Báo cáo thực hành chiều thứ 4 nhóm 3

Đặt vấn đề Vi khuẩn Pantoea stewartii là một loại vi khuẩn nguy hiểm, gây bệnh lây truyền qua thực vật vì vậy nghiên cứu về chúng qua những kỹ thuật phân tử như phảnứng PCR Polymerase Ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TP Thủ Đức, 11/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SHPT

PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

NGUYỄN LAN ANHNGUYỄN THỊ LAN ANHNGÔ NGỌC HẢI

211260092112601421126324

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hiện 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 2

2.1.1 Định nghĩa 2

2.1.2 Nguyên lý hoạt động 2

2.1.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 2

2.1.4 Xây dựng phản ứng PCR 3

2.1.5 Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR 5

2.2 Giới thiệu về điện di 5

2.2.1 Định nghĩa 5

2.2.2 Thành phần điện di 5

2.2.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose 6

2.2.4 Phương pháp điện di 7

2.2.5 Các vấn đề cần lưu ý khi điện di 7

2.3 Giới thiệu về Pantoea stewartii 8

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12

3.2 Vật liệu 12

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 12

3.3 Phương pháp nghiên cứu 12

3.3.1 Ly trích DNA 12

3.3.2 PCR 16S RNA xác định vi khuẩn 13

3.3.3 PCR với mồi Pantoea stewartii với primer chuyên biệt tự thiết kế 13

3.3.4 PCR với mồi Pantoea stewartii với primer bài báo (EsHo – ESOG2C) 14

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Kết quả và thảo luận nội dung 1: Kiểm tra chất lượng mẫu DNA 16

4.2 Kết quả và thảo luận nội dung 2: PCR 16S RNA xác định vi khuẩn 16

4.3 Kết quả nội dung 3: PCR với mồi Pantoea stewartii tự thiết kế 16

4.4 Kết quả nội dung 4: PCR với mồi Pantoea stewartii EsHo – ESOG2C 17

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 13 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR buổi 4 14 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR buổi 5 15

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Kết quả chạy PCR 16S 16 Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với mồi Pantoea stewartii tự thiết kế 16 Hình 4.3 Kết quả chạy PCR với mồi Pantoea stewartii EsHo – ESOG2C 17

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn Pantoea stewartii là một loại vi khuẩn nguy hiểm, gây bệnh lây

truyền qua thực vật vì vậy nghiên cứu về chúng qua những kỹ thuật phân tử như phảnứng PCR (Polymerase Chain Reaction) vùng 16S ribosome và kỹ thuật điện di trên gelagarose là một chủ đề rất cấp thiết trong lĩnh vực y học

Trước đây, việc xác định loại vi khuẩn Pantoea stewartii thông qua phương

pháp truyền thống mất nhiều thời gian và không đảm bảo tính chính xác Do đó, việc

áp dụng phương pháp PCR vùng 16S ribosome sẽ giúp nâng cao độ chính xác và giảmthiểu thời gian phân tích

1.2 Mục tiêu thực hiện

Thu nhận DNA tinh sạch từ DNA vi khuẩn, khuếch đại đoạn DNA mục tiêubằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và điện di để định tính mẫu có mang gen cầntìm

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích tác nhân gây bệnh

Nội dung 2: Điện di DNA tổng số và chạy primer 16S

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR với primer chuyên biệt tự thiết kế.

Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với primer bài báo (ESHO – ESOG2C)

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

2.1.1 Định nghĩa

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) là kỹ thuật chophép khuếch đại một đoạn gen trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt Dựa vàocác thành phần phản ứng cần thiết, đoạn gen mục tiêu sẽ được nhân bản ra hàng triệubản sao giống nhau, từ đó phục vụ những mục đích nghiên cứu tiếp theo Đây đượcxem là một quá trình cơ bản cho việc phát triển của hàng loạt công nghệ phân tích gen

và hệ gen sau này

Kỹ thuật PCR được nhà hóa sinh học người Hoa Kỳ Kary Mullis (1944-2019)phát triển vào năm 1985 dựa trên ý tưởng muốn xây dựng một quy trình giúp đoạnDNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ phản ứng thôngqua xúc tác của enzyme DNA polymerase Ý tưởng này được ấp ủ khi ông muốnkhuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật

sống như vi khuẩn E coli hay nấm men để tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn, sau

đó sử dụngcác cặp mồi bổ sung để bắt cặp với mạch đơn, tái bản nhờ enzyme DNApolymerase

Với y học hiện đại ngày nay, xét nghiệm sinh học phân tử PCR đang được ứngdụng rộng rãi trong chẩn đoán và chữa bệnh Nổi bật là ứng dụng của PCR trong chẩnđoán các bệnh đặc hiệu liên quan tới virus mà các xét nghiệm truyền thống không thểchẩn đoán hoặc chẩn đoán cho kết quả không chính xác

2.1.2 Nguyên lý hoạt động

Nguyên lý hoạt động của máy PCR là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từDNA khuôn ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàngtriệu bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệucho đoạn DNA này

2.1.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Hiện nay, kỹ thuật PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ yhọc, cổ sinh vật học đến pháp y Một trong những ứng dụng phổ biến nhất của PCR

là trong lĩnh vực khoa học pháp y Trước khi ra đời kỹ thuật PCR, một mẫu ADN nhỏ

có thể không đủ để thực hiện xét nghiệm chính xác và đưa ra kết luận chắc chắn

Tuy nhiên, bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR, các nhà nghiên cứu có thể tạo đủlượng ADN để xác định hài cốt từ các vụ tai nạn hay thảm họa trong quá khứ Tương

tự, các mẫu ADN nhỏ được phục hồi từ hiện trường vụ án có thể được sao chép bằngPCR và sau đó được kiểm tra để xác định hoặc giúp loại trừ các nghi phạm

Trong y học hiện đại, PCR đã trở thành một công cụ quan trọng trong lĩnh vựcnghiên cứu ung thư PCR được sử dụng để phát hiện một số bệnh ung thư do virus gây

ra như ung thư cổ tử cung (gây ra bởi virus u nhú ở người - HPV), ung thư da, ung thưmiệng Một ứng dụng y tế quan trọng khác của PCR là trong quy trình phân loại mô đểxem xét khả năng tương hợp giữa mô người hiến tạng và những bệnh nhân cần trải quacấy ghép nội tạng; lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân, xét nghiệmquan hệ di truyền; xác định sớm các bệnh truyền nhiễm cũng như theo dõi sự lây lancủa các bệnh truyền nhiễm ở người hoặc động vật Ngoài ra, PCR có thể xác định cảnhiễm nấm và ký sinh trùng (có thể phát hiện nhiễm HIV ngay cả trước khi bất kỳkháng thể nào được tạo ra) Khuếch đại DNA cũng được sử dụng thường xuyên

để sàng lọc máu được hiến nhằm ngăn máu nhiễm bệnh xâm nhập vào ngân hàng máu

Trong lĩnh vực cổ sinh vật học, PCR được sử dụng để khếch đại những mẫu vậtADN tồn tại trong các mô trên một trăm ngàn năm tuổi Kỹ thuật này có thể được sửdụng trên các mẫu mô xác ướp, hệ thực vật và động vật cổ đại, hoặc các hóa thạch Do

đó, việc sử dụng PCR trong lĩnh vực này giúp chúng ta xác định và tìm hiểu về cácsinh vật hiện đã tuyệt chủng cùng các quá trình hóa thạch và tiến hóa

Kỹ thuật PCR còn tỏ ra hữu ích trong một số khía cạnh của vi sinh vật môitrường Chúng được sử dụng để giúp phát hiện, xác định vi khuẩn và mầm bệnh có hạitrong nguồn nước công cộng; phát hiện các vi sinh vật thoái hóa, nơi chất thải độc hại

và sự cố ô nhiễm đã xảy ra

Tại Việt Nam, PCR và các kỹ thuật dựa trên nền tảng PCR đang được ứng dụngphổ biến trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như y học (phát hiện bệnh ditruyền, nhận dạng vân tay DNA và xác định huyết thống), nông nghiệp (chọn dòng cáthể lai nhờ chỉ thị phân tử, xác định bệnh và kiểm định giống),

2.1.4 Xây dựng phản ứng PCR

2.1.4.1 Thành phần phản ứng PCR

Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR (tổng thể tích dao động khoảng20-50 µl) bao gồm:

i) Sợi khuôn DNA (chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạncần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide)

ii) Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA (mồi dàikhoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhautheo nguyên tắc bổ sung)

iii) Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP

iv) Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzymeRNase và ADNse

v) Enzyme chịu nhiệt Taq

2.1.4.2 Xây dựng phản ứng PCR

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

Giai đoạn biến tính: nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, các liên kết hydro sẽ bị phá

vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ được hạ xuống 55 – 65oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp

bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ được đưa lên 72oC, Taq polymerase sẽ sử dụngdNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung

Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi Nếu chu kỳnhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao Số lượng bảnsao DNA khổng lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (ví dụ EthidiumBromide) có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV

2.1.4.3 Chương trình nhiệt của phản ứng PCR

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ và được lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kỳđược diễn ra theo 3 bước:

Bước 1: biến tính tách đôi sợi DNA: được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độnóng chảy của phân tử (94 – 95oC) trong vòng 30 - 60 giây Lúc này, phân tử DNAmạch kép sẽ được tách thành hai mạch đơn (đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổnghợp hai mạch bổ sung mới)

Bước 2: bắt cặp mồi: được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn so với nhiệt độ nóngchảy (Tm) của các Primer, nhiệt độ dao động trong khoảng 55 – 65oC Thời gian bắtcặp kéo dài từ 30 - 60 giây tùy vào Tm của các primer.

Bước 3: kéo dài: được thức hiện ở nhiệt độ 72oC giúp cho DNA polymerase cómôi trường hoạt động tốt nhất Lúc này, dưới tác động của DNA polymerase, cácnucleotide sẽ lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thờigian kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNAkhuếch đại

2.1.5 Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR

Trong phản ứng PCR, chúng ta thường dựa vào các bộ kit hoá chất thương mại

có khả năng mang lại năng suất tối ưu cùng với quy trình nhanh hơn Tuy nhiên, việcchuẩn bị mẫu, cũng như các thiết bị và vật tư tiêu hao trong quy trình làm PCR sẽ ảnhhưởng đến kết quả phản ứng theo những cách không được đánh giá thường xuyên Vìvậy, một số giải pháp đã được đưa ra nhằm cải thiện và tăng tốc độ của phản ứng PCRnhư tối ưu hóa các kết quả PCR thông qua các điều chỉnh thiết kế mồi, thành phần củahỗn hợp PCR master mix hoặc quy trình chuẩn bị mẫu; sự kết nối của nhiệt độ biếntính và nhiệt độ gắn mồi cũng như thời gian kéo dài chuỗi có thể rất quan trọng đối vớilượng DNA cụ thể, độ tinh khiết và chất lượng của nó

Khi thực hiện phản ứng PCR phải hạn chế tối đa tạo bọt vì bọt cản trở tiếp xúccủa các thành phần trong phản ứng PCR, gây sai lệch kết quả

Với các mẫu có lượng DNA nhiều thì nên pha loãng để tạo khoảng trống chocác bản sao DNA được nhân bản Mẫu có DNA quá nhiều sẽ làm ảnh hưởng đến kếtquả điện di; mẫu chứa ít DNA thì kết quả sau khi điện di không thể hiện rõ, gây nhầmlẫn là âm tính

2.2 Giới thiệu về điện di

2.2.1 Định nghĩa

Điện di ngang trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được

sử dụng chủ yếu để phân tách DNA trong mẫu dựa trên kích thước, kỹ thuật này cũngđược sử dụng để phân tách RNA hoặc protein

2.2.2 Thành phần điện di

Phân tử DNA được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khungsườn (backbone) từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate Theo cấu trúc này,

mỗi một nucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỷ

lệ thuận với khối lượng (mass-to-charge) Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điệntrường có thể khiến DNA di chuyển về phía điện cực dương

2.2.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose

Dung dịch đệm TBE (Tris-borate-EDTA) là đệm được sử dụng phổ biến nhấttrong điện di các phân tử DNA và RNA Đệm TBE giúp giữ ổn định pH qua đó giữ ổnđịnh sự tích điện của phân tử axit nucleic Do đó, sự phân tách phân tử ADN trongđiện di bởi kích thước phân tử của nó Ngoài sử dụng để chạy điện di, TBE còn được

sử dụng để tạo gel Do đó việc lựa chọn dung dịch TBE là quan trọng để đảm kết quảcủa điện di Đệm TBE thường được sử dụng với các đoạn DNA nhỏ, vì nó cung cấpkhả năng phân tách tốt hơn cho các kích thước <1 kb

Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate EDTA) có khả năng đệm tốt hơn vì trongTBE có chứa borate, chất này ức chế các enzyme nên các sản phẩm sau điện di cầnđược phân lập cho các ứng dụng liên quan đến enzyme thì dung dịch đệm TAE là lựachọn tốt hơn Đệm TAE thường được sử dụng để điện di các đoạn acid nucleic >1 kbnhờ gốc acetate Tương thích với các phản ứng enzyme và được khuyên dùng cho điện

di gel

2.2.3.2 Agarose

Agarose là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích thước lỗgel lớn, thích hợp cho phân tách các phân tử DNA có kích thước lớn và điện di dựa

Thông thường gel có nồng độ agarose cao thì kích thước lỗ càng nhỏ, do đó cóthể phân tách phân tử có khối lượng nhỏ hơn trong khi gel có nồng độ agarose thấp sẽphân tách được phân tử có khối lượng lớn hơn Phạm vi phân tách hiệu quả của gelagarose với nồng độ agarose khác nhau Ngoài ra đảm bảo sử dụng cùng bộ đệm với

bộ đệm trong bể điện di (không trộn lẫn các bộ đệm khác nhau và không sử dụngnước)

đó protein không tích điện gọi là pH đẳng điện hay pHi Nếu pH môi trường lớn hơnpHi, protein sẽ mang điện âm và sẽ di chuyển về phía cực dương Nếu pH môi trườngnhỏ hơn pHi, protein mang điện dương và di chuyển về phía cực âm Khi pH môitrường bằng pH, trung hòa về điện nên sẽ không di chuyển trong điện trường

Các phân tử tích điện khác như DNA, RNA cũng điện di theo nguyên tắc trên

Ở môi trường pH ≥ 8, DNA tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện nó sẽ di chuyển

2.2.5 Các vấn đề cần lưu ý khi điện di

Chọn tỷ lệ agarose để điện di cho phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại.Trung bình nhất là dùng tỷ lệ 2% Đối với các sản phẩm khuếch đại lớn trên 500bps thìnên dùng agarose 1.5%, còn đối với các sản phẩm khuếch đại kích thước dưới 100bpsthì nên dùng agarose trên 2.5%

Khi pha gel agarose cần làm tan hoàn toàn agarose trong đệm điện di bằng cáchlắc trộn để agarose hòa đều trong dung dịch đệm Trước khi đổ agarose vào khuôn,

phải đảm bảo khuôn nằm trên mặt phẳng nằm ngang kiểm tra bằng bóng khí để bề dàycủa agarose thật sự dày đều như nhau và kết quả điện di sẽ chính xác hơn.

Thể tích mẫu cho vào giếng không nên quá ít mà phải từ 15l trở lên để có thểphát hiện được các kết quả dương tính yếu Khi điện di cần đối chứng dương là thangDNA để xác định kích thước của các vạch điện di trong các mẫu, kiểm soát chất lượngcủa điện di

Gel agarose thường được đổ với độ dày từ 0,5 đến 1 cm Khi miếng gel quá dày

sẽ cho ra hình ảnh không đẹp; đối với miếng gel quá mỏng, khi bơm mẫu vào giếng cóthể tràn giếng gây sai lệch về kết quả thực tế

2.3 Giới thiệu về Pantoea stewartii

Pantoea stewartii là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, gram âm, không di động, không tạo

bào tử, có kích thước 0,4 - 0,8 x 0,9 - 2,2 µm, với hai phân loài chính là P stewartii

subsp stewartii và P stewartii subsp indologenes P stewartii subsp stewartii phát

triển ở 4°C hoặc 37°C, không phát triển ở 41°C, tạo khuẩn lạc màu vàng lồi trên môitrường thạch chiết xuất nấm men - dextrose - canxi cacbonat, hoặc màu vàng cam trênthạch dinh dưỡng - glucose Loại này không sinh indole, không thủy phân esculin,không tăng trưởng trên citrate, mucate và không tạo axit từ các đường như cellobiose,maltose, lactose, salicin Các axit béo chính bao gồm axit octadecenoic (C18:1), axithexadecanoic (C16:0), và axit cis-9-hexadecenoic (C16:1)

Trong khi đó, P stewartii subsp indologenes có thể phát triển ở 41°C hoặc

44°C, sinh indole, thủy phân esculin, tăng trưởng trên cis-aconitate, meso-tartate và