Báo cáo thực hành kĩ thuật sắc ký nâng cao nhóm 4 thứ 4 ca 1

Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau .... 8 2.2.1 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau .... Thiết bị bao gồm một hệ thốn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

MỤC LỤC

Trang

Mục lục i

Mục lục hình iii

Mục lục bảng iv

Chương 1 Tổng quan tài liệu 5

1.1 Đối tượng nghiên cứu 5

1.1.1.Lá điều 5

1.1.2.Lá sài đất 6

1.2.Phương pháp nghiên cứu 7

1.2.1.Sắc kí lỏng: 7

1.2.2.Sắc kí bản mỏng: 7

Chương 2 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 8

2.1 Chuẩn bị thí nghiệm 8

2.2 Các bước tiến hành 8

2.2.1 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 8

2.2.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu 9

2.3 Kết quả 9

2.3.1 Hiệu suất chiết chất chiết thô 9

2.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu 10

Chương 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký cột 12

3.1 Chuẩn bị thí nghiệm 12

3.2 Các bước tiến hành 12

3.2.1 Chuẩn bị dịch chiết 12

3.2.2 Chuẩn bị cột 12

3.2.3 Đưa mẫu vào cột 13

3.3 Kết quả và thảo luận 13

3.3.1 Kết quả 13

3.3.2 Thảo luận 14

Chương 4: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật TLC 15

4.1 Chuẩn bị thí nghiệm 15

4.2 Các bước tiến hành 15

4.3 Kết quả và thảo luận 15

4.3.1 Kết quả 15

4.3.2 Thảo luận 17

Chương 5 Bài tập 18

Tài liệu tham khảo 23

MỤC LỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Lá điều 5

Hình 1.2 Lá sài đất 6

Hình 2.1 Mẫu lá điều 8

Hình 2.2 Bình đựng đựng mẫu chứa dung môi 8

Hình 2.3 Bã rắn và giấy lọc sau khi được sấy khô 9

Hình 3.1 Mẫu lá sài đất 12

Hình 3.2 Đưa mẫu vào cột 13

Hình 3.3 Nhóm Carotenoid 13

Hình 3.4 Nhóm diệp lục tố 14

Hình 4.1 Kết quả bản mỏng TLC khi chiếu đèn UV 15

Hình 4.2 Kết quả bản mỏng TLC ở điều kiện thường 16

Hình 5.1 Đồ thị chất chuẩn Protocatechuic acid 20

Hình 5.2 Đồ thị chất chuẩn Chlorogenic acid 21

Hình 5.3 Đồ thị chất chuẩn Caffeic acid 21

MỤC LỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Kết quả phân tích độ ẩm trong mẫu lá điều 10

Bảng 5.1 Số liệu chất chuẩn Protocatechuic acid 20

Bảng 5.2 Số liệu đồ thị chất chuẩn Chlorogenic acid 20

Bảng 5.3 Số liệu đồ thị chất chuẩn Caffeic acid 21

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Lá điều

Cây điều có tên khác: Đào lộn hột, giả như thụ, cây đào Tên nước ngoài: Cashew nut, cashew apple (Anh); anacardier, pomme de Cajou, acajou à fruit, acajou à pommes (tiếng Pháp).Họ: Đào lộn hột ( Anacardiaceae).Cây nhỡ hay cây to, cao 8-10cm Cành hình tru, nhân Lá mọc so le, có phiến dày và dai, hình trứng ngược, dài 8-12cm, rộng 5-7cm, gốc thuôn, đầu bằng đôi khi hơi lõm, hai mạt nhân, cuống lá mập dài 1- 1,5cm Cụm hoa mọc ở dầu cành thành chùm ngủ phân nhánh, dài hơn lá; hoa nhỏ màu vàng nhạt, điểm nâu dỏ, dài hợp 5 răng hẹp nhọn; tràng 5 cánh dài bằng hoặc dài hơn lá dài, mọc cong xuống, nhị 8 - 10, bầu hình thận.Quả hạch, hình thận cứng (thường nhằm là hạt lộn ra ngoài) đính vào phần phình to hình quả lê (chính là cuống quả hay quả giả), phần này có màu vàng hoặc đỏ khi chín.Mùa hoa: tháng 12 - tháng 2 Mùa quả: tháng 3-6

Hình 1.1 Lá điều

Chi Anacardium L có 8 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Cây điều có nguồn gốc ở vùng Đông Bắc Braxin, sau được trống rộng rãi ở các nước vùng Trung và Nam Mỹ Vào kh thế kỷ 17, người Bồ Đào Nha du nhập cây diều vào Philippin, Ấn Độ và Đông Phi, sau đến Srilanca, Malaysia, Indonesia và một số nước khác Ở Việt Nam, cây điều được trồng nhiều ở các tỉnh miền Đông như Bình Dương, Bình Phước, Sông Bé, Tây Ninh, Đồng Nai, một số tỉnh Tây Nguyên và miền Trung Cây không trống được ở các tỉnh phía bác (từ Hà Tĩnh trở ra)

Điều là loại cây gỗ nhỡ, thích nghi cao với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng và hơi khô Lượng mưa hàng năm ở các vùng trống điều trên thế giới chỉ khoảng trên dưới 1000mm,

riêng ở Việt Nam, có thể đến 1500mm Cây sinh trường phát triển mạnh trong mùa mưa,

ra hoa quả và thu hoạch hoàn toàn trong mùa khô Điều có thể sống được trên nhiều loại đất, kể cả đất pha cát hoạc trơ sỏi đá Ở các tỉnh phía nam, cây thích nghỉ đạc biệt với loại đất đỏ bazan hoặc đất feralit dò vàng còn tương đối màu mờ Cầy trống từ hạt sau 3

- 4 năm bắt đầu có hoa quả Hoa thu phần nhờ côn trùng, sau 2 tháng có thể thu hoạch Điều là cây thực phẩm quan trọng của vùng nhiệt đới Tổng sản lượng hạt điều trên thế giới vào năm 1955 là 125000 tấn, đến 1986 tăng lên 365000 tấn Trong đó, Ấn Độ chiếm 38; Braxin: 33%; Đông Phi 25% Việt Nam là nước phát triển trồng điều muộn, song vài năm gần đây, sản lượng điều đã đứng hàng thứ 3, sau Ấn Độ và Braxin.oảng

1.1.2 Lá sài đất

Tên đồng nghĩa Wedelia chinensis (Osbeek) Merr Tên khác: Cúc nhấp, ngó núi, hùng trám, ngổ đất, tân sa lỗ địa cúc Tên nước ngoài Wedélie de Chine (Pháp) Họ: Cúc (Asteraceae)

Cây thảo, sống dai, mọc bò, bến rẻ ở thân ngắm, sau đứng thẳng, cao 20 - 40 cm Lá gần như không cuống, mọc đối, hình bầu dục thuôn, gốc và đầu nhọn, dài 1,5-5 cm, rộng 0,82 cm, hai mặt có lông thô cứng, mép có 3 đôi răng cưa to và nông, lá khi vò ra có mùi thơm như trám

Hình 1.2 Lá sài đất

Cụm hoa mọc ở kẽ lá và dáu cành thành đầu trên một cán dài 3 - 10 cm, đường kính 1 - 1,5 cm; lá bắc ngoài gần hình báu dục, ưòn ở đỉnh, không có mào lông, hoa màu vàng, tràng hình lười ở phía ngoài, có đầu bet khía 3 ràng, ống tràng rất ngắn; tràng hình ống

ở phía giữa, có 5 thùy hình bầu dục tù, nhi 5, bao phấn có đỉnh hẹp ở phần gốc, không

có tai

Sài đất là cây rất ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng Có thể trồng sài đất trên cánh đồng hoặc trồng ở vườn, lẫn với các loại cây ăn quả Cây ra hoa hàng năm Ở nơi trồng được chiếu sáng đầy đủ, cây có nhiều hoa Sài đất ra hoa nhiều nhưng tỷ lệ kết quả thấp

Cây có khả năng tái sinh dinh dưỡng Từ các mấu của thân ngâm hoặc cành (khi tiếp xúc với mạt đất) đều có thế ra rễ và mọc lên các chối Đác biệt, sau mỗi lần bị cắt, phần thân ngầm và góc còn lại sẽ nhanh chóng mọc lên các cây chói mới

1.2 Phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Sắc kí lỏng:

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân

bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể Thiết

bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt

độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị) Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector

Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm: silica, nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base

1.2.2 Sắc kí bản mỏng:

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo

tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của

sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

CHƯƠNG 2 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

2.1 Chuẩn bị thí nghiệm

- Vật liệu: Lá điều xay nhuyễn

- Hóa chất: Hexan, acetone

- Dụng cụ và thiết bị : Bình tam giá, đĩa petri, lọ đựng nguyên liệu, đũa thủy tinh, ống đong, cân phân tích, bể siêu âm gia nhiệt, tủ sấy

2.2 Các bước tiến hành

2.2.1 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau

Bước 1: Cân 2 lần, mỗi lần 1g nguyên liệu

Bước 3: Chiết trong bể siêu âm gia nhiệt 15 phút

Bước 4: Lọc dịch chiết qua giấy lọc

Bước 5: Thêm tiếp dung môi vào 2 bình tam giác, siêu âm 15 phút

Bước 6: Lọc hết bã và dịch chiết qua giấy lọc lần 2

Bước 7: Thu dịch chiết và bã rắn

Bước 8: Sấy khô cả bã và giấy lọc, cân để xác định khối lượng còn lại

Hình 2.3 Bã rắn và giấy lọc sau khi được sấy khô (1) Acetone; (2) Hexan

2.2.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu

Bước 1: Cân khối lượng chén

Bước 2: Cân 2g mẫu cho vào chén thủy tinh đã sấy khô và làm nguội trong bình hút ẩm Bước 3: Sấy chén và mẫu ở 105˚C đến khối lượng không đổi

Bước 4: Để nguội trong bình hút ẩm và cân tổng khối lượng chén và mẫu m1

2.3 Kết quả

2.3.1 Hiệu suất chiết chất chiết thô

Hàm lượng chất chiết thô:

H = m1 − m2

m1 x 100Trong đó:

m1: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) m2: Khối lượng bã còn lại (g)

Hiệu suất chiết với dung môi Acetone:

m1 = 2,02 g

m2 = 1,6536 – 0,7691 = 0,8845 g

Giải thích kết quả

Lá điều hay các bộ phận các của cây điều có lipid, là một hợp chất không phân cực hoặc kém phân cực, hexan có khả năng hòa tan tốt các chất này do hexan là dung môi không phân cực Trong quá trình chiết xuất, hexan sẽ hòa tan các lipid có trong lá điều, bao gồm dầu, sáp, và các thành phần béo khác, vì vậy hiệu suất chiết xuất bằng hexan rất cao đối với các chất này

2.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu

Công thức tính độ ẩm:

W = 𝑤1− 𝑤2

𝑚 x 100 (%) Trong đó:

w1 = khối lượng mẫu và chén trước khi sấy (g) w2 = khối lượng mẫu và chén sau khi sấy (g)

m = khối lượng mẫu trước khi sấy (g)

Bảng 2.1 Kết quả phân tích độ ẩm trong mẫu lá điều

Khối lượng mẫu trước khi sấy (g)

của mốc, vi khuẩn hay nấm, đồng thời duy trì chất lượng của lá trong suốt quá trình vận chuyển và lưu trữ Mức độ ẩm này không chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho các công đoạn chế biến, như xay nghiền hay chiết xuất, mà còn bảo vệ các thành phần hoạt tính trong

lá, đặc biệt khi được sử dụng trong dược phẩm hoặc thực phẩm Với độ ẩm vừa phải, lá điều dễ dàng giữ được giá trị dinh dưỡng, hương vị và tính chất tự nhiên, từ đó đảm bảo hiệu quả cao trong các ứng dụng công nghiệp

CHƯƠNG 3: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG

KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT

3.1 Chuẩn bị thí nghiệm

- Vật liệu: Lá sài đất xay nhuyễn

- Hóa chất: Hexan, acetone, silicagel 60 ( kích thước 0,015 – 0,040 mm )

- Dụng cụ và thiết bị: Bình tam giá, đĩa petri, lọ đựng nguyên liệu, đũa thủy tinh, ống đong, cân phân tích, bể siêu âm gia nhiệt, pipet Pasteur

Bước 3: Chiết trong bể siêu âm gia nhiệt 5 phút

Bước 4: Lọc dịch chiết qua giấy lọc, bỏ bã rắn

3.2.2 Chuẩn bị cột

Bước 1: Nhét 1 lớp bông thủy tinh dưới dáy pipet Pasteur làm cột

Bước 2: Cân 0.5g silicagel 60 ( kích thước 0,015 – 0,040 mm ) vào cốc thủy tinh khô Bước 3: Thêm 3 ml hexan vào cốc ngâm 5 phút

Bước 4: Cho hỗn hợp vào cột pipet Pasteur, gõ nhẹ cho slicagel lắng xuống và không khí thoát ra

3.2.3 Đưa mẫu vào cột

Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1mm, thêm 1ml dịch chiết vào cột dọc theo thành Tiếp tục cho pha động là n-hexane qua cột để tránh cột khô

Hình 3.2 Đưa mẫu vào cột (1) Mẫu cho vào cột, (2) Sau một thời

- Đưa dịch chiết lên bản mỏng (5-15 𝜇l)

- Đưa bảng mỏng vào bình ly giải chứa pha động

- Đánh dấu vạch kết thúc bằng bút chì

4.3 Kết quả và thảo luận

4.3.1 Kết quả

Bản mỏng sau khi chiếu đèn UV với mức sóng 254nm

Hình 4.1 Kết quả bản mỏng TLC khi chiếu đèn UV (1) bản đối chứng,

(2) bản trong dung môi Acetone : hexan (3:7), (3) bản trong dung môi Acetone : hexan (4:6);(a) Nhóm carotenoid, (b) Hợp chất không

xác định, (c) Nhóm sắc tố diệp lục tố

c

Hình 4.2 Kết quả bản mỏng TLC ở điều kiện thường (1) bản trong dung môi Acetone : hexan (4:6), (2) bản trong dung môi Acetone : hexan (3:7); (a) Nhóm carotenoid, (b) Hợp chất khôngxác định, (c) Nhóm sắc tố

diệp lục tố

Hỗn hợp dung môi Acetone : hexan (3:7)

Quãng đường dòng chảy của dung môi : 4.5 cm

Quãng đường dòng chảy của nhóm Carotenoid: 4.4 cm

→ Rf = 4.4

4.5 = 0.9778 Quãng đường dòng chảy của nhóm diệp lục tố: 1.6 cm

→ Rf = 1.6

4.5= 0.3556 Hỗn hợp dung môi Acetone : hexan (4:6)

Quãng đường dòng chảy của dung môi : 4.1 cm

Quãng đường dòng chảy của nhóm Carotenoid: 4 cm

→ Rf = 4

4.1 = 0.9756 Quãng đường dòng chảy của nhóm diệp lục tố: 3.3 cm

Qua thí nghiệm với hai hỗn hợp dung môi ly giải trên, kết quả dùng hộn hợp dung môi

ly giải Acetone : hexan (3:7) cho kết quả rõ và đẹp hơn kết quả dùng hộn hợp dung môi

ly giải Acetone : hexan (4:6)

CHƯƠNG 5 BÀI TẬP

Xác định nồng độ 1 số hợp chất có trong chiết xuất quả cafe đã phân tích bằng kỹ thuật sắc kí lỏng pha đảo

Dựa vào 4 đồ thị chất chuẩn hỗn hợp ta được các đồ thị chất chuẩn đơn lẻ dựa vào thông số nồng độ và diện tích ( Area)

Bảng 5.1 Số liệu chất chuẩn Protocatechuic acid

Hình 5.1 Đồ thị chất chuẩn Protocatechuic acid

Dựa vào biểu đồ ghi nhận được hàm số y = 14.372x - 2.2918

Bảng 5.2 Số liệu đồ thị chất chuẩn Chlorogenic acid

Hình 5.2 Đồ thị chất chuẩn Chlorogenic acid

Dựa vào biểu đồ ghi nhận được hàm số y = 20.008x - 9.7092

Bảng 5.3 Số liệu đồ thị chất chuẩn Caffeic acid

Hình 5.3 Đồ thị chất chuẩn Caffeic acid

Dựa vào biểu đồ ghi nhận được hàm số y = 21.456x - 4.1518

Xác định nồng độ các chất có trong chiết suất mẫu 4:

Dựa vào đồ thị mẫu 4 và các mẫu chuẩn đơn ghi nhận được:

Nồng độ Protocatechuic acid trong mẫu 4 được ghi nhận thông qua hàm số

y = 14.372x - 2.2918 với y là diện tích Protocatechuic acid của mẫu 4

y = 14.372x - 2.2918 thế y = 68.7499 ta được x = 68.7499 + 2.2918

14.372 = 4.9866 mg/L Nồng độ Protocatechuic acid trong mẫu 4 được ghi nhận thông qua hàm số

y = 20.008x - 9.7092 với y là diện tích Chlorogenic acid của mẫu 4

y = 20.008x - 9.7092 thế y = 578.0308 ta được x = 578.0308 + 9.7092

Nồng độ Protocatechuic acid trong mẫu 4 được ghi nhận thông qua hàm số

y = 21.456x - 4.1518 với y là diện tích Caffeic acid của mẫu 4

y = 21.456x - 4.1518 thế y = 53.8372 ta được x = 53.8372 + 4.1518

21.456 = 2.7027 mg/L

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Bộ Y Tế (2011) Dược điển Việt Nam V, tập 1 Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội 2.Bộ Y Tế (2011) Dược điển Việt Nam V, tập 2 Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội 3.Bộ Y Tế (2011) Dược điển Việt Nam V, bổ sung Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội