Thực hành sắc ký nâng cao nhóm 5

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CHIẾT XUẤT QUẢ CAFE ĐÃ PHÂN TÍCH BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO – CỘT C18.. LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

THỰC HÀNH KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

THỰC HÀNH KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Giảng viên hướng dẫn Nhóm sinh viên thực hiện MSSV

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

THÍ NGHIỆM 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1 Mục đích thí nghiệm 1

1.2 Tổng quan 1

1.2.1 Bạch đàn 1

1.2.2 Dung môi Ethyl acetate 1

1.2.3 Dung môi Ethanol 1

1.3 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị 2

1.4 Phương pháp tiến hành 2

1.4.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 2

1.4.2 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu 3

1.5 Kết quả tính toán và giải thích 5

1.5.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 5

1.5.2.Tính toán hàm lượng chất chiết thô 6

1.5.3 So sánh hiệu quả chiết của các dung môi khác nhau 7

1.5.4 Giải thích kết quả chiết cao của hai dung môi 7

THÍ NGHIỆM 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT 9

2.1 Tổng quan 9

2.1.1 Kỹ thuật sắc ký cột 9

2.2 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị 10

2.3 Phương pháp tiến hành 10

2.4 Kết quả và thảo luận 12

THÍ NGHIỆM 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT TLC 13

3.1 Tổng quan 13

3.2 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị 13

3.3 Phương pháp tiến hành 13

3.4 Kết quả 14

3.4.1 Hỗn hợp dung môi hexane: aceton tỷ lệ 7:3 14

3.4.2 Hỗn hợp dung môi hexane: aceton tỷ lệ 6:4 15

3.4.3 Kết quả bảng mẫu sau khi chiếu tia UV 16

3.5 Thảo luận 16

BÀI TẬP XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CHIẾT XUẤT QUẢ CAFE ĐÃ PHÂN TÍCH BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO – CỘT C18 18

4.1 Dựng đường chuẩn 18

4.2 Tính kết quả nồng độ mẫu 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Kết quả độ ẩm trong nguyên liệu sau khi tính toán bằng công thức 6

Bảng 1.2 Kết quả hàm lượng chất chiết thô trong hai dung môi 6

Bảng 4.1 Thông tin các chất chuẩn 18

Bảng 4.2.1 Thông tin mẫu 5 20

Bảng 4.2.2 Kết quả nồng độ mẫu 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Lá bạch đàn đã sấy khô và nghiền nhỏ 2

Hình 1.2 Cho mẫu vào chén thủy tinh có nắp 2

Hình 1.3 Thêm dung môi vào nguyên liệu 3

Hình 1.4 Cho bình chứa hỗn hợp mẫu và dung môi vào bồn siêu âm 4

Hình 1.5 Lọc dịch chiết bằng dung môi 4

Hình 1.6 Thêm dung môi lần hai vào bình 5

Hình 1.7 Dịch chiết lá bạch đàn của hai dung môi sau khi lọc a)Dung môi Ethyl acetate, b)Dung môi Ethanol 7

Hình 1.8 Phần bã nguyên liệu đã chiết xuất bằng dung môi sau khi sấy a)Dung môi Ethyl acetate, b)Dung môi Ethanol 8

Hình 2.3.1 Hỗn hợp nguyên liệu và dung môi sau khi đánh sóng siêu âm 10

Hình 2.3.2 Rửa giải sắc tố carotenoid 11

Hình 2.3.3 Rửa giải sắc tố chlorophyll 12

Hình 2.4 Kết quả tách chiếc (A) Nhóm diệp lục tố chlorophyll ; (B) Nhóm carotenoid 12

Hình 3.4.1 Kết quả TLC với hỗn hợp dung môi (hexane: aceton) có tỷ lệ 7:3 14

Hình 3.4.2 Kết quả TLC với hỗn hợp dung môi (hexane: aceton) có tỷ lệ 6:4 15

Hình 3.4.3 Các bản mỏng được chiếu trên tia UV lần lượt là đối chứng; 7:3; 6:4 16

Hình 4.1 Đồ thị tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của Protoctechuic acid 19

Hình 4.2 Đồ thị tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của Chlorogenic acid 19

Hình 4.3 Đồ thị tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của Caffeic acid 20

THÍ NGHIỆM 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

bảo quản thực phẩm tự nhiên và thuốc để điều trị nhiều bệnh truyền nhiễm

Bạch đàn có nguồn gốc từ Úc Đây là cây cao, thường xanh, được trồng để lấy gỗ, nhựa, bột giấy, dầu cũng như giá trị thẩm mỹ và dược liệu Tinh dầu chiết xuất từ lá của cây này là một trong những loại tinh dầu quan trọng nhất trong số tất cả các loại cây thân gỗ và không thân gỗ Tinh dầu thực vật chứa nhiều loại hóa chất và hỗn hợp của các thành phần khác nhau như (như este, monoterpen, aldehyde, ketone và sesquiterpen) Các thành phần hóa học này có liên quan đến cơ chế phòng vệ của thực vật chống lại sâu bệnh và vi sinh vật

Các monoterpen trong lá bạch đàn có oxy nhiều nhất là eucalyptol (51,62%) và terpinen-4-ol (2,74%), trong khi các monoterpen không có oxy chính là α-pinene

(23,62%), p -cymene (10%) và β-myrcene (8,74%)

1.2.2 Dung môi Ethyl acetate

Ethyl acetate là một hợp chất hữu cơ với công thức CH3COOC2H5, viết tắt là C4H8O2 Đây là chất lỏng không màu có mùi dễ chịu và đặc trưng và dung môi phân cực nhẹ, dễ bay hơi, tương đối không độc hại và không hút ẩm Nó là chất nhận cũng như cho liên kết hydro yếu Ethyl acetate được dùng rộng rãi làm dung môi cho các phản ứng hóa học cũng như để thực hiện công việc chiết các hóa chất khác

1.2.3 Dung môi Ethanol

Ethanol là dung môi linh hoạt, có thể pha trộn với nước và các dung môi hữu cơ khác như acid acetic, acetone,… Các liên kết hydro làm cho ethanol nguyên chất có tính hút

ẩm Sự phân cực tự nhiên của nhóm chức hydroxyl làm cho ethanol có thể hòa tan một

số hợp chất ion Do phân tử ethanol có một đầu không phân cực, nó hòa tan các hợp chất không phân cực, gồm hầu hết tinh dầu và nhiều chất trong hương liệu, màu, và thuốc

1.3 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị

Nguyên liệu: Lá bạch đàn đã sấy khô và nghiền nhỏ

Hóa chất: Ethyl acetate, ethanol

Dụng cụ: Chén thủy tinh, bình tam giác, đĩa petri, phễu lọc, giấy lọc, bình hút ẩm Thiết bị: Cân điện tử, máy sóng siêu âm (công suất siêu âm với tần số 40kHz 240W),

tủ sấy

1.4 Phương pháp tiến hành

1.4.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Bước 1: Chuẩn bị lá bạch đàn khô đã nghiền nhỏ và chén thủy tinh đã sấy khô

Hình 1.1 Lá bạch đàn đã sấy khô và nghiền nhỏ

Bước 2: Cân khối lượng hai chén thủy tinh và ghi lại kết quả

Bước 3: Cân 2 g nguyên liệu lá bạch đàn cho vào chén thủy tinh có nắp đậy và ghi lại kết quả tương ứng với từng chén Khi cân cần đóng kín các mặt bên của cân điện tử tránh sai số

Hình 1.2 Cho mẫu vào chén thủy tinh có nắp

Bước 4: Đem các chén thủy tinh chứa nguyên liệu vào máy sấy ở 105 ºC trong khoảng

3 đến 4 giờ, đến khi khối lượng không thay đổi thì dừng sấy

Bước 5: Sau đó, để nguội trong bình hút ẩm khoảng 45 phút vì trong không khí có độ

ẩm nhất định nếu để nguyên liệu ngoài không khí thì nguyên liệu sẽ hút ẩm ngược lại Bước 6: Cân khối lượng các chén thủy tinh chứa nguyên liệu và ghi lại kết quả Bước 7: Dùng công thức để tính xác định độ ẩm của lá bạch đàn

1.4.2 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và các dụng cụ cần thiết đặt trên khay

Bước 2: Cân 1 g lá bạch đàn 2 lần và cho vào 2 bình tam giác, ghi lại kết quả cân Lưu ý, khi đổ tránh để nguyên liệu dính lên thành bình

Bước 3: Đong 15 ml dung môi ethyl acetate và 15 ml dung môi ethanol vào lần lượt hai bình tam giác chứa mẫu nguyên liệu, buộc kín miệng bình bằng nylon vì đây là các dung môi dễ bay hơi và sau đó lắc nhẹ Ghi lại tên hóa chất lên bình để phân biệt

Hình 1.3 Thêm dung môi vào nguyên liệu

Bước 4: Cho hai bình tam giác chứa mẫu vào bồn siêu âm trong 15 phút

Hình 1.4 Cho bình chứa hỗn hợp mẫu và dung môi vào bồn siêu âm

Bước 5: Cân khối lượng hai tờ giấy lọc trong 2 đĩa petri thủy tinh để tránh việc giấy lọc tiếp xúc không khí từ đó nó sẽ hút ẩm dẫn đến việc sai kết quả Đánh dấu kí hiệu 2

tờ giấy lọc để phân biệt với từng loại dung môi

Bước 6: Sau 15 phút siêu âm, lọc dịch chiết qua giấy lọc đã biết khối lượng Đối với lần đầu lọc cần đổ mẫu nhẹ nhàng tránh phần bã rơi vào giấy lọc

Hình 1.5 Lọc dịch chiết bằng dung môi

Bước 7: Tiếp tục thêm vào 15 ml dung môi ethyl acetate và 15 ml ethanol vào lần lượt hai bình đã đánh dấu như lần lọc đầu Đem vào bồn siêu âm chờ 15 phút

Hình 1.6 Thêm dung môi lần hai vào bình

Bước 8: Sau khi siêu âm xong, cho toàn bộ phần còn lại trong bình vào giấy lọc để tiến hành thu dịch chiết lần hai Lần này đổ cả phần bã lên giấy lọc để thu được khối lượng bã, nếu phần bã còn dính ở trong bình tam giác quá nhiều thì dùng phần dịch chiết thu được để rửa bình và cho lọc tiếp một lần nữa

Bước 9: Sau khi lọc xong, thu phần bã trên giấy lọc bằng cách gói lại cần thận không

để phần bã rơi ra ngoài, đặt hai gói giấy lọc lên đĩa petri và đánh dấu để phân biệt Bước 10: Cho đĩa vào máy sấy khoảng 3 đến 4 giờ, khi đặt đĩa vào tủ sấy thì mở hé nắp đĩa petri ra để nước có chỗ bay hơi, đến khi khối lượng không thay đổi thì dừng sấy Bước 11: Sau khi sấy xong đặt chúng vào bình hút ẩm, vì nếu không đặt trong bình hút ẩm thì giấy lọc và vật liệu mẫu tiếp tục hút ẩm ngược lại dẫn đến sai kết quả

Bước 11: Cân khối lượng của từng gói giấy lọc chứa mẫu đã sấy khô và ghi kết quả

1.5 Kết quả tính toán và giải thích

W: Độ ẩm nguyên liệu (%);

m0: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g);

m1: Khối lượng chén thủy tinh đã sấy khô (g);

m2: Khối lượng chén đựng nguyên liệu sau khi sấy khô (g)

Bảng 1.1 Kết quả độ ẩm trong nguyên liệu sau khi tính toán bằng công thức

Lần lặp lại Khối lượng

mẫu ban đầu

m 0 (g)

Khối lượng chén m 1 (g)

Khối lượng chén và mẫu đã sấy m 2 (g)

Độ ẩm W (%)

1.5.2.Tính toán hàm lượng chất chiết thô

Công thức tính hàm lượng chất chiết thô:

H (%) = 𝑚0×(100% − 𝑊)− (𝑚1− 𝑚2)

Trong đó:

H: Hiệu suất chiết cao của nguyên liệu (%);

W: Độ ẩm trung bình của nguyên liệu (%);

m0: khối lượng nguyên liệu khô ban đầu đã cân (g);

m1: khối lượng bã khô và giấy lọc sau khi sấy (g);

m2: khối lượng giấy lọc trước khi sấy (g)

Dựa vào các thông số đã có để tính hiệu suất chiết cho hai dung môi Ethyl acetate và Ethanol trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Kết quả hàm lượng chất chiết thô trong hai dung môi

Ethyl acetate Ethanol

Độ ẩm trung bình của nguyên liệu W (%) 7,0957

Khối lượng nguyên liệu ban đầu m 0 (g) 1,0186 1,0334

Khối lượng bã khô và giấy lọc sau khi sấy m 1 (g) 1,6309 1,5772

Khối lượng giấy lọc trước khi sấy m 2 (g) 0,7684 0,7624

Hiệu suất chiết H (%) 7,2144 15,1315

1.5.3 So sánh hiệu quả chiết của các dung môi khác nhau

Nhìn vào Bảng 1.2, ta có được hai hiệu suất chiết của dung môi ethyl acetate và ethanol lần lượt là 7,2144 % và 15,1315 % Dựa vào kết quả có thể xác định dung môi ethanol thích hợp hơn trong việc ly trích chất chiết thô từ lá bạch đàn hơn dung môi ethyl acetate Hiệu suất chiết của ethanol cao hơn vì nó ly trích được nhiều thành phần hoạt chất khác nhau của nguyên liệu

1.5.4 Giải thích kết quả chiết cao của hai dung môi

Lá bạch đàn có nhiều hoạt chất với độ phân cực khác nhau Hợp chất phân cực mạnh (Flavonoid và polyphenol) chứa nhiều nhóm hydroxyl (-OH), dễ tan trong nước và có

hoạt tính chống oxy hóa Hợp chất phân cực yếu (Eucalyptol) chứa oxy trong cấu trúc, nhưng không có nhóm -OH tự do, dễ tan trong dung môi hữu cơ hơn là nước Hợp chất

không phân cực (Các monoterpen khác như limonene và p-cymene) tan trong dung môi hữu cơ như dầu và ít tan trong nước Hiệu suất chiết của Ethanol cao hơn vì Ethanol có tính phân cực cao hơn Ethyl acetate và khả năng tạo liên kết hydrogen tốt, giúp hòa tan

các hợp chất phân cực và ít phân cực hoặc kém phân cực tốt hơn

So sánh màu sắc của dịch chiết có thể nhận thấy khi chiết bằng dung môi ethanol dịch chiết cho ra màu đậm và đục hơn so với dịch chiết từ dung môi ethyl acetate chứng tỏ ethanol chiết suất được nhiều hợp chất hơn Còn khi so sánh màu sắc của bã có thể thấy phần bã khi sử dụng dung môi ethanol có màu sắc nhạt hơn so với ethyl acetate vì hòa tan được nhiều hoạt chất hơn

Hình 1.7 Dịch chiết lá bạch đàn của hai dung môi sau khi lọc.

a)Dung môi Ethyl acetate, b) Dung môi Ethanol

Hình 1.8 Phần bã nguyên liệu đã chiết xuất bằng dung môi sau khi sấy

a)Dung môi Ethyl acetate, b) Dung môi Ethanol

a)

b)

Dung môi lỏng được bơm qua cột sắc ký, mang theo các thành phần của mẫu cần phân tích Pha tĩnh là chất hấp phụ rắn hoặc chất lỏng được cố định trong cột Các phân

tử trong mẫu sẽ tương tác với pha tĩnh với các mức độ khác nhau, dựa trên tính phân cực, kích thước và các đặc tính hóa học khác

Trong sắc ký cột sử dụng silica gel, các phân tử trong mẫu sẽ cạnh tranh để tương tác với các nhóm hydroxyl trên bề mặt silica gel Các phân tử phân cực sẽ tạo thành liên kết hydro với các nhóm hydroxyl, làm giảm tốc độ di chuyển của chúng qua cột Ngược lại, các phân tử không phân cực sẽ tương tác yếu hơn với silica gel và di chuyển nhanh hơn Vận tốc của sắc ký cột đề cập đến tốc độ di chuyển của pha động (dung môi) qua cột sắc ký và ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian lưu và hiệu quả phân tách của các chất trong mẫu

2.2.2 Cây sài đất

Sài đất, còn được gọi là húng trám hay cúc nháp, ngô núi, là loại cây thảo mọc hoang

quanh bờ bụi Tên khoa học đầy đủ của Sài đất là Sphagneticola calendulacea, họ Cúc

Cả thân và lá đều có màu xanh mặt trên phủ một lớp lông trắng mềm Hoa sài đất nhỏ, màu vàng tươi

Thành phần hoạt chất trong vài đất, chứa hàm lượng lớn flavonoid, caroten, phytosterol, muối vô cơ và tinh dầu vì thế, Sài đất mang khả năng giảm viêm, kháng khuẩn, lành tính, không độc Dịch ép từ cây sài đất có chứa hợp chất béo 29.7%, caroten 1.14%, nhựa 44.955, tanin, đường, saponin, pectin, lignin, solice, mucin, phytosterol 3.75%,… Lá cây còn chứa wedelolacton, muối vô cơ và tinh dầu

2.2 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị

Nguyên liệu: Bột lá sài đất đã được xay nhuyễn

Dụng cụ: Bình tam giác, ống đong, cốc thủy tinh, giấy lọc, silica gel (kích thước hạt

230 – 400 mesh), bông sợi thủy tinh, pipet, pipet pasteur, phễu thủy tinh, cột sắc ký Hóa chất: Dung môi hexane, hỗn hợp dung môi (hexane : aceton) có tỷ lệ lần lượt là

và đậy lại bằng nắp thủy tinh để tránh bay hơi

Bước 2: Cân 1 g bột lá sài đất cho vào bình tam giác sau đó thêm 10 ml dung môi (hexane: aceton) với tỷ lệ 8:2 vừa pha vào và đậy kín lại bằng miếng bịch nylon

Bước 3: Tiến hành đánh sóng siêu âm trong 5 phút sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc

để thu dịch chiếc sắc tố

Hình 2.3.1 Hỗn hợp nguyên liệu và dung môi sau khi đánh sóng siêu âm

Bước 4: Cân 0,5 g silica gel vào cốc thủy tinh sau đó thêm 3 mL dung dịch hexane ngâm trong 5 phút để làm giãn nở silica gel và đậy nắp thủy tinh lên để tránh trường hợp hóa chất hexane bị bay hơi

Bước 5: Nhồi bông thủy tinh vào cột, lấy bông thủy tinh với một lượng vừa đủ và hết sức cẩn thận để tránh bị xước tay để nhồi vào cột với mục đích là có thể giữ được silica

gel bên trong cột, không bị trôi xuống Sử dụng pipet pasteur làm cột và đựng trong một ống nghiệm nhỏ để hứng hexane, tiến hành nhồi bông thủy tinh xuống dưới bằng ống thủy tinh dài với một lực vừa phải (nếu nhồi chặt quá thì các hợp chất sẽ không đi xuống

để phân tách được, nếu nhồi lỏng quá thì silica gel sẽ bị chảy xuống và dấu hiệu nhận biết là ống nghiệm để hứng hexane có màu đục)

Bước 6: Sau khi nhồi bông thủy tinh thì tiến hành cho hỗn hợp chứa silica gel và hexane đã ngâm trước đó vào cột (cho nhiều lần, mỗi lần một ít và sau khi cho vào phải

gõ liên tục vào cột để đánh tan bọt khí có trong cột Ngoài ra còn phải tránh để cho cột

bị khô sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình chiết suất)

Bước 7: Đưa mẫu vào cột Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1 mm tiến hành cho mẫu vào quan sát Lưu ý khi cho mẫu vào thì nên cho từ thành ống nghiệm chảy xuống một cách tự nhiên, tránh bơm mạnh và bơm trực tiếp vào pha tĩnh sẽ làm xáo trộn bề mặt pha tĩnh

Bước 8: Tiến hành rửa giải, sau khi cho mẫu vào thì một lúc sau tiếp tục cho thêm dung môi (hexane : aceton) có tỉ lệ 8:2 vào làm ướt cột tránh trường hợp cột bị khô, giúp quá trình rửa giải được nhanh hơn và thu dịch chiết sắc tố carotenoid vào ống nghiệm Tiếp đó, tiến hành rửa giải bằng dung môi phân cực hơn là (hexane: aceton) với tỷ lệ 7:3

để rửa giải diệp lục tố chlorophyll và thu dịch chiếc sắc tố vào ống nghiệm, trong quá trình này lưu ý tránh để khô cột

Hình 2.3.2 Rửa giải sắc tố carotenoid