Kỹ thuật sắc ký nâng cao nhóm 3 st 3

Thí nghiệm : Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau .... Đặt vấn đề Sắc ký là một kỹ thuật phân tích và tách chiết mạnh mẽ dựa trên sự khác biệt về khả nă

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Thủ Đức, 19/11/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Lê Thị Bảo Ngân - 21126414 Nguyễn Đạt Tiến Khoa - 21126376

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hành 1

1.2.1 Thí nghiệm 1 1

1.2.2 Thí nghiệm 2 1

1.2.3 Thí nghiệm 3 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Bạch đàn 2

2.2 Lá ngũ sắc 2

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3

3.1 Vật liệu nghiên cứu 3

3.1.1 Hóa chất 3

3.1.2 Thiết bị 3

3.2 Phương pháp nghiên cứu 3

3.2.1 Thí nghiệm : Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 3

3.2.1.1 Ly trích chất chiết thô 3

3.2.1.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 3

3.2.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc kí cột 4

3.2.3 Thí nghiệm 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật TLC 4

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 5

4.1 Kết quả 5

4.1.1 Thí nghiệm 1 5

4.1.1.1 Ly trích chất chiết thô 5

4.1.1.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 6

4.1.2 Thí nghiệm 2 6

4.1.3 Thí nghiệm 3 7

4.1.3.1 Kết quả chạy TLC với tỷ lệ acetone: n-hexan (3:7) 7

4.1.3.2 Kết quả chạy TLC với tỷ lệ acetone: n-hexan (4:6) 8

4.1.4 Đường chuẩn 9

4.1.4.1 Đường chuẩn Protocatechuic acid 9

4.1.4.2 Đường chuẩn Chlorogenic acid 10

4.1.4.3 Đường chuẩn Caffeic acid 10

4.2 Thảo luận 10

4.2.1 Thí nghiệm 1 10

4.2.2 Thí nghiệm 2 11

4.2.3 Thí nghiệm 3 11

4.2.4.Nồng độ chất chuẩn 12

4.2.4.1 Chuẩn của Protocatechuic acid 12

4.2.4.2 Chuẩn của Chlorogenic acid 12

4.2.4.3.Chuẩn Caffeic acid 12

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 4.1 Khối lượng bã thu được sau khi sấy khô 5 Bảng 4.2 Hàm lượng chất chiết thô 5 Bảng 4.3 Khối lượng bột lá bạch đàn sau khi sấy khô 6 Bảng 4.4 Bảng kết quả quãng đường di chuyển của các chất sau khi chạy TLC với tỷ

lệ acetone: n-hexan (3:7) 7

Bảng 4.5 Bảng kết quả quãng đường di chuyển của các chất sau khi chạy TLC với

tỷ lệ acetone: n-hexan (4:6) 8

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Lá bạch đàn 2

Hình 4.1 Dịch chiết sau khi lọc 5

Hình 4.2 Cột sắc kí đã phân tách 7

Hình 4.3 Dung dịch thu được sau phân tách 7

Hình 4.4 Kết quả sau khi chạy TLC với tỷ lệ aceton/ n-hexan (3:7) 8

Hình 4.5 Kết quả sau khi chạy TLC với tỷ lệ aceton/ n-hexan (4:6) 9

Hình 4.6 Đường chuẩn diện tích peak của protocatechuric acid 9

Hình 4.7 Đường chuẩn diện tích peak của chlorohenic acid 10

Hình 4.8 Đường chuẩn diện tích peak của caffeic acid 10

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Sắc ký là một kỹ thuật phân tích và tách chiết mạnh mẽ dựa trên sự khác biệt về khả năng phân bố của các hợp chất trong hai pha: pha tĩnh và pha động Chất chiết thô

là hỗn hợp các chất hòa tan vào dung môi từ đó thu được hỗn hợp các chất khác nhau

Để biết được phần các chất trong hợp chất chiết thô thì hiện nay đã phát triển và sử dụng nhiều kỹ thuật phân tách khác nhau như chưng cất, sắc ký Với những ưu điểm đem lại kết quả phân tách tối ưu, kỹ thuật sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng đang là những lựa chọn hàng đầu để phân tích và tách chiết quan trọng với nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khoa học và đời sống Việc nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật sắc ký mới có hiệu quả cao hơn, thân thiện với môi trường hơn là một hướng đi quan trọng trong tương lai

1.2 Mục tiêu thực hành

1.2.1 Thí nghiệm 1

Đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng chất chiết thô

Đánh giá độ ẩm của nguyên liệu thông qua phương pháp sấy khô

1.2.2 Thí nghiệm 2

Phân tách được sắc tố thực vật kỹ thuật sắc ký cột

1.2.3 Thí nghiệm 3

Phân tách được sắc tố thực vật bằng kỹ thuật TLC

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bạch đàn

Cây bạch đàn hay còn gọi là khuynh diệp thuộc họ Myrtacease (Sim) Bạch đàn có

tên khoa học là Eucalyptus globulus Labill Cây cao to tới 10 m, cànnh non có 4 cạnh

Hai loại lá: Trên cây non hay cành non, lá mọc đối, gần như không cuống, phiến lá hình

trứng hoặc giống hình trái tim, sắc lục, mỏng, như có sáp, dài 10-15cm, rộng 4- 8cm

Trên cành cây già, lá mọc riêng biệt, so le, hình liềm, cuống ngắn, cong, phiến lá hẹp

dài 16 – 25 cm, rộng 2 – 5 cm, cành già tròn, không cạnh Phiến lá soi lên sáng thấy rõ

những điểm trong trong, đó là những túi tinh dầu Từ kẽ lá có những nụ hoa hình núm

oản ngửa, có 4 cạnh tương ứng với 4 lá đài Bạch đàn vốn quê ở châu Úc, nhưng từ lâu

bạch đàn được di thực vào nhiều nước trên thế giới từ châu Âu đến châu Á, châu Mỹ,

châu Phi Bạch đàn là một loại cây cho gỗ nhưng tại nước ta áp dụng trồng cây gây rừng,

làm xanh đồi trọc Ngoài ra bạch đàn còn có công dụng làm thuốc, tinh dầu

Hình 2.1 Lá bạch đàn 2.2 Lá ngũ sắc

Có tên khoa học là Ageratum conyzoides L Đây là loài cây thuộc học Cúc:

Asteraceae (Compositae) Ngũ Sắc là cây thảo mọc thẳng, phân nhánh, mềm, có mùi

thơm nhẹ, sống hàng năm, rễ mọc nông, dạng sợi Nó phát triển tới chiều cao khoảng

1m Thân và lá phủ đầy lông mịn màu trắng; lá hình trứng với đầu rộng ở gốc, dài tới

7,5cm Là mọc đối, màu xanh lục, mặt dưới nhạt màu hơn mặt trên Thành phần

Monoterpen và Sesquiterpen, Chromen, Chromon, Benzofuran và Coumarin

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Hóa chất

Bột lá bạch đàn

Bột lá ngũ sắc

Dung môi n - Hexan

Dung môi Aceton

Silica gel

3.1.2 Thiết bị

Thiết bị: Bồn siêu âm (Selecta), tủ sấy (Memmert, Đức), cân 4 số (Oha)

Dụng cụ: micropipet, đầu type, bình erlen, giấy lọc, bình hút ẩm, cốc thủy tinh, phiễu lọc, giấy lọc, ống đông 10 ml

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thí nghiệm : Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau

3.2.1.1 Ly trích chất chiết thô

Bước 1: Chuẩn bị 2 bình erlen cho 1g bột lá bạch đàn vào mỗi bình

Bước 2 : Lần lượt thêm 15 mL dung môi Hexan, Aceton vào bình thứ nhất và bình thứ hai Đem đi siêu âm trong 15 phút

Bước 3: Tiến hành lọc dịch chiết qua giấy lọc

Bước 4: Thêm tiếp dung môi Hexan vào bình thứ nhất và dung môi Aceton vào bình thứ 2 Tiếp tục siêu âm lần 2 trong 15 phút

Bước 5: Tiến hành lọc lấy dịch chiết qua giấy lọc lần thứ hai

Bước 6: Giữa lại phần bã và giấy lọc đem đi sấy khô trong tủ sấy

Bước 7: Sau khi sấy khô, cân khối lượng bã còn lại sau khi lọc

3.2.1.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Bước 1: Cân khối lượng 2 chén thủy tinh đã sấy khô và làm nguội trong bình hút

ẩm, ghi nhận số liệu

Bước 2: Cân 2 g bột lá bạch đàn cho vào mỗi chén

Bước 3: Đem sấy chén chứa mẫu ở 105° C cho đến khi khối lượng không đổi Bước 4: Để nguội trong bình hút ẩm và cân tổng khối lượng chén và mẫu

Bước 5: Tính độ ẩm của nguyên liệu

3.2.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc kí cột

Bước 1: Sử dụng pipet Pasteur làm cột, nhét 1 lớp bông dưới đáy pipet

Bước 2: Cân 0,75 g silica gel (kích thước hạt 230 – 400 mesh) vào cốc thủy tinh khô, thêm vào 2 mL hexan ngâm trong 5 – 10 phút (nhồi cột ướt)

Bước 3: Hỗn hợp được nạp vào pipet Pasteur, gõ nhẹ để không khí không bị giữ lại khi silica gel lắng xuống và toàn bộ silica gel dính trên thành cột sẽ rơi xuống Hoàn thành bước chuẩn bị cột

Bước 4: Khi pha động các bề mặt pha tĩnh 1 mm, thêm khoảng 1 mL hỗn hợp sắc

tố và cột dọc theo thành, tránh xao động bề mặt pha tĩnh

Bước 5: Tiếp tục cho pha động là n – hexane qua cột, tránh để cột khô

Bước 6: Sau đó để cho phép tốc độ nhỏ giọt khoảng 1 giọt mỗi giây

Bước 7: Thu nhóm carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước vào ống nghiệm Bước 8: Sử dụng dung môi phân cực hơn là 70% n-hexan + 30% aceton để rửa giải diệp lục tố

3.2.3 Thí nghiệm 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật TLC

Bước 1: Dùng bút chì đánh dấu vạch xuất phát trên tấm bản mỏng

Bước 2: Đưa dịch chiết lên bảng mỏng (5-15 µL)

Bước 3: Đưa bảng mỏng vào bình ly giải

Bước 4: Đánh dấu vạch kết thúc bằng bút chì

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Thí nghiệm 1

4.1.1.1 Ly trích chất chiết thô

Hình 4.1 Dịch chiết sau khi lọc (a) Dung môi Hexan;(b) Dung môi Acetone

Bảng 4.1 Khối lượng bã thu được sau khi sấy khô

Dung môi

Khối lượng (g)

Giấy lọc Nguyên liệu thô ban đầu Bã sau sấy

Thông qua quá trình lọc, sấy khô thu được kết quả

Trong đó:

m0 (g) là khối lượng nguyên liệu khô ban đầu;

m1 (g) là khối lượng bã còn lại trên giấy lọc

Bảng 4.2 Hàm lượng chất chiết thô

Dung môi Khối lượng bã sau sấy

(m1)

Hàm lượng chất chiết thô thu được

(H%)

a

b

4.1.1.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Độ ẩm nguyên liệu được xác định bằng công thức

𝑊(%) = (𝑚0+ 𝑚1 ) − 𝑚2

Trong đó:

m0 (g) là khối lượng mẫu thử trước khi sấy;

m1 (g) khối lượng chén trước khi sấy;

m2 (g) là khối lượng của mẫu và chén sau khi sấy

Bảng 4.3 Khối lượng bột lá bạch đàn sau khi sấy khô

Khối lượng Chén thủy tinh Nguyên liệu trước khi sấy Nguyên liệu sau sấy

Độ ẩm chén 1:

W(%) = (m0+ m1 ) − m2

=(2,0251 + 18,6550)– 20,5307

Độ ẩm chén 2:

𝑊(%) = (𝑚0+ 𝑚1 ) − 𝑚2

=(2,0072 + 17,9656)– 19,8146

4.1.2 Thí nghiệm 2

Hình 4.2 Cột sắc kí đã phân tách

Hình 4.3 Dung dịch thu được sau phân

tách

4.1.3 Thí nghiệm 3

4.1.3.1 Kết quả chạy TLC với tỷ lệ acetone: n-hexan (3:7)

Bảng 4.4 Bảng kết quả quãng đường di chuyển của các chất sau khi chạy TLC với tỷ

lệ acetone: n-hexan (3:7)

Hình 4.4 Kết quả sau khi chạy TLC với tỷ

lệ aceton/ n-hexan (3:7)

Kết quả tính toán hệ số lưu giữ Rf của các chất với dung môi acetone/ n-hexan (3:7) như sau:

Rf (Carotene) = 𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑎𝑛

𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑚ô𝑖= 4

4 = 1

Rf (Chlorophyll a) =𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑎𝑛

𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 = 2,4

4 = 0,6

Rf (Chlorophyll b) =𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑎𝑛

𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 = 2,2

4 = 0,55

4.1.3.2 Kết quả chạy TLC với tỷ lệ acetone: n-hexan (4:6)

Bảng 4.5 Bảng kết quả quãng đường di chuyển của các chất sau khi chạy TLC với tỷ

lệ acetone: n-hexan (4:6)

Hình 4.5 Kết quả sau khi chạy TLC với tỷ lệ

aceton/ n-hexan (4:6)

(4:6) như sau:

Rf (Carotene) = 𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑎𝑛

𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑚ô𝑖= 4

4 = 1

Rf (Chlorophyll a) =𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑎𝑛

𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 = 3

4 = 0,75

Rf (Chlorophyll b) =𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑎𝑛

𝑄𝑢ã𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 = 2,8

4 = 0,7

4.1.4 Đường chuẩn

4.1.4.1 Đường chuẩn Protocatechuic acid

Hình 4.6 Đường chuẩn diện tích peak của protocatechuric acid

4.1.4.2 Đường chuẩn Chlorogenic acid

Hình 4.7 Đường chuẩn diện tích peak của chlorohenic acid

4.1.4.3 Đường chuẩn Caffeic acid

Hình 4.8 Đường chuẩn diện tích peak của caffeic acid

4.2 Thảo luận

4.2.1 Thí nghiệm 1

Dịch chiết thu nhận khi sử dụng dung môi acetone và hexan cho thấy dịch chiết có

sự khác nhau về màu sắc Với dung môi acetone dịch chiết có màu đậm hơn so với dung môi hexan Cho thấy dung môi phân cực nguyên liệu bột bạch đàn là acetone và dung môi không phân cực là hexan

Hiệu suất chiết của dung môi acetone (25,714 %) cao hơn dung môi hexan (8,3532

%) Trong bột lá bạch đàn có các hợp chất phân cực chính Cineol (1,8cineole), Terpinen – 4- ol, α-Pinene nên khi sử dụng dung môi phân cực sẽ đạt hiệu suất chiết cao hơn, dịch chiết cũng đậm hơn dung môi hexan Một số ảnh hưởng khi thực hiện quá trình chiết như nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi

Độ ẩm thu nhận từ hai chén có sự chênh lệch nhiều khi cùng sử dụng chung một nguyên liệu Chứng tỏ mẫu nguyên liệu chưa được sấy khô hoàn toàn và chưa đều

4.2.2 Thí nghiệm 2

Mẫu lá ngũ sắc sau khi phân tách bằng sắc ký cột thu được carotenoid có màu vàng và diệp lục tố (chlorophyll) Dịch chiết lá ngũ sắc được pha động là dung môi n-hexan đưa vào pha tĩnh tại đây diễn ra sự phân tách nhờ vào lực tương tác của các chất đối với pha tĩnh Pha tĩnh là silica gel ở dạng tinh khiết là một chất trơ không có phân cực Tuy nhiên, khi được chiết xuất thành gel, nó được gắn thêm nhóm hydroxyl trong phân tử Vậy nên bề mặt của nó sẽ bị phân cực rất mạnh Những chất có độ phân cực mạnh sẽ tương tác mạnh với silica gel, đi chậm hơn và ngược lại ta thấy sắc tố carotenoid (vàng) được phân tách đầu tiên vì trong sắc tố carotenoid chứa thành phần β-carotene là một hợp chất không phân cực, chúng có ái lực thấp Carotenoid đi ra cột trước diệp lục tố chứng tỏ độ phân cực của Carotenoid kém hơn diệp lục tố (chlorophyll)

4.2.3 Thí nghiệm 3

có thể xác định được độ tương tác của các hợp chất và suy ra độ phân cực của chúng Nếu hệ số lưu giữ Rf càng cao thì chứng tỏ chất phân tích càng không phân cực dẫn đến việc chất phân tích tương tác yếu với pha tĩnh và tương tác mạnh với pha động nên không được giữ lại, di chuyển nhanh, và ngược lại Rf càng nhỏ thì chất phân tích càng phân cực và tương tác mạnh với pha tĩnh, tương tác yếu với pha động nên được giữ lại lâu, di chuyển chậm hơn so với những chất không phân cực Ở thí nghiệm này nhận thấy

Rf (Carotene) > Rf (Chlorophyll a) > Rf (Chlorophyll b) nên có thể suy ra độ phân cực của chất phân tích được sắp xếp Chlorophyll b > Chlorophyll a > Carotene Carotene chất phân cực kém, tương tác yếu với pha tĩnh và tương tác mạnh với pha động nên di chuyển nhanh

và cao hơn hai chất còn lại Đối với Chlorophyll a và Chlorophyll b là những chất phân cực nên tương tác mạnh với pha tĩnh và yếu với pha động nên di chuyển chậm và được

thể kết luận rằng Chlorophyll b phân cực nhất trong ba chất phân tách từ dịch chiết lá ngũ sắc

4.2.4.Nồng độ chất chuẩn

4.2.4.1 Chuẩn của Protocatechuic acid

Phương trình chuẩn ở phần 4.1.4.1 là y=14,372x – 2,2918

Thay y là diện tích peak trong sắc ký đồ

Ta có 𝑥 = 68,7499+2,2918

14,372 ≈ 4,94 (mg/L)

4.2.4.2 Chuẩn của Chlorogenic acid

Phương trình chuẩn ở phần 4.1.4.2 là: y= 40,015x – 9,7092

Thay y là diện tích peak trong sắc ký đồ

Ta có 𝑥 =578,0308+9,7092

40,015 ≈14,69 (mg/L)

4.2.4.3.Chuẩn Caffeic acid

Phương trình chuẩn ở phần 4.1.4.3 là: y = 21,456x – 4,1538

Thay y là diện tích peak trong sắc ký đồ

𝑥 =53,8372+4,1538

21,456 ≈ 2,70 (mg/L)