Có nhiều các biến đổi di truyềnđược thực hiện để tạo các chủng vi khuẩn có thể chuyển gene vào dễ dàng hơncũng như giúp duy trì plasmid mà không làm thay đổi plasmid.Các tế bào thể nhận
Trang 1TRƯỜNG ĐAỊ HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCMVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
BÁO CÁO THỰC HÀNHMÔN: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 1 năm 2024NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN
Trang 31 Nguyên tắc
Chuyển gene là quá trình đưa DNA ngoại lai vào tế bào sinh vật Quá trình chuyểnplasmid vào tế bào vi khuẩn (quá trình biến nạp) không chỉ quan trọng trongnghiên cứu mà còn trong nhân bản và lưu trữ plasmid Bởi vì điều này, hầu như tấtcả các plasmid, thậm chí các plamid được thiết kế cho ứng dụng ở thực vật và độngvật, cũng đều mang vùng khởi đầu sao chép (ori) và vùng gene kháng kháng sinhdùng như một marker để chọn lọc dòng vi khuẩn Có nhiều các biến đổi di truyềnđược thực hiện để tạo các chủng vi khuẩn có thể chuyển gene vào dễ dàng hơncũng như giúp duy trì plasmid mà không làm thay đổi plasmid.
Các tế bào thể nhận sẽ tiếp nhận các đoạn DNA một cách ngẫu nhiên Không phảitất cả các loài vi khuẩn đều có khả năng tiếp nhận DNA Ngay cả những loài cókhả năng này cũng chỉ có thể tiếp nhận được DNA ở những pha sinh trưởng nhất
định và trong môi trường nuôi cấy cụ thể Các loài Streptoccocus pneumoniae và
Bacillus subtilis tương đối dễ dàng trở thành khả biến hơn, trong khi E coli phải
mất đi hai loại enzyme exonuclease và phải được nuôi cấy trong môi trường cónồng độ cao của calcium chloride để làm cho màng tế bào của nó có thể thấm đượcDNA Như vậy, những quá trình xử lý đặc biệt cũng được thực hiện nhằm gia tănghiệu quả chuyển gene ở vi khuẩn và làm chúng nhạy cảm hơn dưới tác động củacác chất hoá học hay dòng điện trong kỹ thuật chuyển gene Những tế bào vi khuẩnnày được gọi là tế bào khả nạp (competent cells).
Qua quá trình biến nạp, một dòng vi khuẩn bị biến đổi di truyền do tiếp nhận DNAngoại lai Để chọn lọc được các dòng vi khuẩn chuyển gene, các môi trường nuôicấy chứa chất kháng sinh tương ứng với gene kháng kháng sinh trên vector dùngtrong quá trình chuyển gene thường được sử dụng Các khuẩn lạc hình thành trênmôi trường có kháng sinh có xác suất cao chứa vector Ngoài ra, chọn lọc xanh
trắng (blue-white screening) dựa vào vùng gene lacZ mã hoá enzyme
beta-galactosidase trên một số vector cũng được sử dụng giúp chọn lọc dòng vi khuẩnmang vector chứa insert Trong trường hợp chèn đoạn gen, khuẩn lạc có màu trắng;không chèn đoạn gen, khuẩn lạc có màu xanh.
Giới thiệu vi khuẩn E.coli
Escherichia coli, còn được gọi là E coli, là vi khuẩn coliform Gram âm, kỵ khí
tùy nghi, hình que, thuộc chi Escherichia Vi khuẩn thường gặp ở đoạn dưới ốngtiêu hóa của các sinh vật máu nóng Hầu hết các chủng E coli đều vô hại, nhưng
một số serotype như EPEC, ETEC, v.v có thể gây ngộ độc thực phẩm nghiêmtrọng cho vật chủ và đôi khi là nguyên nhân gây ra các sự cố ô nhiễm thựcphẩm khiến sản phẩm bị thu hồi Hầu hết các chủng không gây bệnh cho người và
Trang 4là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường; những chủng như vậy là vôhại hoặc thậm chí có lợi cho con người.
Cấu trúc
Bộ gen của vi khuẩn E.coli
Trang 5Trình tự DNA hoàn chỉnh đầu tiên của bộ gen E coli (chủng K-12 dẫn xuất
MG1655 trong phòng thí nghiệm) được công bố vào năm 1997 Đó là phântử DNA dạng vòng dài 4,6 triệu cặp base, chứa 4288 gen mã hóa protein (nằmtrong 2584 operon), 7 operon RNA ribosome (rRNA) và 86 gen RNA vận
chuyển (tRNA) Mặc dù bộ gen E coli được phân tích di truyền chuyên sâu trong
khoảng 40 năm, tuy nhiên nhiều gen trong số này chưa được biết đến Mật độ mãhóa rất cao, với khoảng cách trung bình giữa các gen chỉ là 118 cặp base Bộ gencó chứa một số lượng đáng kể gen nhảy, vùng lặp lại, thể tiền thực
khuẩn (prophage) và tàn tích của thể thực khuẩn.
Đường cong tăng trưởng
Trang 6Giải thích đường cong sinh trường trong nuôi cây liên tục:
- Ở pha tiềm phát (pha lag), đường cong sinh trường thể hiện số lượng tế bào lúcbắt đầu nuôi cấy lúc này các tế bào vi sinh vật bắt đầu thích nghi với môi trườngnên số lượng tế bào sống bàng tế bào chết đi.
- Ở pha lũy thừa (pha log) đường cong sinh trường tăng do mặt độ bắt đầu tăng, vàđạt cực đại tại cuối pha Trong pha này, các tế bào đã thích nghi được với môitrường nên số lượng tế bao sinh ra nhiều hơn so với tế bào chết đi.
- Ở pha cân bằng, đường cong sinh trường hầu như thẳng do mật độ hầu như khôngthay đổi Lúc này dinh dưỡng bắt đầu thiếu hụt dần nên số lượng tế bào sinh rabằng số lượng tế bào chết.
- Ở pha suy vong, đường cong sinh trưởng giảm xuống do dinh dưỡng cạn kiệtđồng thời các chất độc hại cho sự sinh trường của quần thể được tích lũy nên sốlượng tế bào chết đi lớn hơn số lượng tế bào sinh ra làm mật độ tế bào suy giảm.
Thời gian của từng pha đối với vi khuẩn E.coli: pha lag kéo dài khoảng 2 giờ, phasinh trưởng kéo dài từ 2-14 giờ, pha cân bằng duy trì từ 14-20 giờ và cuối cùng làpha chết.
2 Vật liệu và dụng cụ thực hành2.1 Vật liệu
- E.coli DH5 – alpha: 1500 µl- Xgal 100 mM: 1500 µl
- Dung dịch CaCl2 100 mM: 75 ml- Glycerol 100%: 75 ml
- Môi trường LB Agar: 900 ml + Pepton: 9 g
+ Cao nấm men: 4.5 g + NaCl: 9g
+ Agar: 22.5 g
- Môi trường LB lỏng: 450 ml + Pepton: 4.5 g
+ Cao nấm men: 2.25 g + NaCl: 4.5 g
+ Ampicillin (50 µg/ml tăng lên 100 µg/ml): 0.045 g hoặc 0.3 ml
2.2 Dụng cụ
STTTên dụng cụ thiết bịĐơn vị tínhSố lượngGhi chú
Trang 71Micropipette 20 µlCái1
3.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp (competent cells) E.coli DH5-alpha
Cấy vi khuẩn E coli vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường LB
Trang 8không có kháng sinh.Nuôi cấy lắc với tốc độ 150 rpm ở 37oC trong
thời gian 16-20 giờ.
Hút lần lượng 1 mL dịch vi khuẩn sang eppendorf Ly tâm ở tốc độ 8000 rpm trong 2 phút,
Ủ eppendorf trong đá 20 phút Ly tâm dịchvi khuẩn ở 8000 rpm trong 2 phút
Bổ sung 1 mL dung dịch CaCl2 100 mM lạnh vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn,
loại bỏ dịch nổi để thu nhận sinh khối vi khuẩn - Bổ sung 1mL dung dịch MgCl2 100 mM lạnh vào
eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn,
Ủ eppendorf trong đá 5 phút Ly tâm dịch vi khuẩn ở8000 rpm trong 2 phút,
loại bỏ dịch nổi để thu nhận sinh khối vi khuẩn
loại bỏ dịch nổi để thu nhận sinh khối vikhuẩn.
Bổ sung 500 µl hỗn hợp dung dịch CaCl2 và glycerol lạnh
(85% CaCl2 100 mM và 15% glycerol 100%, v/v vortex để huyền phù
Bảo quản các ống vi khuẩn ở nhiệt độ 80oC.
-Hút chuyển lần lượt 100 µl dung dịch vi khuẩn vào các eppendorf lạnh vô trùng.
Trang 93.2 Quy trình chuyển gene vào tế bào vi khuẩn khả nạp
Giải đông vi khuẩn
Bổ sung plasmid DNA vào eppendorf vi khuẩn đãgiải đông
Đặt ống eppendorf chứa hỗn hợp biến nạp vàođá
Trang 10Nuôi ủ ở 37°C quađêm
Cấy chuyền vào ống nghiệm thạch nghiêng (môi trường LB agar)
Chọn lọc 10 dòng vi khuẩn từ các khuẩn lạc rờiCấy trải vào đĩa petri
(môi trường LB agar bổ sung kháng sinh)Thời gian 45 phút
để vk mã hóa protein trong đó có enzyme kháng kháng sinh từ plasmid mới chuyển vào
Bổ sung môi trường LB vào, ủ trên máy lắc ở37°C trong 45 phút 150rmp
5 phútĐặt eppendorf trở lại vào trong đá
42°C trong 60sThực hiện shock nhiệt trong bể ổn nhiệtĐể 20-30 phút