báo cáo thực hành môn kỹ thuật di truyền bài 1 chuyển gene vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp shock nhiệt

Có nhiều các biến đổi di truyềnđược thực hiện để tạo các chủng vi khuẩn có thể chuyển gene vào dễ dàng hơncũng như giúp duy trì plasmid mà không làm thay đổi plasmid.Các tế bào thể nhận

TRƯỜNG ĐAỊ HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN: KỸ THUẬT DI TRUYỀN

SHOCK NHIỆT

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Dũng

Tổ thực hiện: tổ 2 Lớp: DHSH17A

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 1 năm 2024 NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN

SHOCK NHIỆT

1 Nguyên tắc

Chuyển gene là quá trình đưa DNA ngoại lai vào tế bào sinh vật Quá trình chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn (quá trình biến nạp) không chỉ quan trọng trong nghiên cứu mà còn trong nhân bản và lưu trữ plasmid Bởi vì điều này, hầu như tất

cả các plasmid, thậm chí các plamid được thiết kế cho ứng dụng ở thực vật và động vật, cũng đều mang vùng khởi đầu sao chép (ori) và vùng gene kháng kháng sinh dùng như một marker để chọn lọc dòng vi khuẩn Có nhiều các biến đổi di truyền được thực hiện để tạo các chủng vi khuẩn có thể chuyển gene vào dễ dàng hơn cũng như giúp duy trì plasmid mà không làm thay đổi plasmid

Các tế bào thể nhận sẽ tiếp nhận các đoạn DNA một cách ngẫu nhiên Không phải tất cả các loài vi khuẩn đều có khả năng tiếp nhận DNA Ngay cả những loài có khả năng này cũng chỉ có thể tiếp nhận được DNA ở những pha sinh trưởng nhất

định và trong môi trường nuôi cấy cụ thể Các loài Streptoccocus pneumoniae và

Bacillus subtilis tương đối dễ dàng trở thành khả biến hơn, trong khi E coli phải

mất đi hai loại enzyme exonuclease và phải được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ cao của calcium chloride để làm cho màng tế bào của nó có thể thấm được DNA Như vậy, những quá trình xử lý đặc biệt cũng được thực hiện nhằm gia tăng hiệu quả chuyển gene ở vi khuẩn và làm chúng nhạy cảm hơn dưới tác động của các chất hoá học hay dòng điện trong kỹ thuật chuyển gene Những tế bào vi khuẩn này được gọi là tế bào khả nạp (competent cells)

Qua quá trình biến nạp, một dòng vi khuẩn bị biến đổi di truyền do tiếp nhận DNA ngoại lai Để chọn lọc được các dòng vi khuẩn chuyển gene, các môi trường nuôi cấy chứa chất kháng sinh tương ứng với gene kháng kháng sinh trên vector dùng trong quá trình chuyển gene thường được sử dụng Các khuẩn lạc hình thành trên môi trường có kháng sinh có xác suất cao chứa vector Ngoài ra, chọn lọc xanh

trắng (blue-white screening) dựa vào vùng gene lacZ mã hoá enzyme

beta-galactosidase trên một số vector cũng được sử dụng giúp chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector chứa insert Trong trường hợp chèn đoạn gen, khuẩn lạc có màu trắng; không chèn đoạn gen, khuẩn lạc có màu xanh

Giới thiệu vi khuẩn E.coli

Escherichia coli, còn được gọi là E coli, là vi khuẩn coliform Gram âm, kỵ khí

tùy nghi, hình que, thuộc chi Escherichia Vi khuẩn thường gặp ở đoạn dưới ống tiêu hóa của các sinh vật máu nóng Hầu hết các chủng E coli đều vô hại, nhưng

một số serotype như EPEC, ETEC, v.v có thể gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng cho vật chủ và đôi khi là nguyên nhân gây ra các sự cố ô nhiễm thực phẩm khiến sản phẩm bị thu hồi Hầu hết các chủng không gây bệnh cho người và

là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường; những chủng như vậy là vô hại hoặc thậm chí có lợi cho con người

Cấu trúc

Bộ gen của vi khuẩn E.coli

Trình tự DNA hoàn chỉnh đầu tiên của bộ gen E coli (chủng K-12 dẫn xuất

MG1655 trong phòng thí nghiệm) được công bố vào năm 1997 Đó là phân

tử DNA dạng vòng dài 4,6 triệu cặp base, chứa 4288 gen mã hóa protein (nằm trong 2584 operon), 7 operon RNA ribosome (rRNA) và 86 gen RNA vận

chuyển (tRNA) Mặc dù bộ gen E coli được phân tích di truyền chuyên sâu trong

khoảng 40 năm, tuy nhiên nhiều gen trong số này chưa được biết đến Mật độ mã hóa rất cao, với khoảng cách trung bình giữa các gen chỉ là 118 cặp base Bộ gen

có chứa một số lượng đáng kể gen nhảy, vùng lặp lại, thể tiền thực

khuẩn (prophage) và tàn tích của thể thực khuẩn.

Đường cong tăng trưởng

Giải thích đường cong sinh trường trong nuôi cây liên tục:

- Ở pha tiềm phát (pha lag), đường cong sinh trường thể hiện số lượng tế bào lúc bắt đầu nuôi cấy lúc này các tế bào vi sinh vật bắt đầu thích nghi với môi trường nên số lượng tế bào sống bàng tế bào chết đi

- Ở pha lũy thừa (pha log) đường cong sinh trường tăng do mặt độ bắt đầu tăng, và đạt cực đại tại cuối pha Trong pha này, các tế bào đã thích nghi được với môi trường nên số lượng tế bao sinh ra nhiều hơn so với tế bào chết đi

- Ở pha cân bằng, đường cong sinh trường hầu như thẳng do mật độ hầu như không thay đổi Lúc này dinh dưỡng bắt đầu thiếu hụt dần nên số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng tế bào chết

- Ở pha suy vong, đường cong sinh trưởng giảm xuống do dinh dưỡng cạn kiệt đồng thời các chất độc hại cho sự sinh trường của quần thể được tích lũy nên số lượng tế bào chết đi lớn hơn số lượng tế bào sinh ra làm mật độ tế bào suy giảm

Thời gian của từng pha đối với vi khuẩn E.coli: pha lag kéo dài khoảng 2 giờ, pha sinh trưởng kéo dài từ 2-14 giờ, pha cân bằng duy trì từ 14-20 giờ và cuối cùng là pha chết

2 Vật liệu và dụng cụ thực hành

2.1 Vật liệu

- E.coli DH5 – alpha: 1500 µl

- Xgal 100 mM: 1500 µl

- Dung dịch CaCl2 100 mM: 75 ml

- Glycerol 100%: 75 ml

- Môi trường LB Agar: 900 ml

+ Pepton: 9 g

+ Cao nấm men: 4.5 g

+ NaCl: 9g

+ Agar: 22.5 g

- Môi trường LB lỏng: 450 ml

+ Pepton: 4.5 g

+ Cao nấm men: 2.25 g

+ NaCl: 4.5 g

+ Ampicillin (50 µg/ml tăng lên 100 µg/ml): 0.045 g hoặc 0.3 ml

2.2 Dụng cụ

STT Tên dụng cụ thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

1 Micropipette 20 µl Cái 1

3 Tiến hành thí nghiệm

3.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp (competent cells) E.coli DH5-alpha

Cấy vi khuẩn E coli vào ống nghiệm chứa 10

mL môi trường LB

không có kháng sinh.

Nuôi cấy lắc với tốc độ 150 rpm ở 37oC trong

thời gian 16-20 giờ.

Hút lần lượng 1 mL dịch vi khuẩn sang eppendorf

Ly tâm ở tốc độ 8000 rpm trong 2 phút,

Ủ eppendorf trong đá 20 phút Ly tâm dịch

vi khuẩn ở 8000 rpm trong 2 phút

Bổ sung 1 mL dung dịch CaCl2 100 mM lạnh

vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn,

loại bỏ dịch nổi để thu nhận sinh khối vi khuẩn

- Bổ sung 1mL dung dịch MgCl2 100 mM lạnh vào

eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn,

Ủ eppendorf trong đá 5 phút Ly tâm dịch vi khuẩn ở

8000 rpm trong 2 phút,

loại bỏ dịch nổi để thu nhận sinh khối vi khuẩn

loại bỏ dịch nổi để thu nhận sinh khối vi

khuẩn.

Bổ sung 500 µl hỗn hợp dung dịch CaCl2 và

glycerol lạnh

(85% CaCl2 100 mM và 15% glycerol 100%, v/v vortex để huyền phù

Bảo quản các ống vi khuẩn ở nhiệt độ

-80oC.

Hút chuyển lần lượt 100 µl dung dịch vi

khuẩn vào các eppendorf lạnh vô trùng.

3.2 Quy trình chuyển gene vào tế bào vi khuẩn khả nạp

nhiệt

Giải đông vi khuẩn

Bổ sung plasmid DNA vào eppendorf vi khuẩn đã

giải đông

Đặt ống eppendorf chứa hỗn hợp biến nạp vào

đá

Nuôi ủ ở 37°C qua

đêm

Cấy chuyền vào ống nghiệm thạch nghiêng

(môi trường LB agar)

Chọn lọc 10 dòng vi khuẩn từ các khuẩn lạc rời

Cấy trải vào đĩa petri (môi trường LB agar bổ sung kháng sinh)

Thời gian 45 phút

để vk mã hóa

protein trong đó

có enzyme kháng

kháng sinh từ

plasmid mới

chuyển vào

Bổ sung môi trường LB vào, ủ trên máy lắc ở

37°C trong 45 phút 150rmp

5 phút

Đặt eppendorf trở lại vào trong đá

42°C trong 60s Thực hiện shock nhiệt trong bể ổn nhiệtĐể 20-30 phút

4 Những điểm cần lưu ý

Chỉ lấy eppendorf chứa vi khuẩn khả nạp bảo quản ở -80°C ra khỏi tủ đông khi bắt đầu

sử dụng.

Hỗn hợp vi khuẩn khả nạp và plasmid được đảo trộn nhẹ nhàng bằng micropipette, không sử dụng vortex.

Thời gian shock nhiệt cần theo dõi chính xác bằng đồng hồ bấm giờ Trách rung lắc mạnh eppendorf chứa hỗn hợp vi khuẩn khả nạp và plasmid sẽ làm giảm hiệu quả biến nạp.