Nhóm 2 sáng thứ 4 thực hành kỹ thuật sắc ký nâng cao

Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau và xác định độ ẩm .... Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2021 – 2025

Thực hiện : Nhóm 2 – Sáng thứ 4

TP Thủ Đức, tháng 11/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

NGUYỄN MINH HÀ – 21126045 TRẦN THỊ THU HÀ - 21126321 NGUYỄN THỊ MỸ HIỀN – 21126337

TP Thủ Đức, tháng 11/2024

MỤC LỤC

Trang MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 5

1.1 Đặt vấn đề 5

1.2 Mục tiêu thực hiện 5

1.3 Nội dung thực hiện 5

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau và xác định độ ẩm 6

2.1.1 Cà phê xanh 6

2.1.2 Dung môi ethyl acetate 6

2.1.3 Dung môi methanol 7

2.1.4 Chỉ tiêu độ ẩm 7

2.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký cột 7

2.2.1 Cỏ ngũ sắc 7

2.2.2 Sắc ký cột - Column chromatography 8

2.2.3 Dung môi n - hexane 9

2.2.4 Dung môi acetone 9

2.2.5 Diệp lục tố - Chlorophyll 10

2.2.6 Carotenoid 10

2.3 Thí nghiệm 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 11

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12

3.2 Nội dung nghiên cứu 12

3.2.1 Vật liệu 12

3.2.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị 12

3.3 Phương pháp nghiên cứu 12

3.3.1 Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác

nhau và xác định độ ẩm 12

3.3.1.1 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 12

3.3.1.2 Xác định độ ẩm 12

3.3.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký cột 14

3.3.3 Thí nghiệm 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau và xác định độ ẩm 17

4.1.1 Xác định độ ẩm 17

4.1.1.1 Công thức 17

4.1.1.2 Tính toán kết quả 17

4.1.1.3 Kết quả 17

4.1.2 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 17

4.1.2.1 Công thức 17

4.1.2.2 Tính toán kết quả 17

4.1.2.3 Kết quả 17

4.1.2.4 Thảo luận 17

4.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký cột 19

4.2.1 Kết quả 19

4.2.2 Thảo luận 19

4.3 Thí nghiệm 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 20

4.3.1 Công thức 20

4.3.2 Tính toán kết quả 20

4.3.3 Kết quả 22

4.3.4 Thảo luận 22

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả độ ẩm của bột cà phê xanh 17 Bảng 1.2 Hiệu quả chiết thô của hai dung môi methanol và ethyl acetate 18 Bảng 1.3 Hệ số di chuyển Rf 21

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Bột cà phê xanh 6

Hình 2.2 Cỏ ngũ sắc (Ageratum cinyzoides L.) 8

Hình 2.3 Kỹ thuật sắc ký cột 8

Hình 2.4 Các bước thực hiện kỹ thuật sắc ký cột 9

Hình 3.1 Hỗn hợp dung môi và mẫu 13

Hình 3.2 Mẫu sau khi sấy khô A) Mẫu được ly trích bằng methanol; B) Mẫu được ly trích bằng ethyl acetate 13

Hình 3.3 Mẫu sau khi sấy 14

Hình 3.4 Dịch chiết cỏ ngũ sắc 14

Hình 3.5 Phân tách sắc tố thực vật bằng sắc ký cột A) Đưa mẫu vào cột; B) Thu nhận sắc tố carotenoid; C) Thu nhận diệp lục tố chlorophyyll 15

Hình 3.6 Chuẩn bị bản mỏng silica gel F254 16

Hình 4.1 Các nhóm sắc tố thu được từ dịch chiết cỏ ngũ sắc a) Carotenoid; b) Chlorophyll 19

Hình 4.2 Các nhóm sắc tố thu được từ dịch chiết cỏ ngũ sắc bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng với pha động là acetone:hexane theo tỉ lệ 4:6 l dung môi : quãng đường di chuyển của dung môi; l a1 : quãng đường di chuyển của carotene; l a2 : quãng đường di chuyển của chlorophyll a; l a3 : quãng đường di chuyển của chlorophyll b 20

Hình 4.3 Các nhóm sắc tố thu được từ dịch chiết cỏ ngũ sắc bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng với pha động là acetone:hexane theo tỉ lệ 3:7 l dung môi : quãng đường di chuyển của dung môi; l a1 : quãng đường di chuyển của carotene; l a2 : quãng đường di chuyển của chlorophyll a; l a3 : quãng đường di chuyển của chlorophyll b 21

Hình 4.4 Kết quả phân tách sắc tố được soi dưới đèn UV 254 nm 21

s

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cà phê và cỏ ngũ sắc (Ageratum conyzoides L.) là các loài thực vật phổ biến ở

Việt Nam, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý giá như chlorogenic acid, caffeine, flavonoid, alkaloid, coumarin , Việc phân tích và xác định các hợp chất này

là bước đầu tiên để hiểu rõ hơn về đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài cây này, từ đó

có thể khai thác và ứng dụng hiệu quả các hợp chất có hoạt tính sinh học vào đời sống

Kỹ thuật sắc ký cột, kỹ thuật sắc ký lớp mỏng là một trong nhũng phương pháp phân tích hiệu quả được ứng dụng rộng rãi trong việc tách chiết và phân tích các hợp chất hữu cơ, trong đó có sắc tố thực vật Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự khác biệt về ái lực của các chất với pha tĩnh và pha động Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp và cho hiệu quả tách chiết cao

1.2 Mục tiêu thực hiện

Đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng chất chiết thô

Phân tách và xác định các thành phần sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký cột và

kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

1.3 Nội dung thực hiện

Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau, xác định

độ ẩm của nguyên liệu

Chiết xuất sắc tố từ thực vật, lựa chọn pha tĩnh và pha động phù hợp để tiến hành phân tách sắc tố bằng sắc ký cột, quan sát, thu nhận và phân tích kết quả

Sử dụng các dung môi khác nhau cho việc phân tách sắc tố thực vật bằng sắc ký lớp mỏng, quan sát khả năng phân tách của sắc tố trong hai dung môi ly giải khác nhau

và đánh giá về độ phân cực của các sắc tố

Hình 2.1 Bột cà phê xanh

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau và xác định độ ẩm

2.1.1 Cà phê xanh

Cà phê xanh là hạt cà phê thô, đã được loại bỏ lớp vỏ bên ngoài, chỉ còn lại phần hạt bên trong và chưa qua giai đoạn rang xay nên vẫn giữ được màu xanh tự nhiên và giữ lại hầu hết các chất dinh dưỡng, hoạt chất và hương vị ban đầu của hạt cà phê

Cà phê xanh chứa nhiều chất chống oxy hóa, trong đó có hai chất rất quan trọng là caffeine và acid chlorogenic Caffeine giúp kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng cường trí nhớ và khả năng tập trung Acid chlorogenic giúp ức chế quá trình hấp thụ tinh bột, giảm cảm giác thèm ăn, đốt cháy mỡ thừa, cân bằng đường huyết và giảm nguy cơ tiểu đường

Ngoài ra, hạt cà phê xanh còn có nhiều lợi ích khác cho sức khỏe như giải độc cơ thể, hỗ trợ gan, chống viêm, chống lão hóa, chống ung thư… Đây được xem là một loại thực phẩm bổ dưỡng, an toàn và hiệu quả cho mọi đối tượng

2.1.2 Dung môi ethyl acetate

Ethyl acetate có công thức hóa học là C4H8O2, tồn tại ở dạng lỏng, không màu, có mùi đặc trưng của ester

Ethyl acetate là một loại dung môi phân cực nhẹ, dễ bay hơi, không hút ẩm, tương đối không độc hại cho người sử dụng với một số đặc tính nổi bật như: dễ hòa tan trong dung môi hữu cơ, ít tan trong nước Ứng dụng trong ngành mực in, sơn, thuốc sâu, dung môi công nghiệp,…

2.1.3 Dung môi methanol

Methanol là một alcohol no đơn chức với nhiều tên gọi khác như rượu metylic, alcohol metylic, alcohol gỗ, naphtha gỗ hay rượu mạnh gỗ, là hợp chất hóa học với công thức hóa học là CH3OH Tuy nhiên, khác với rượu thường mà chúng ta hay uống, đây lại là một chất gây độc mạnh và không thể uống được

Methanol tồn tại ở dạng chất lỏng phân cực, không màu, dễ bay hơi Ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp, như một dung môi để hòa tan các nguyên liệu sản xuất, được sử dụng như một chất chống đông, dung môi, nhiên liệu, và như là một chất làm biến tính cho ethanol Nó cũng được sử dụng để sản xuất diesel sinh học thông qua phản ứng xuyên este hóa

2.1.4 Chỉ tiêu độ ẩm

Độ ẩm nguyên liệu được hiểu đơn giản là tỷ lệ phần trăm nước có trong hỗn hợp nguyên Độ ẩm ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất vật lý, hóa học và hoạt động của enzyme trong nguyên liệu Do đó, độ ẩm nguyên liệu vẫn luôn được coi yếu tố cần quan tâm để tránh nguyên liệu quá khô hoặc quá ướt sẽ làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Các phương pháp sấy phổ biến: sấy thăng hoa, sấy ở nhiệt độ cao, sấy lạnh…

2.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký cột

Hoa: nhỏ, màu tím xanh hoặc trắng, mọc thành cụm hình đầu

Quả: Quả bế, màu đen, nhỏ, có 5 sống dọc

Đặc điểm sinh thái: Cỏ ngũ sắc là cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh, thích nghi với nhiều loại đất Cây ra hoa quanh năm, phát tán nhờ hạt

Thành phần hóa học: Cỏ ngũ sắc chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như: flavonoid, alkaloid, coumarin, saponin, tinh dầu…

Công dụng:

Trong y học cổ truyền: Cỏ ngũ sắc được sử dụng để điều trị các bệnh như cảm

Hình 2.2 Cỏ ngũ sắc (Ageratum cinyzoides L.)

Hình 2.3 Kỹ thuật sắc ký cột

cúm, sốt, viêm họng, đau nhức xương khớp, rong kinh, lở ngứa

Trong nông nghiệp: Cỏ ngũ sắc có thể được sử dụng làm phân xanh, chế phẩm trừ sâu sinh học

2.2.2 Sắc ký cột - Column chromatography

Sắc ký cột là quá trình phân tách diễn ra trong một cột hở dựa vào sự hấp phụ khác biệt của các hợp chất với pha tĩnh (chất hấp phụ) Các thành phần có độ hấp phụ và ái lực thấp hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn so với các thành phần có độ hấp phụ

và ái lực cao hơn với pha tĩnh

Hình 2.4 Các bước thực hiện kỹ thuật sắc ký cột

Pha động: là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi dùng để hòa tan và di chuyển các chất cần phân tách qua cột Lựa chọn pha động phụ thuộc vào tính chất của chất cần phân tách và pha tĩnh Pha động có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần để tách các chất có độ phân cực khác nhau

Ứng dụng: Phân tích các thành phần trong hỗn hợp, cô lập hợp chất để nghiên cứu các hợp chất mới, tinh sạch hợp chất quan tâm

Ưu điểm: Hiệu quả tách cao, đơn giản và dễ thực hiện, linh hoạt, chi phí thấp

2.2.3 Dung môi n - hexane

Hexane là một hydrocarbon thuộc nhóm alkane, có công thức hóa học là C6H14 Dung môi n – hexane là một chất lỏng không màu, trong suốt, không phân cực, không tan trong nước với độc tính thấp, được luyện từ dầu thô, có mùi giống như xăng dầu, dễ cháy và rất dễ bay hơi

Ứng dụng:

Dung môi chiết xuất: Được sử dụng rộng rãi để chiết xuất dầu thực vật từ các loại hạt và đậu, cũng như chiết xuất các hợp chất hữu cơ từ các nguồn tự nhiên khác

Dung môi trong công nghiệp: Sử dụng trong sản xuất keo dán, sơn…

Thành phần của xăng: Là một thành phần nhỏ trong xăng dầu

Sắc ký: hexane được sử dụng làm pha động trong sắc ký cột, đặc biệt là để tách các hợp chất không phân cực

2.2.4 Dung môi acetone

Acetone là một hợp chất hữu cơ có công thức (CH3)2CO Là chất lỏng không màu, phân cực, tan trong nước, dễ bay hơi và dễ cháy, với mùi hăng đặc trưng

Ứng dụng:

Dung môi: Là dung môi phổ biến trong sản xuất nhựa, sợi tổng hợp, sơn… Chất tẩy rửa: Sử dụng trong tẩy rửa sơn móng tay, vệ sinh dụng cụ phòng thí nghiệm, và làm sạch các bề mặt

Hóa chất trung gian: Được sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp các hợp chất hữu cơ khác như chloroform, iodoform, và bisphenol A

Mỹ phẩm: Có trong một số sản phẩm như nước tẩy trang, kem dưỡng da

Y tế: Được sử dụng trong một số quy trình y tế, như lột da hóa học và điều trị mụn cóc

2.2.5 Diệp lục tố - Chlorophyll

Chlorophyll còn được gọi là diệp lục tố, là một sắc tố màu xanh lá cây có ở thực vật, tảo và vi khuẩn lam Nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp, cho phép các sinh vật này hấp thụ năng lượng từ ánh sáng mặt trời để chuyển đổi carbon dioxide và nước thành carbohydrate và oxy Có nhiều loại chlorophyll khác nhau, phổ biến nhất là chlorophyll a và chlorophyll b, khác nhau về các nhóm thế gắn với vòng porphyrin

Carotene: hydrocarbon tinh khiết, như (α và β - carotene) là sắc tố tự nhiên phổ biến và tìm thấy trong tự nhiên, có thể tìm thấy trên thực vật, nấm, tảo Được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và dinh dưỡng

Xanthophyll: là dẫn xuất có chứa oxy của carotene như lutein, zeaxanthin và astaxanthin Được tìm thấy hầu hết các loại lá cây, nơi chứng hoạt động để điều chỉnh năng lượng ánh sáng

Vai trò:

Quang hợp: Ở thực vật, carotenoid hỗ trợ quá trình quang hợp bằng cách hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng khác với chlorophyll và truyền năng lượng cho chlorophyll

Chống oxy hóa: Carotenoid bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do gây hại, giúp ngăn ngừa các bệnh mãn tính như ung thư, tim mạch và thoái hóa điểm vàng Sắc tố: Carotenoid tạo ra màu sắc hấp dẫn cho nhiều loại rau củ quả, hoa, và động vật Ví dụ, màu cam của cà rốt, màu đỏ của cà chua và màu hồng của tôm đều do carotenoid tạo nên

2.3 Thí nghiệm 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật phân tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách

Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ

lệ qui định, di chuyển trên bản mỏng dưới tác động của lực mao quản

Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các chất có ái lực mạnh với pha tĩnh sẽ

di chuyển chậm hơn chất có ái lực yếu, dẫn đến sự phân tách Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng Hệ số di chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức

độ tách Hệ số di chuyển Rf được tính theo công thức:

Rf = l

l0

Trong đó:

l là quãng đường di chuyển của chất tan

l0 là quãng đường di chuyển của dung môi

Những yếu tố ảnh hưởng đến Rf: Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ, bề dày của lớp mỏng, chất lượng và độ tinh khiết của pha động

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Môn học “Thực hành kỹ thuật sắc ký nâng cao” bắt đầu lúc 8 giờ từ ngày 06/11/2024 đến ngày 13/11/2024 tại phòng 306, tòa nhà A2, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Hạt cà phê xanh, cỏ ngũ sắc được sấy khô và xay nhuyễn thành dạng bột, cung cấp bởi phòng 306, tòa nhà A2, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị

Dụng cụ: chén thủy tính, đĩa petri, giấy lọc, ống đong, bình erlen, cốc becher, pipet, giấy bạc, giá đựng ống nghiệm, ống nghiệm, bông sợi thủy tinh, pipet Pasteur, micropipet, bản mỏng silica gel F254

Hóa chất: ethyl acetate, methanol, acetone, n - hexane, silica gel có kích thước hạt

từ 0,015 - 0,040 mm

Thiết bị: Bể siêu âm gia nhiệt (300897 Ultrasons - HD, Selecta, Tây Ban Nha), cân phân tích, tủ sấy, đèn UV ở bước sóng 254 nm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thí nghiệm 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau và xác định độ ẩm

3.3.1.1 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau Cách tiến hành

Cân 1 g bột cà phê xanh vào bình erlen, cân khối lượng của giấy lọc, các bước trên được thực hiện hai lần

Đong 15 mL lần lượt hai dung môi ethyl acetate và methanol cho vào hai bình erlen chứa mẫu, lắc đều và đem đi đánh sóng siêu âm trong vòng 15 phút ở 35oC, điện

áp 220 V