Kĩ thuật sắc kí nâng cao nhóm 5 ca chiều t6

Kết quả phân tách sắc tố sau khi lấy ra từ dung môi hexan-acetone theo tỉ lệ 6:4... Hiệu suất chiết xuất của lá ngũ sắc ở các dung môi .... Lọc dịch chiết thu được bằng giấy lọc, chỉ lấy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KĨ THUẬT SẮC KÍ NÂNG CAO

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KĨ THUẬT SẮC KÍ NÂNG CAO

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS TRỊNH THỊ PHI LY NGUYỄN QUỐC TRỌNG - 21126557

CAO MINH TRỰC - 21126559

VÕ HOÀNG PHONG - 21126464

VÕ HỒNG PHẨM - 21126154

TRỊNH NGỌC KHÁNH - 21126373 TRẦN VĂN PHÚC - 21126473

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Page

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

CHƯƠNG 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1 Tổng quan lá ngũ sắc 1

1.2 Mục tiêu, vật liệu và phương pháp 1

1.2.1 Mục tiêu 1

1.2.2 Vật liệu 1

1.2.3 Phương pháp 1

1.2.3.1 Đánh giá hiệu suất chiết xuất 1

1.2.3.2 Đo độ ẩm nguyên liệu 3

1.2.4 Kết quả 4

CHƯƠNG 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT5 2.1 Tổng quan 5

2.1.1 Cỏ ngũ sắc 5

2.1.2 Kỹ thuật Sắc ký cột 5

2.2 Mục tiêu thí nghiệm 6

2.3 Vật liệu và phương pháp 6

2.3.1 Nghiên liệu và thiết bị 6

2.3.2 Phương pháp 6

2.3.2.1 Chuẩn bị dịch sắc tố 6

2.3.2.2 Chuẩn bị cột 7

2.3.2.3 Đưa dịch chiết từ mẫu vào cột 8

2.3.2.4 Rửa giải 8

2.4 Kết quả và thảo luận 8

2.4.1 Kết quả 8

2.4.2 Thảo luận 9

CHƯƠNG 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT TLC 10

3.1 Tổng quan kĩ thuật TLC 10

3.2 Mục tiêu thí nghiệm 10

3.3 Vật liệu và phương pháp 10

3.3.1 Vật liệu 10

3.3.2 Phương pháp tiến hành 11

3.4 Kết quả và thảo luận 12

3.4.1 Kết quả 12

3.4.2 Thảo luận 14

CHƯƠNG 4 BÀI TẬP 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hỗn hợp thu được sau khi đánh sóng siêu âm (A) Etyl AxetaT; (B) Ethanol. 2

Hình 1.2 Dịch chiết thu được lần lượt trong dung môi (A) Etyl AxetaT; (B) Ethanol…… 2

Hình 1.3 Bã thu được sau 2 lần lọc 3

Hình 1.4 Bã rắn và giấy lọc sau khi được sấy khô (1) ethanol; (2) etyl axetax. 3

Hình 1.5 Mẫu thu được sau khi sấy 3

Hình 2.1 Cỏ ngũ sắc……… ……… 5

Hình 2.2 Cân 1g mẫu cỏ ngủ sắc……… 6

Hình 2.3 Dùng máy siêu âm chiết dịch……… ……… 7

Hình 2.4 Cân 0,5g silicagel……… 7

Hình 2.5 Kết quả chiết xuất (A) Chlorophyl; (B) Carotenoid……… ……….… 8

Hình 3.1 Dịch chiếc cỏ ngủ sắc.……… 11

Hình 3.2 Bảng mỏng sau khi đã chấm mẫu với các dung môi.…………… 11

Hình 3.3 Kết quả phân tách sắc tố sau khi lấy ra từ dung môi hexan-acetone theo tỉ lệ 6:4 ……… 12

Hình 3.4 Kết quả phân tách sắc tố sau khi lấy ra từ dung môi hexan-acetone theo tỉ lệ 7:3 ……… 11

Hình 3.5 Bảng mỏng dưới tia UV 254 nm…….……… 11

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Hiệu suất chiết xuất của lá ngũ sắc ở các dung môi 4 Bảng 1.2 Độ ẩm nguyên liệu sau khi sấy 4 Bảng 3.1 Bảng hệ số Rf 14

CHƯƠNG 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

1.1 Tổng quan lá ngũ sắc

Lá ngũ sắc là một loài thực vật thuộc họ Cúc (Asteraceae) Cây ngũ sắc còn được gọi với nhiều tên khác nhau như cây cứt lợn, bông ổi (ở miền Nam), hay cỏ hôi Tên khoa

học của cây là Ageratum conyzoides Đây là một loại cây mọc hoang dại, phổ biến ở nhiều

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có Việt Nam

Lá ngũ sắc là nguồn dược liệu quan trọng trong lĩnh vực chiết xuất nhờ chứa nhiều hoạt chất có giá trị sinh học Những hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong y học, mỹ phẩm, và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe

1.2 Mục tiêu, vật liệu và phương pháp

Hóa chất: etyl axetat, ethanol

Thiết bị: cân phân tích, máy sóng siêu âm, tủ sấy

1.2.3 Phương pháp

1.2.3.1 Đánh giá hiệu suất chiết xuất

Cân 1g bột lá ngũ sắc vào bình erlen, lặp lại 2 lần cho 2 bình

Thêm 15ml Etyl Axetat, 15ml Ethanol lần lượt vào 2 bình erlen chứa bột lá ngũ sắc, buộc miệng bình để tránh dung môi bay hơi

Đánh sóng siêu âm trong vòng 15 phút (40Hz, 300V)

Hình 1.1 Hỗn hợp thu được sau khi đánh sóng

siêu âm (A) Etyl AxetaT; (B) Ethanol.

Lọc dịch chiết thu được bằng giấy lọc, chỉ lấy dung dịch tránh đổ bã lá ngũ sắc ra giấy lọc quá nhiều

Hình 1.2 Dịch chiết thu được lần lượt trong dung môi (A) Etyl AxetaT; (B) Ethanol.

Tiếp tục thêm 15ml Etyl Axetat, 15ml Ethanol lần lượt vào 2 bình erlen chứa bột lá ngũ sắc, buộc miệng bình để tránh dung môi bay hơi Đánh sóng siêu âm trong vòng 15 phút (40Hz, 300V) Lọc dịch chiết thu được bằng giấy lọc, lấy hết bã lá ngũ sắc ra giấy lọc Sau khi lọc xong, sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ sấy

Hình 1.3 Bã thu được sau 2 lần lọc

Cân khối lượng và tính toán kết quả

Hình 1.4 Bã rắn và giấy lọc sau khi được sấy khô (1) ethanol; (2) etyl axetax.

1.2.3.2 Đo độ ẩm nguyên liệu

Cân 2g bột lá ngũ sắc vào chén thủy tinh đã sấy khô được để trong bình hút ẩm, lặp lại 2 lần cho 2 chén Sấy mẫu và chén ở 105oC, để nguội Cân khối lượng mẫu và chén sau khi sấy và tính toán kết quả

Hình 1.5 Mẫu thu được sau khi sấy

1.2.4 Kết quả

Bảng 1.1 Hiệu suất chiết xuất của lá ngũ sắc ở các dung môi

Dung môi

Khối lượng nguyên liệu ban đầu

Khối lượng giấy

Công thức tính hiệu suất chiết xuất:

H% =(KL nguyên liệu ban đầu + KL giấy lọc) − KL bã với giấy lọc sau khi sấy

Hiệu suất chiết của lá ngũ sắc trong Etyl Axetat

Công thức tính độ ẩm nguyên liệu:

W% = (KL chén với nắp + KL mẫu ban đầu) − KL mẫu, chén và nắp sau sấy

Hình 2.1 Cỏ ngũ sắc

2.1.2 Kỹ thuật Sắc ký cột

Sắc ký cột là một phương pháp sắc ký phân tách và định lượng sinh chất dưới áp suất cao.Giúp làm giảm thời gian nhưng vẫn hiệu quả, chất lượng khi phân tích Sắc ký cột

là phương pháp đơn giản có thể loại bỏ các nguyên liệu không phản ứng Phân lập các chất

ra khỏi hỗn hợp nhanh chóng và hiệu quả ở trong các thí nghiệm các chất vô cơ, hữu cơ

Nguyên tắc sử dụng ký sắc cột:

Sắc kí cột được tiến hành dựa trên nguyên tắc tính phân cực Phân chia hỗn hợp các chất thành 2 pha là pha động và pha tĩnh để sắc ký Sắc ký hấp thụ là một ống thẳng đứng được làm bằng thủy tinh

Pha tĩnh là chất hấp thụ – các chất phổ biến sử dụng làm pha tĩnh là oxit nhôm, Silica gel, CaCO3,… Được tiêu chuẩn hóa có sẵn trên thị trường, Pha động là dung môi rửa cột, chảy qua chất hấp thụ

2.2 Mục tiêu thí nghiệm

Dùng kỹ thuật sắc ký cột tách chiết cỏ ngũ sắc thu sắc tố Carotenoid và Cholorophyl

2.3 Vật liệu và phương pháp

2.3.1 Nghiên liệu và thiết bị

Mẫu cỏ ngũ sắc, silicagel F254 (kích thước hạt: 0,015 – 0,040 mm), N-Hexan, Aceton, cột (pipet pasteur), khay đựng, máy siêu âm, giấy lọc, cốc thủy tinh, ống đong, cân điện tử, bình tam giác, bông thủy tinh

Bước 3: Dùng máy siêu âm chiết trong 5 phút sau đó dùng một ống nghiệm và giấy lọc để lọc lấy dịch chiết

Hình 2.3 Dùng máy siêu âm chiết dịch

2.3.2.2 Chuẩn bị cột

Bước 1: Dùng giấy bạc đặt lên cân điện tử cần 0,5g silicagel cho vào cốc thủy tinh, dùng ống đong đong 5ml N-hexan để ngâm Silica gel trong 10 phút

Hình 2.4 Cân 0,5g silicagel

Bước 2: Nhồi cột ướt dùng pipet pasteur dùng làm cột, lấy bông thủy cho vào cột tránh khi nhồi cột Silica gel bị chảy ra không đọng lại thành cột

Bước 3: Hút Silica gel ngâm trong N-hexan cho vào cho từ từ vào cột đặt trong ống nghiệm, mỗi lần cho vào cây thì gõ vào thành cột để toàn bộ Silica gel dính trên thành đi xuống tránh có không khí bị giữ lại tạo bọt khí, thực hiện lặp lại cho hỗn hợp Silica gel vào để nhồi cho đến khi nhồi hết Silica gel vào

2.3.2.3 Đưa dịch chiết từ mẫu vào cột

Khi pha động (N-Hexan) cách pha tĩnh (Silica gel) 1mm thì cho thêm khoản 1ml dung dịch chiết vào cột dọc theo thành, tránh làm xao động bề mặt pha tĩnh Dịch chiết đi qua silicagel nhỏ giọt vào ống nghiệm

2.4.2 Thảo luận

Thí nghiệm sắc ký cột đã cho thấy sự hiệu quả của phương pháp này trong việc tách chiết và phân tích các sắc tố trong Cỏ ngũ sắc Qua quá trình thực hiện, chúng ta đã quan sát được sự phân tách rõ rệt giữa carotenoid và chlorophyl, hai nhóm sắc tố chính trong thực vật Kết quả này chứng tỏ sự khác biệt về độ phân cực giữa các sắc tố, trong đó carotenoid là hợp chất không phân cực, trong khi chlorophyl có độ phân cực cao hơn

Việc lựa chọn dung môi và pha tĩnh phù hợp đã đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách N-Hexan, với tính chất không phân cực, đã giúp tách tốt carotenoid, trong khi Aceton, với độ phân cực trung bình, hỗ trợ quá trình tách chlorophyl Tuy nhiên, để đạt được độ tinh khiết cao hơn của các sắc tố, có thể cần phải tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm như tỉ lệ dung môi, tốc độ dòng chảy, và loại Silica gel sử dụng

là silica gel, nhôm oxit hoặc cellulose) được phủ đều trên một tấm nền trơ (như thủy tinh, nhôm hoặc nhựa).Pha động: là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi có khả năng hòa tan các chất cần tách.Quá trình tách diễn ra khi chấm mẫu lên tấm TLC và cho tấm này vào bình chứa pha động, pha động sẽ di chuyển lên trên tấm theo mao dẫn Các chất trong mẫu

sẽ tương tác khác nhau với pha tĩnh và pha động, dẫn đến chúng di chuyển với tốc độ khác nhau Kết quả là các chất sẽ tách thành các vệt riêng biệt trên tấm TLC

Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: Nhanh chóng và đơn giản, quy trình thực hiện tương đối nhanh, không yêu cầu thiết bị phức tạp.Chi phí thấp, các hóa chất và vật tư

sử dụng cho TLC thường có giá thành rẻ Dễ dàng so sánh, bằng cách so sánh vị trí của các vệt trên tấm TLC với các mẫu chuẩn có thể xác định các thành phần trong mẫu Thường được ứng dụng kiểm tra độ tinh khiết, theo dõi phản ứng, phân tích hỗn hợp

Hình 3.2 Bảng mỏng sau khi đã chấm mẫu với các dung môi (A) hexan- acetone 7:3; (B) hexan-acetone 6:4.

Bước 4: Nhúng bảng mỏng vào bình chứa pha động, vạch xuất phát phải cao hơn mức dung môi, pha động di chuyển đến cách đầu bảng mỏng khoảng 2mm thì lấy ra đánh dấu vị trí

3.4 Kết quả và thảo luận

3.4.1 Kết quả

Hình 3.3 Kết quả phân tách sắc tố sau khi

lấy ra từ dung môi hexan-acetone theo tỉ lệ

6:4 (a: quảng đường di chuyển của dung môi; b1:

quảng đường di chuyển của chlorophyll a; b2:

quảng đường di chuyển của chlorophyll b; c: quảng

đường di chuyển của carotene).

a=46mm b1=33mm b2=31mm c=48mm

Hình 3.4 Kết quả phân tách sắc tố sau khi lấy ra từ

dung môi hexan-acetone theo tỉ lệ 7:3 (a) quảng đường di

chuyển của dung môi; (b1) quảng đường di chuyển của

chlorophyll a; (b2) quảng đường di chuyển của chlorophyll b;

(c) quảng đường di chuyển của carotene).

a=50mm b1=17mm b2=14mm c=49mm

bị cuốn theo pha động Sau khi phân tách sắc tổ của cây cỏ ngủ sắc bằng kỉ thuật bảng mỏng TLC ta dễ dàng thấy được nhóm sắc tố caroten ( màu vàng) di chuyển xa nhất trên bảng mỏng, tiếp theo đó là chlorophyll a (màu xanh lá) và cholorophyll b (màu xanh lá nhạt)

Caroten là một chất được coi là không phân cực hoặc phân cực ít nên ái lực với pha tĩnh thấp do dễ dàng bị pha động cuốn theo nên di chuyển xa nhất Ngược lại, chlorophyll

là một chất có tính phân cực mạnh hơn caroten, chlorophyll bao gồm chlorophyll a và b

Chlorophyll b thường được coi là có tính phân cực mạnh hơn chlorophyll a nên ái lực tạo

ra với pha tĩnh cao do đó di chuyển gần hơn so với chlorophyll b

Trong thí nghiệm sử dụng pha động với hai tỉ lệ khác nhau hexan-acetone 6:4 và hexan-acetone 7:3 Hexan là một hydrocarbon mạch thẳng, chỉ gồm các liên kết C-H, là một dung môi không phân cực Ngược lại, Acetone có một nhóm carbonyl (C=O) trong phân tử, liên kết C=O có tính phân cực mạnh do sự chênh lệch độ âm điện giữa nguyên tử carbon và oxy điều này tạo ra một moment lưỡng cực vĩnh cửu trong phân tử acetone khiến

nó thành một dung môi phân cực Việc điều chỉnh tỉ lệ hexan và acetone thích hợp cũng có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm, tỉ lệ hexan-aceton 7:3 cho ra hệ số Rf cao, các chất phân tách rỏ ràng, dễ dàng quan sát cho người thí nghiệm Tỉ lệ hexan-acetone 6:4, hệ số Rf tương đối thấp, các chất phân tách không rỏ, nằm chồng lên nhau, khó quan sát và kết luận

CHƯƠNG 4 BÀI TẬP

Xác định nồng độ 1 số hợp chất có trong chiết xuất quả cafe đã phân tích bằng kỹ thuật sắc

kí lỏng pha đảo

Dựa vào 4 đồ thị chất chuẩn hỗn hợp ta được các đồ thị chất chuẩn đơn lẻ dựa vào thông

số nồng độ và diện tích ( Area)

Bảng 4.1 Số liệu chất chuẩn Protocatechuic acid

Hình 5.1 Đồ thị chất chuẩn Protocatechuic acid

Dựa vào biểu đồ ghi nhận được hàm số y = 14.372x - 2.2918

Bảng 5.2 Số liệu đồ thị chất chuẩn Chlorogenic acid

Protocatechuic acid

Hình 5.2 Đồ thị chất chuẩn Chlorogenic acid

Dựa vào biểu đồ ghi nhận được hàm số y = 20.008x - 9.7092

Bảng 5.3 Số liệu đồ thị chất chuẩn Caffeic acid

Hình 5.3 Đồ thị chất chuẩn Caffeic acid

Dựa vào biểu đồ ghi nhận được hàm số y = 21.456x - 4.1518

Caffeic acid

Xác định nồng độ các chất chiết suất có trong mẫu số 5

Dựa vào đồ thị mẫu 5 và các mẫu chuẩn đơn ghi nhận được:

Nồng độ Protocatechuic acid trong mẫu 4 được ghi nhận thông qua hàm số y = 14.372x - 2.2918 với y là diện tích Protocatechuic acid của mẫu 5

y = 14.372x - 2.2918 thế y = 89.9408 ta được x = = 6.4175 mg/L Nồng độ Protocatechuic acid trong mẫu 5 được ghi nhận thông qua hàm số y = 20.008x - 9.7092 với y là diện tích Chlorogenic acid của mẫu 5

y = 20.008x - 9.7092 thế y = 854.2734 ta được x = = 43.1819 mg/L Nồng độ Protocatechuic acid trong mẫu 5 được ghi nhận thông qua hàm số y = 21.456x - 4.1518 với y là diện tích Caffeic acid của mẫu 5

y = 21.456x - 4.1518 thế y = 67.3403 ta được x = = 2.7027 mg/L

89.9408 + 2.2918 14.372

854.2734 + 9.7092 20.008

63.3403 + 4.1518 21.456

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bộ Y Tế (2011) Dược điển Việt Nam V, tập 1 Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội

2 Bộ Y Tế (2011) Dược điển Việt Nam V, tập 2 Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội

3 Bộ Y Tế (2011) Dược điển Việt Nam V, bổ sung Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội