra phổ biến, cụm hoa thay đổi hình dạng theo thời gian, và màu sắc hoa biến đổi theo tuổi và giai đoạn trưởng thành (Munir, 1996)

2.1.1.3 Thành phần hóa học

Các thành phần hóa học của họ Lantana rất phong phú và đa dạng, cho đến nay

người ta đã cô lập được khoảng gần hai trăm chất hữu cơ bao gồm flavonoid, terpenoid, saponin, Steroids, Carbohydrates, glycosides, coumarin được định tính dựa theo phương pháp được mô tả trong báo cáo của Ganatra & Gurubaxani (2016) Falavonoid có trong chiết xuất n-hexan Glycosides, coumarin có trong chiết xuất trong Acetone Terpenoid, saponin, Steroids, Carbohydrates được báo cáo có trong chiết xuất của cả n-Hexan và Acetone

Flavonoid

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn các flavonoids có màu vàng (do từ flavus là màu vàng) Là hợp chất polyphenol có tính chất chống oxy hóa mạnh Flavonoid thường là các hợp chất

Terpenoid

Đây là nhóm hợp chất hữu cơ không phân cực, thường hòa tan trong các dung môi không phân cực như hexane Chủ yếu là terpenoid, đã được sử dụng như một tác nhân bảo vệ chống lại các bệnh do stress oxy hóa gây ra (Grassmann, 2005; González-Burgos

ức chế bơm Na+/K+, làm tăng nồng độ ion canxi, giúp tăng cường co bóp cơ tim

Coumarin

Là hợp chất không phân cực hoặc phân cực nhẹ, tan trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình như ethanol Coumarin được trang bị nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư (Garazd và ctv, 2007;2009; He J

và ctv, 2011;He K và ctv, 2011; Al-Amiery và ctv, 2012)

2.1.1.4 Tác dụng dược lý

Trong dân gian, lá ngũ sắc có tác dụng đắp lên vết thương, vết loét, lá có chứa một

số hợp chất chống ung thư như lantaden B, icterogenin, β-sitosterol (Nguyễn Văn Đậu

và Lê Thị Huyền, 2009) Đặc biệt, dịch chiết nước và dịch chiết cồn của thân lá ngũ sắc

còn có tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình thực nghiệm (Nguyễn Minh Hà và ctv., 2010) Mỗi bộ phận của cây ngũ sắc có những đặc tính riêng: rễ có vị ngọt đắng, tính lạnh, giúp thanh nhiệt; lá có tính mát, có tác dụng tiêu viêm, chữa ngứa và vết thương

do rắn cắn; hoa có vị ngọt nhạt, tính mát, có khả năng cầm máu Lá, hoa và cành có thể được thu hái, phơi khô để làm thuốc chữa bệnh hoặc sử dụng tươi khi cần (Ghisalberti, 2000)

Ở Nam Trung Quốc, dịch chiết từ hoa ngũ sắc được dùng để tắm chữa ghẻ Tại Indonesia và Philippines, người dân thường giã nát lá và hoa để đắp lên vết thương hở,

lở loét, và sưng tấy Trên thế giới, cây ngũ sắc đã được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh khác nhau Trong dân gian, cây này còn được xem như một biện pháp hỗ trợ sau khi mắc bệnh ung thư Uống trà từ lá và hoa phơi khô có thể giúp chữa cúm, sốt và đau

dạ dày Tại Trung và Nam Mỹ, lá tươi của cây được nghiền nát và đắp lên vùng da bị sưng để điều trị vết loét, thủy đậu, và các vết thương nhỏ Ngoài ra, cây ngũ sắc còn được dùng để chữa sốt, cảm lạnh, hen suyễn, và cao huyết áp Ở Ghana, dân gian sử dụng toàn cây ngũ sắc để chữa viêm phế quản Tại nhiều quốc gia châu Á, cây này còn được dùng để điều trị vết cắt, loét và làm thuốc tẩy giun (Ghisalberti, 2000)

Sắc ký tiếp tục phát triển không ngừng nhờ vào những kết quả nghiên cứu của Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge trong suốt những năm thập niên 40 và 50 của thế kỷ 20 Hai ông đã đưa ra những nguyên tắc và kỹ thuật cơ

Sắc ký khí phát triển mạnh mẽ vào những năm 1960, trong khi đó sự ra đời của sắc ký lỏng cao áp vào cuối thập niên 60 là một bước ngoặt mới trong lịch sử sắc ký Ngày nay chúng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm hiện đại trên toàn thế giới Sắc ký là một phương pháp vật lí để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất

ra riêng thành từng chất đơn lẻ, dựa vào tỉnh ái lực khác nhau của những loại hợp chất

đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)

Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Pha tỉnh tách riêng các hợp chất trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp thu của nó Pha tỉnh là chất rắn thường là alumin hoặc silicagel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một cột (sắc ký cột hở), hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa (sắc ký lớp mỏng)

Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí Chất khí được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký khí, trường hợp này chất khí được gọi là khi mang hoặc khi vectơ Chất lỏng dùng trong sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, lúc này chất lỏng gọi là dung môi giải ly

2.1.2.2 Sắc ký cột

Nguyên lý tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí khác: một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyt) Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo các dãy riêng biệt có vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích định tính và định lượng

• Ưu điểm:

Có thể được sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân tích và điều chế

Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các thành phần của một hỗn hợp mà nó còn có thể được dùng để tách và tỉnh chế những thành phần phân tích Điều này trái ngược với sắc ký giấy, đó chỉ là một phương pháp phân tích

Pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiểm, có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất

• Nhược điểm:

Khi chạy cột sắc ký cần đòi hỏi sự chú ý theo dõi liên tục để duy trì mức dung môi

vì nếu không sẽ dễ gây xuất hiện các bọt khí làm tắc cột, nứt cột, và biến dạng đường đi của dung môi

Chạy cột tốn thời gian và và công việc lặp đi lặp lại, đặc biệt là khi chạy các mẫu Quá trình tách chậm và hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp

• Ứng dụng:

Phân tách các thành phần trong hỗn hợp

Cô lập hợp chất dẫn đến nghiên cứu các hợp chất mới

Tinh sạch hợp chất quan tâm

Loại bỏ tạp chất

2.1.3 Khái quát về chất diệp lục (chlorophyll) và carotenoit (xanthophyl và carotene)

2.1.3.1 Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyll)

Có 5 loại chlorophyll là chlorophyll a, b, c1, c2 và d (có tài liệu chia thành chlorophyll a,b,c,d và e), ở thực vật bậc cao chlorophyll a và b rất phổ biến

Công thức của chlorophyll a (C55H72O5N4Mg)

Công thức của chlorophyll b là (C55H70O6N4Mg), diệp lục b chỉ khác diệp lục a là nhóm CH3 ở nhân pyron thứ hai được thay bằng nhóm CH=O

Chlorophyll không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ Vì vậy khi muốn tách chlorophyll ra khỏi lá, bắt buộc phải dùng một dung môi hữu cơ như: ete, cồn, benzen hay axeton,

2.1.3.2 Carotenoit

Nhóm carotenoit gồm 2 nhóm nhỏ là Carotene và xanthophyl

Carotene - C40H56 là hiđrocacbon chưa bão hoà, không tan trong nước mà chỉ tan trong các dung môi hữu cơ Carotene có màu vàng da cam Trong thực vật thường có 3 loại caroten: anpha, beta, gama caroten

Xanthophyl - C40H56On (n = 1- 6) là dẫn xuất (dạng oxi hoá) của carotene Các

Màu sắc và mức độ phân cực của phân tử các chất đó tăng dần theo thứ tự từ trên xuống như sau:

Bảng 2.1 Bảng màu sắc và thứ tự phân cực của các chất

Pheophytin màu xanh lá cây ô liu Chlorophyll a màu xanh lam lục Chlorophyll b màu vàng xanh

2.1.4 Tổng quan về dung môi

Trong rất nhiều trường hợp thì bản chất dung môi hữu cơ gây ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết tách Tùy vào tính chất của chất mà ta muốn phân lập mà ta chọn loại dung môi phù hợp, thông thường các chất mà ta muốn chiết có tính phân cực khác nhau ( tùy loại chất là ái dầu hay ái nước ) vì vậy mà ta lựa chọn các loại dung môi hữu cơ có

độ phân cực khác nhau Dựa trên nguyên tắc chung là các chất giống nhau sẽ hòa tan vào nhau, nghĩa là dung môi không phân cực sẽ hòa tan các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực

Dung môi có thể được chia thành hai loại: phân cực và không phân cực Nói chung, hằng số điện môi của dung môi phản ánh sơ bộ tính phân cực của dung môi Tính phân cực mạnh của nước được lấy làm chuẩn, ở 25 °C, hằng số điện môi là 78,5 Các dung môi có hằng số điện môi nhỏ hơn 15 thường được coi là không phân cực Độ phân cực, moment lưỡng cực, hệ số phân cực và liên kết hydro của một dung môi quyết định dung môi đó có thể được hòa tan với những loại hợp chất nào và có thể được trộn lẫn với những dung môi hoặc hợp chất dạng lỏng nào khác